Strukturelle und kinetische Untersuchungen zum Mechanismus und Vorhersage der stereoselektiven Substraterkennung von Lipasen

Volltext

(1)Strukturelle und kinetische Untersuchungen zum Mechanismus und Vorhersage der stereoselektiven Substraterkennung von Lipasen. Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.). dem Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität zu Marburg. vorgelegt von. Marco Bocola aus Lübeck. Marburg/Lahn 2002 I.

(2) Vom Fachbereich Pharmazie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am 12.2.2002 angenommen. Tag der mündlichen Prüfung: 12.2.2002 Erstgutachter:. Prof. Dr. G. Klebe. Zweitgutachter:. PD Dr. B. Hauer II.

(3) Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden von November 1997 bis Februar 2002 am Institut für pharmazeutische Chemie und Biochemie der Philipps-Universität in Marburg / Lahn unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. G. Klebe durchgeführt.. III.

(4) Für Denise. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. G. Klebe und Dr. Bernhard Hauer (BASF AG) für die sehr interessante Aufgabenstellung.. Herrn Dr. T. Friedrich, Andreas Schädler und Volker Wengert sowie Dr. Markus Matuschek und Silvia Volkmer-Adamy danke ich für die Ermöglichung der fruchtbaren Aufenthalte und die Unterstützung bei der Fermentation und Reinigung der Lipasen in Ludwigshafen bei der BASF AG.. Herrn Dr. M. T. Stubbs, Dr. Ulrich Graedler und Dr. Andreas Bergner danke ich für Hinweise zum kristallographischen Hintergrund der Arbeit und die anregenden, kritischen Diskussionen.. Herrn Dr. Christoph Sotriffer danke ich für die Einführung und die kritischen Hinweise zur Durchführung und Auswertung der Molekulardynamischen Simulationen und der Konformationssuche.. Ich danke allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Klebe für die stetige Diskussionsbereitschaft sowie freundliche Unterstützung und allzeit laufende Computer während dieser Arbeit. Insbesondere allen, die durch gutes Arbeitsklima dazu beigetragen haben, auch die Klippen der Forschung zu umschiffen ohne die Motivation zu verlieren. IV.

(5) The World Is Made Up Of The Wills, The Won'ts, And The Cant's: The Wills Do Everything, The Won'ts Do Nothing, The Can'ts Can't Do Anything.. From Walt Disney's "Black Hole". But Be Aware Of The Coulds The Coulds Could Model Everything. From Marco's "Moloc Md-Movie". V.

(6) Inhaltsverzeichnis : 1. Einführung........................................................................................................................... 1 1.1. Einleitung ................................................................................................................................................ 1. 1.2. Motivation ............................................................................................................................................... 3. 2. Biologisches System............................................................................................................ 4 2.1. Eigenschaften von Lipasen...................................................................................................................... 4. 2.2. Vorkommen von Lipasen ........................................................................................................................ 5. 2.2.1 Lipasebildende Bakterien ................................................................................................................ 5 2.2.1.1 Lipasen gram-negativer Bakterien .............................................................................................. 7 2.2.1.2 Lipasen gram-positiver Bakterien ............................................................................................... 7 2.3. Reinigung von Lipasen ........................................................................................................................... 7. 2.4. Enzymmechanismus von Lipasen ........................................................................................................... 8. 2.4.1 2.5. Enzymkinetik ........................................................................................................................................ 11. 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.4 2.5.5 2.6. Kinetischer Enzymmechanismus von Lipasen .............................................................................. 13 Burst-Kinetik................................................................................................................................. 14 Grenzflächenaktivierung ............................................................................................................... 15 Aktivitätsbestimmungen................................................................................................................ 17 Inhibition von Lipasen .................................................................................................................. 19. Struktur von Lipasen ............................................................................................................................. 20. 2.6.1 2.6.2 2.6.3. 3. Reaktionsmechanismus einer lipasekatalysierten Reaktion ............................................................ 8. Gemeinsame Raumstruktur der a/bHydrolasen ............................................................................ 20 Offene und geschlossene Raumstrukturen von Lipasen................................................................ 21 Lipasen mit bekannter Raumstruktur ............................................................................................ 23. Kenntnisstand über den Einsatz von Lipasen .................................................................... 24 3.1. Pharmazeutische und industrielle Einsatzmöglichkeiten von Lipasen .................................................. 24. 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.2. Waschmittel................................................................................................................................... 24 Nahrungsmittel- und Kosmetikindustrie ....................................................................................... 24 Esterifikation und Interesterifikation............................................................................................. 25. Selektivität ............................................................................................................................................ 25. 3.2.1 Stereospezifische Katalysen .......................................................................................................... 26 3.2.1.1 Kinetische Racematspaltung ..................................................................................................... 26 3.2.1.2 Stereospezifität für sekundäre Alkohole ................................................................................... 29 3.3. Computergestützte Vorhersage der Enantioselektivität ........................................................................ 31. 3.4. Mutagenese von Lipasen....................................................................................................................... 33. 3.4.1 3.4.2. Gerichtete Mutagenese.................................................................................................................. 33 Ungerichtete Mutagenese .............................................................................................................. 34. VI.

(7) 4. Material und Methoden ..................................................................................................... 36 4.1. Röntgenstrukturanalyse......................................................................................................................... 36. 4.1.1 Aufnahme von Röntgendaten........................................................................................................ 37 4.1.2 Erzeugung von Röntgenstrahlen ................................................................................................... 37 4.1.2.1 Röntgengenerator ...................................................................................................................... 37 4.1.2.2 Synchrotonstrahlung.................................................................................................................. 38 4.1.3 Proteinkristallisation...................................................................................................................... 39 4.1.3.1 Candida antarctica Lipase B .................................................................................................... 39 4.1.3.2 Bugkholderia plantarii Lipase................................................................................................... 39 4.1.4 Auswertung der Röntgendaten ..................................................................................................... 40 4.1.5 Strukturbestimmung von kleinen organischen Molekülen ............................................................ 41 4.1.5.1 Datensammlung ........................................................................................................................ 41 4.1.5.1 Strukturlösung ........................................................................................................................... 41 4.2. Proteinreinigung.................................................................................................................................... 42. 4.2.1 Candida antarctica Lipase B ........................................................................................................ 42 4.2.2 Burkholderia plantarii Lipase ....................................................................................................... 42 4.2.2.1 Wildtyp und Produktionsstamm ................................................................................................ 42 4.2.2.2 Rekombinante Lipase ................................................................................................................ 43 4.2.2.3 Chromatofokussierung .............................................................................................................. 44 4.2.2.4 Metall-Chelat-Chromatographie ............................................................................................... 44 4.3. Aktivitätsbestimmung und Inhibition.................................................................................................... 45. 4.3.1 Tributerintest ................................................................................................................................. 45 4.3.2 Photometrisches Essay .................................................................................................................. 45 4.3.3 Synthese der Inhibitoren................................................................................................................ 46 4.3.3.1 Synthese der Phosphonamide.................................................................................................... 46 4.3.3.2 Synthese der Phosphonester ...................................................................................................... 47 4.4. Bestimmung der Proteinkonzentration ................................................................................................. 48. 4.4.1 4.4.2 4.5. Transiente Kinetik mittels Stopped-Flow-Spektrofluorometrie ........................................................... 48. 4.5.1 4.5.2 4.6. Aufbau des Messsystems .............................................................................................................. 48 Reaktionsbedingungen .................................................................................................................. 49. Sodiumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektro phorese (SDS-PAGE).......................................... 51. 4.6.1 4.6.2 4.6.3 4.7. Absorption bei 280 nm.................................................................................................................. 48 BCA-Mikrotiterplatten-Test.......................................................................................................... 48. Puffer für SDS-PAGE ................................................................................................................... 51 Molekulargewichtsmarker............................................................................................................. 52 Coomassie-Färbung....................................................................................................................... 52. Deglycosilierung ................................................................................................................................... 52. 4.7.1 4.7.2. N-Glycosidase F............................................................................................................................ 52 Endoglycosidase H........................................................................................................................ 53. 4.8. MALDI-TOF Massenspektrometrie...................................................................................................... 53. 4.9. Konformationsanalyse........................................................................................................................... 54. 4.9.1 4.9.2 4.10. Systematische Suche ..................................................................................................................... 54 Docking mit FLEXX..................................................................................................................... 54. Molekulardynamische. Simulationen .................................................................................................. 55. 4.10.1 Grundlagen.................................................................................................................................... 55 4.10.2 Kraftfelder ..................................................................................................................................... 56 4.10.3 Durchführung von Simulationen ................................................................................................... 57 4.10.3.1 Simulation mit MOLOC und MAB ............................................................................................ 57 4.10.4 Auswertung von MD-Simulationen .............................................................................................. 57 4.11. Homologiemodellierung........................................................................................................................ 58 VII.

(8) 5. Ergebnisse Teil I Candida antarctica Lipase B ................................................................ 59 5.1.. Proteinreinigung und Charakterisierung ............................................................................................... 59. 5.2. Enzymkinetik ........................................................................................................................................ 62. 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.3. Kinetische Racematspal-tung von Phenylethyl-amin mit CaL B .......................................................... 65. 5.3.1 5.4. Temperaturabhängigkeit der kinetischen Racematspaltung .......................................................... 65. Kovalente Inhibition von Lipasen ......................................................................................................... 67. 5.4.1 5.4.2 5.5. Michaelis-Menten-Kinetik ............................................................................................................ 62 Lösungsmittelabhängigkeit ........................................................................................................... 62 Aktivierung von Lipasen durch Detergenzien............................................................................... 63 Burst-Kinetik................................................................................................................................. 64. Inhibition von CaL B..................................................................................................................... 67 Nachweis der Inhibition von CaL B durch MALDI-TOF MS ..................................................... 68. Kristallstrukturen................................................................................................................................... 71. 5.5.1 Struktur der Phenylethylamid-Inhibitoren..................................................................................... 71 5.5.1.1 Struktur des RpSc-Phenylethylamid-Inhibitor ........................................................................... 71 5.5.1.2 Struktur des SpSc -Phenylethylamid-Inhibitor ........................................................................... 72 5.5.2 Kristallstruktur der CaL B............................................................................................................. 74 5.5.2.1 Apo-Struktur CaL B .................................................................................................................. 74 5.5.2.2 Komplex von SpRc-Phenylethylamid-Inhibitor mit CaL B ....................................................... 76 5.5.2.4 Komplex von SpSc -Phenylethylamid-Inbibitor mit CaL B ....................................................... 79 5.6.1 Kraftfeldrechnungen...................................................................................................................... 82 5.6.2 Systematische Suche ..................................................................................................................... 83 5.6.3 Docking mit FLEXX ....................................................................................................................... 85 5.7. Molekulardynamische Simulationen .................................................................................................... 87. 5.7.1 5.7.2 5.7.3. 6. Michaelis-Komplex....................................................................................................................... 87 Acyl-Enzym und Amin ................................................................................................................. 89 Tetraedrisches Intermediat ............................................................................................................ 90. Diskussion und Ausblick Candida Antarctica Lip B ........................................................ 92 6.1. Reinigung und Kristallisation................................................................................................................ 92. 6.2. Untersuchungen zum Katalysemechanismus ........................................................................................ 94. 6.3. Komplex-Strukturen mit enantiomerenreinen Inhibitoren ................................................................... 98. 6.4. Computergestütze Konformationssuche und MD-Simulationen......................................................... 101. 6.5. Ausblick .............................................................................................................................................. 102. VIII.

(9) 7. Ergebnisse Teil II Burkholderia plantarii Lipase ........................................................... 103 7.1.. Proteinreinigung und Charakterisierung der BpL .............................................................................. 103. 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.2. BASF Produktionsstamm ............................................................................................................ 103 Wildtyp........................................................................................................................................ 109 Rekombinante Bpl-Mutante F142W .......................................................................................... 113. Enzymkinetik ...................................................................................................................................... 115. 7.2.1 5.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5. Michaelis-Menten-Kinetik .......................................................................................................... 115 Lösungsmittelabhängigkeit ......................................................................................................... 115 Aktivierung durch Detergenzien ................................................................................................. 115 Burst-Kinetik............................................................................................................................... 116 Fluoreszenzuntersuchung der BpL F142W ................................................................................. 116. 7.3. Kovalente Inhibition von BpL............................................................................................................. 117. 7.4. Röntgenstruktur der BpL Mutante F142W ........................................................................................ 118. 7.4.1 7.5. Homologiemodellierung...................................................................................................................... 120. 7.5.1 7.5.2 7.5.3 7.6. Burkholderia plantarii Lipase F142W ........................................................................................ 118 Homologiemodellierung mit MODELLER 4.............................................................................. 122 Manuelle Homologie-Modellierung............................................................................................ 122 Homologiemodellierung mit MODELLER 6.............................................................................. 122. Strukturbasierte fokussierte Mutagenese von BpL.............................................................................. 123. 7.6.1 Rationale Auswahl relevanter Aminosäuren ............................................................................... 123 7.6.2 Auswahlstrategie für substratspezifisch fokussierte Mutationen ................................................ 126 7.6.2.1 Mutanten zur Aktivitätssteigerung gegenüber Phenylessigsäure-Estern ................................. 127 7.6.2.2 Mutanten zur Enantiomerentrennung von Methoxycyclohexanol .......................................... 130. 8. 9. Diskussion und Ausblick Burkholderia plantarii Lipase ................................................ 131 8.1. Reinigung und Kristallisation.............................................................................................................. 131. 8.2. Kinetik und Inhibition ......................................................................................................................... 134. 8.3.. Struktur und Homologiemodellierung................................................................................................. 135. 8.4.. Strukturbasierte Vorhersage von Mutanten......................................................................................... 136. 8. 5. Ausblick .............................................................................................................................................. 138. Zusammenfassung ........................................................................................................... 140. Anhang A Literaturverzeichnis ............................................................................................ 143 Anhang B Abkürzungsverzeichnis....................................................................................... 152. IX.

(10) Kapitel 1. 1. Einführung und Motivation. tationsanalysen mit anschliessender Aktivitäts-. EINFÜHRUNG. und Stabilitätsuntersuchung.. 1.1. Einleitung. Durch die wachsende Zahl von Röntgenstruktu-. Enzyme sind als Biokatalysatoren für die meis-. ren homologer Enzyme ist auch ein strukturel-. ten biochemischen Umsetzungen im Organis-. ler Vergleich möglich geworden. Diese Studien. mus verantwortlich. Damit ist es möglich, bio-. führen zum Auffinden der essentiellen Amino-. organische Reaktionen im physiologischen. säuren für die Stabilität eines Faltungsmusters. Medium bei niedriger Temperatur durchzufüh-. bzw. die katalytische Funktion im aktiven Zent-. ren. Sie sind chirale Polypeptide aus stereo-. rum. In vielen Fällen kann sogar ein Einblick in. chemisch einheitlichen L-Aminosäuren und. die molekularen Mechanismen der Evolution. daher prinzipiell in der Lage, Reaktionen ste-. gewonnen werden und eine Basis für das Ver-. reoselektiv zu katalysieren.. ständnis der Substratspezifität und ProduktSelektivität unterschiedlicher Enzyme innerhalb. Jeder Organismus hat im Verlauf der Evolution. einer Enzymklasse, wie z. B. den Serin-. einen perfekt an seine Lebensbedingungen an-. hydrolasen, gewonnen werden.. gepassten Satz von Proteinen entwickelt (Proteom). Vergleicht man Enzyme gleicher Funktion. Aufgrund ihrer herausragenden Fähigkeiten als. aus verschiedenen Organismen, so gibt es viele. Katalysatoren und dem zunehmenden Ver-. in der Aminosäuresequenz mehr oder weniger. ständnis über die beschleunigten molekularen. stark abweichende, aus einem gemeinsamen. Elementarschritte haben Enzyme in der präpa-. Vorläufer entstandene (homologe) Enzyme. Die. rativen organischen Chemie zunehmend an. unterschiedliche Spezifität und Aktivität dieser. Bedeutung gewonnen (Liese & Filho, 1999;. Enzyme spiegelt die Anpassung an die Umge-. Schmid et al., 2001).. bung und den speziellen Metabolismus des. Erste Bestrebungen, diese herausragenden Fä-. jeweiligen Organismus auf Aminosäureebene. higkeiten in der Biokatalyse einzusetzen, wur-. wider.. den Anfang der 1980er Jahre unternommen.. Viele Untersuchungen zur Struktur-Aktivitäts-. Seitdem ist die Zahl der Veröffentlichungen. Beziehung homologer Enzyme haben zum Ver-. stark angestiegen und die Zahl der Publikatio-. ständnis der Grundprinzipien beigetragen, wie. nen entwickelt sich nahezu exponentiell, wie in. die Natur ein Enzym auf sein Substrat ab-. Abbildung 1.1 anhand der in der MEDLINE. stimmt.. abgelegten Literaturstellen exemplarisch dargestellt ist.. In jüngerer Zeit werden diese Vergleiche durch Mutationsstudien ergänzt, wie z. B. das sukzes-. Die Steigerung der Selektivität bei der Produkt-. sive Ersetzen aller Aminosäuren durch Alanin. bildung großtechnisch angewandter, organi-. (Alanin-Scan) oder einzelne zielgerichtete Mu-. scher Reaktionen ist ein wichtiges Forschungs1.

(11) Kapitel 1. Einführung und Motivation. ziel in der modernen organischen Synthese. Im. rum gegenüber nicht natürlichen Substraten, sie. Rahmen der stereoselektiven Synthese haben. sind nicht auf die Spaltung von Triglyceriden in. sich Enzyme als chemo-, regio- und enantiose-. wässrigen Medium beschränkt, sondern sind. lektive Katalysatoren in den vergangenen zehn. auch in organische Lösungsmitteln aktiv.. Jahren vielfach bewährt. Moderne Verfahren setzen zunehmend immobiEnzymatische geführte Reaktionen erfüllen den. liserte Lipasen als heterogene Katalysatoren. Anspruch, ökologisch vorteilhafte Katalysato-. ein. Dies verbessert ihre Applikation, die Stabi-. ren einzusetzen (grüne Chemie). Die Reaktio-. lität der Enzyme und vereinfacht die Aufarbei-. nen können selektiv und bei niedrigen Tempe-. tung der Produkte.. raturen durchgeführt werden. Industrielle Enzym e. Ihr weltweiter Einsatz in der chemischen Syn-. ganze Zellen. Oxidoreduktasen. Lipasen. these hat 1995 die Grenze von 1 MilliarOxygenasen. de US Dollar überschritten (Jaeger & Reetz, 1998). Eine herausragende Rolle spielen dabei Lyasen. Esterasen. Hydrolasen (65 %) und Oxidoreduktasen (25 div. Hydrolasen. %) (Theil, 1997), wobei der Enzymklasse der. Nitrilasen. Proteasen. Lipasen die größte Bedeutung innerhalb der Abb. 1.2 : Häufigkeit des Einsatzes verschiedener Enzyme in Biotransformationen entnommen aus (Faber 1997). Hydrolasen zukommt, wie im Abbildung 1.2 veranschaulicht ist (Faber, 1997).. Viele Lipasen aus Bakterien und Pilzen sind. Biokatalyse. kommerziell erhältlich und werden in großen. Publikationen pro Jahr in der MEDLINE. 1000. Mengen, bis zu einhundert Tonnen jährlich, in. 900. der Leben- und Waschmittelherstellung zur. 800 700. Fettspaltung bei niedrigen Temperaturen einge-. 600 500. setzt. Heute befinden sich in nahezu allen. 400. Waschmitteln rekombinante, durch Mutagenese. 300 200. auf die Anforderungen in der Waschflotte op-. 100 0 1980. 1982. 1984. 1986. 1988. 1990. 1992. 1994. 1996. 1998. timierte Lipasen.. 2000. Abb. 1.1: Jährliche Publikationen zum Thema Biokatalyse, Biotransformation und Biotechnologie in der MEDLINE (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Neuere Anwendungen im Tonnenmaßstab wurden. in. der. Esterifikation. von. Biodiesel. (Shimada et al., 1999) und in der Papier-. Lipasen sind Serinhydrolasen, die in der Lage. industrie bei der Entfernung von Triglyceriden. sind, langkettige Fettsäureester regio- und ste-. aus Zellulose gefunden (Nihon Seishi Co, Ja-. reospezifisch zu spalten. Gleichzeitig haben. pan).. einige Lipasen ein relativ weites Substratspekt2.

(12) Kapitel 1. Einführung und Motivation. Besonders in der Synthese von enantiomeren-. gewünschten Eigenschaft zunehmende Bedeu-. reinen Wirkstoffen und deren Vorstufen ist die. tung erlangt (Jaeger & Reetz, 2000).. kinetische Racematspaltung mit Hilfe von LipaDie kombinatorischen Möglichkeiten, ein En-. sen ein beliebtes Werkzeug in der präperativen. zym zufällig zu verändern, sind jedoch nahezu. Chemie, da auch heute noch die Mehrzahl aller. unendlich groß. Daher ist es wünschenswert,. Pharmaka und Agrochemikalien, die ein oder. mit den Methoden der Enzymkinetik und der. mehrere stereogene Zentren enthalten, als Ra-. Strukturaufklärung. cemate oder Stereoisomerengemische verkauft. erkenntnisgetrieben. be-. stimmte Bereiche im Enzym systematisch oder. werden (Winkler, 1995).. auch zufällig zu verändern, um so ein stärker Die Optimierung einer enzymatischen Synthese. gerichtetes Anpassen des Enzym auf eine spe-. eines nicht natürlichen Substrats erfordert je-. zielle Anforderung zu ermöglichen (Cedrone,. doch ein breites Screening nach dem jeweils. Menez & Quemeneur, 2000).. geeigneten Biokatalysator für die gewünschte. 1.2. Reaktion und die Suche nach den besten Reak-. Motivation. tionsbedingungen. Dieser Prozess ist zum heuZiel dieser Arbeit ist es, Lipasen aus verschie-. tigen Zeitpunkt der arbeitsintensivste Schritt bei. denen bakteriellen und eukariotischen Orga-. der geplanten Einführung enzymatischer Me-. nismen aufzureinigen, zu kristallisieren und mit. thoden in die chemische Synthese.. Hilfe der Röntgenstrukturanalyse Lipasen im Um eine wissensbasierte Optimierung eines. Komplex mit enantiomerenreinen, kovalent. Prozesses zu erreichen, steht daher das Ver-. gebundenen Übergangszustandsanaloga aufzu-. ständnis der verschiedenen Einflussgrößen wie. klären und mit enzymkinetischen Methoden den. Enzymstruktur, Lösungsmittel und Immobili-. Enzymmechanismus und die Enantioselektivität. sierung auf die Stereoselektivität und Reak-. der kinetischen Racematspaltung mit Lipasen. tivität im Mittelpunkt des Interesses.Eine Hoff-. besser zu verstehen. Mit Hilfe von molekular-. nung für die Zukunft ist es, dass die Suche nach. dynamischen Kraftfeldrechnungen,die sich an. einer geeigneten Lipase für ein nicht natürliches. Schnitten entlang des Enzymmechnaismus’. Substrat durch das gezielte Maßschneidern. orientieren wurden Abschätzungen über den. einer rekombinanten Lipase auf die vorgegebe-. entropischen und enthalpischen Anteil der chi-. ne Reaktion erfolgen kann (Svendsen, 2000).. ralen Diskriminierungen zu erhalten.. Gezielte Veränderungen eines Enzyms setzen. Mit Hilfe dieses grundlegenen Verständnisses. ein detailliertes Wissen über den Mechanismus. wurde dann eine gezielte Strategie zur Anpas-. der Enzymkatalyse und über die Substratspezi-. sung einer Lipase an ein nicht natürliches Sub-. fität voraus. Daher hat die ungerichtete Zu-. strat entwickelt.. fallsmutagenese mit anschliessendem Screening mit Hilfe von Hochdurchsatzmethoden nach der 3.

(13) Kapitel 2. 2.. Biologisches System. brückennetz verbunden sind. Sie binden keine. BIOLOGISCHES SYSTEM. Cofaktoren, benötigen aber zur ihrer Aktivie-. 2.1. rung eine Wechselwirkung mit einer hydro-. Eigenschaften von. phoben Oberfläche oder im Falle der Pan-. Lipasen. creaslipasen zusätzlich zur Gallensäure die Bindung einer Colipase.. Lipasen sind Triacylglycerol-Hydrolasen (EC 3.1.1.3) und kommen als zelluläre und extra-. In der Gruppe der Serin-Hydrolasen, zu der. zelluläre Enzyme in allen Zelltypen und Orga-. auch die Lipasen gerechnet werden, tritt eine. nismen vor. Sie sind essentieller Bestandteil des. hochkonservierte Sequenz aus fünf Amino-. Fettstoffwechsels. Ihre natürlichen Substrate. säuren (G-X-S-X-G) auf. Dabei handelt es sich. sind langkettige Triacylglyceride, die neben den. um einen Teil des aktiven Zentrums, um das. Kohlenhydraten zu den wichtigsten Speicher-. katalytische Serin. Diese Serin-Hydrolasen. stoffen in der Natur zählen.. bilden eine Gruppe von Enzymen mit ähnlicher. Hefen können beispielsweise bis zu 80 % ihrer. Struktur; sie nehmen den sogenannten „a/b-. Trockenmasse als Fette enthalten (Candida. Hydrolase-Fold“ an (Ollis et al., 1992;. spec., Rhodotorula spec.), in pflanzlichen Sa-. Schrag & Cygler, 1997).. men sind es bis zu 70 %. Bakterien können Lipide im umgebenden Medium nur als Kohlenstoffquelle nutzen, indem sie Lipasen sekretieren. Ihre physiologische Bedeutung besteht in der Bereitstellung von freien Fettsäuren aus dem umgebenden Medium der Zelle. Triglyceride selbst können nicht durch die Zellmembran aus dem Medium aufgenommen, bzw. aus dem Darm resorbiert werden. In der Natur wirken Lipasen an der Grenzfläche zwischen Wasser und Fett oder direkt an der Oberfläche einer Micelle. Der Katalysemechanismus der Carbonesterspaltung ist analog wie in der Enzymklasse der Serinproteinasen. Er benötigt eine katalytische Triade, bestehend aus einem Serin, Histidin und einer Asparagin- oder seltener einer Glutaminsäure, die untereinander durch ein Wasserstoff4.

(14) Kapitel 2. Biologisches System. fidbrücken zur Stabilisierung der Lipase gebil-. 2.2 VORKOMMEN VON LIPASEN. det.. 2.2.1 Lipasebildende Bakterien Die Erkennung des Lipase-Foldase-Komplexes Unter den Bakterien gibt es zahlreiche Lipase-. ist essentiell für die anschliessende Sekretion. bildner. Genauer bekannt sind die Lipasen der. der Lipase (Akrim et al., 1993) (Martinez,. Gattungen Pseudomonas, Bacillus und Staphy-. Ostrovsky & Nunn, 1999) durch das Xcp-. lococcus (Jaeger et al., 1994).. Transportersystem (zwölf Proteine).. Bakterielle Lipasen werden nur bei der Anwe-. Die Foldase Lip B verbleibt im periplasmati-. senheit von Fetten als alleinige Nahrungsquelle. schen Raum und kann das nächste Lipasemole-. gebildet. Sie werden in einer inaktiven Vorläu-. kül falten und transportieren. Dieses hochspezi-. ferform (Proenzym) in der Zelle aus dem Gen. fische System besteht aus insgesamt 27 Protei-. lip A synthetisiert und dann in ihrer aktiven. nen und sekretiert noch weitere Proteine wie die. Form in das umgebende Medium in einem. alkalische Phosphatase, Phospholipase C, E-. mehrstufigen Typ-II-Secretin-Prozess abgege-. lastase und Exotoxin A. Viele sekretierten Pro-. ben (Lazdunski et al., 1990). Das Lipasegen. teine sind als Virulenzfaktoren an der Pathoge-. lip A bildet zusammen mit einem weiteren Gen. nese von Bakterien aus der Familie der Pseu-. lip B, einer lipasespezifischen Foldase, ein O-. domonaden beteiligt. Reguliert wird die Sekre-. peron. Die Transkription wird über die Anwe-. tion über das sogenannte "quorum sensing".. senheit von langkettigen Fettsäureresten im. Das bedeutet, die Zelle reagiert auf die Anwe-. Medium reguliert (Rosenau & Jaeger, 2000).. senheit bestimmter chemischer Signalstoffe, wie z. B. auf N-Acyl-homoserin-Lactone und. Es wird angenommen, dass die Prolipase aus. kann so im gesamten Zellverband synchron die. der Zelle ungefaltet durch das Translokations-. Sekretine und Pilus-Gene aktivieren (Riedel et. system Sec, bestehend aus sieben Proteinen, in. al., 2001).. das Periplasma transportiert wird (Abbildung 2.1). Dabei wird das Propetid mit der transport-. Zur technischen Produktion großer Mengen der. spezifischen Erkennungssequenz abgespalten.. Lipasen als Biokatalysator ist es daher wün-. Die prozessierte Lipase kann dann mit Hilfe. schenswert, sie in weniger pathogenen Sys-. eines lipasespezifischen Chaperons (LipB) kor-. temen zu exprimieren. Die heterologe Expres-. rekt gefaltet werden (Frenken et al., 1993b).. sion von intrazellulär korrekt gefalteten Lipasen. Diese Foldase ist in der inneren Zellmembran. in E.coli gelang jedoch nur in Anwesenheit der. verankert und bringt die gefaltete Lipase im. Foldase LipB in Verhältnis eins zu eins. Periplasma zunächst in Kontakt mit dem Multi-. (Frenken et al., 1993a).. enzymkomplex Dsb (sieben Proteine), einer Disulfid-Reduktase. Dort werden die Disul-. 5.

(15) Kapitel 2. Biologisches System. Wie kürzlich gezeigt werden konnte, scheinen. Die in dieser Arbeit untersuchte Lipase aus. Coexpressionen mit Thioredoxin möglicherwei-. Pseudomonas glumae (auch Burkholderia plan-. se einen Ausweg zu bieten (Tang et al., 2000).. tarii) weist eine große Homologie von 84% und. Aufgrund der Toxizität der aktiven Lipase in. eine Strukturähnlichkeit mit der Lipase von Ps.. der Zelle konnten bisher nur geringe Ausbeuten. cepacia auf.. erzielt werden. Die Expression in EinschlussAus den gram-positiven Organismen wurden. körpern erfordert hingegen eine aufwendige. vor allem die Staphylococcus- und Bacillus-. Rückfaltung in vitro. Ausreichende Expressi-. Arten am besten untersucht. Wie im nächsten. onsergebnisse wurden durch die hohe Spezifität. Kapitel beschrieben, unterscheiden sich die. des Sekretionssystems bisher nur in homologen. Lipasen gram-negativer und gram-positiver. Systemen erreicht.. Stämme deutlich voneinander. Molekulargenetische Untersuchungen wurden vor allem an Pseudomonas-Lipasen durchgeführt. Zu den untersuchten Lipasen gehören die Lipasen von Ps. cepacia, verschiedene Stämme von Ps. species, Ps. aeruginosa und Ps. fragi.. 4. Sekretion. 3. Disulfid-Bildung. Xcp. Dsb. 2. Faltung Lip b. PRO - LIPASE. Sec. 1. Transport Periplasma. Cytoplasma. Periplasma. Abb. 2.1: vierstufiger Sekretionsmechanismus von Lipasen in gram-negativen Bakterien. 1. Transport durch Sec 2. Faltung durch Lip b 3. Disulfid-Bildung durch Dsb 4. Secretion durch Xcp 6.

(16) Kapitel 2. Biologisches System. 2.2.1.1 Lipasen gram-negativer Bakterien. Alanin statt des sonst üblichen Glycins. Eine derartige katalytische Sequenz findet man auch. Das durchschnittliche Molekulargewicht von. bei der Protease Subtilisin.. Pseudomonas-Lipasen liegt bei ca. 30 kDa. Ihre Sequenz-Homologie untereinander übersteigt. 2.3. Reinigung von Lipasen. meist 60 %. Es gibt aber auch Ps.-Lipasen, die eine deutlich geringere Homologie untereinan-. Lipasen werden als sekretierte Enzyme aus dem. der aufweisen. Ein Stammbaum im Hinblick. Kulturüberstand bzw. dem Pankreas des jewei-. auf Sequenzähnlichkeit (aufgestellt auf der. ligen Organismus gewonnen. Im Überstand. Basis der Swissprot-Sequenzdatenbank) von 49. befinden sich normalerweise nur wenige Enzy-. Lipasen bekannter Sequenz zeigt, dass nur die. me, was die anschliessende Reinigung nach. Lipase von Ps. fluorescens keine große Se-. dem Abzentrifugieren des Zellmaterials verein-. quenzähnlichkeit mit den übrigen Pseudomo-. facht. Probleme können durch ebenfalls sekre-. nas-Lipasen aufweist.. tierte Proteasen, die die Lipasen verdauen können, auftreten.. 2.2.1.2 Lipasen gram-positiver Bakterien. Besonderes Augenmerk gilt daher dem ersten Bis auf das aktive Zentrum und eine Region im. Schritt des Reinigungsschemas, der Anreiche-. N-terminalen Bereich zeigen die Lipasen aus. rung der stark verdünnten Lipase und der Ab-. gram-positiven Bakterien keine nennenswerten. trennung vorhandener Proteasen. In vielen Fäl-. Homologien mit den Lipasen aus gram-. len wird zunächst über eine Ultrafiltration die. negativen Bakterien.. Proteinlösung ankonzentriert.. Bei den bisher untersuchten Gattungen gibt es. Aufgrund der lipophilen Eigenschaften von. zwischen den einzelnen Lipasen gram-positiver. Lipasen hat sich die Hydrophobe-Interaktions-. Bakterien zudem deutliche Unterschiede.. Chromatographie (HIC) als vorteilhaft heraus-. Das aktive, reife Protein der Gattung Staphylo-. gestellt und wird für fast alle Lipasen ange-. coccus ist 44-48 kDa groß, die Sequenzhomo-. wandt. Die unter Hochsalzbedingungen an das. logie der Lipasen der einzelnen Stämme im. Material gebundene Lipase kann mit reinem. Präpro-Teil beträgt nur 25 %, die reifen Enzy-. Wasser oder bei starker Bindung an das Säu-. me zeigen dagegen bis zu 65 %-ige Homologie. lenmaterial zusätzlich mit Alkohol oder Deter-. zueinander.. genz eluiert werden. In vielen Fällen kann auf diesem Wege die vollständige Trennung von. Die Lipasen der Gattung Bacillus hingegen sind. den übrigen Proteinen erreicht werden. Für die. mit 20-22 kDa deutlich kleiner als die übrigen. Feinreinigung sind in der Literatur viele Me-. Lipasen. Auch in der konservierten Sequenz. thoden beschrieben, wie die Gelfiltration oder. (G-X-S-X-G) des aktiven Zentrums gibt es. Ionenaustauscherchromatographie.. Unterschiede: an Position 1 befindet sich ein 7.

(17) Kapitel 2. 2.4. Biologisches System. 2.4.1 Reaktionsmechanismus einer. Enzymmechanismus. lipasekatalysierten Reaktion. von Lipasen. Lipasen zählen zu der Klasse der Serin-. Lipasen gehören zu den Hydrolasen und wer-. Hydrolasen, da ein Serin im aktiven Zentrum. den in die Enzymklasse 3 mit der EC-. für die katalytische Wirkung essentiell ist (Bra-. Klassifizierung 3.1.1.3. eingeordnet. Die durch. dy et al., 1990). Dies konnte durch Hemmung. diese Enzyme katalysierten hydrolytischen Re-. mit dem serinaktiven Reagenz Diethyl-p-. aktionen greifen u. a. Ester-, Glykosyl-, Peptid-. nitrophenylphosphat (E 600) nachgewiesen. und Säureanhydridbindungen an. Lipasen kata-. werden (Gilbert, 1993).. lysieren reversibel die Hydrolyse der Esterbindung von Glycerinestern aliphatischer Fettsäu-. Die Spaltung der Esterbindung erfolgt über. ren an einer Lipid-Wasser-Grenzschicht (Ab-. einen intermediär ausgebildeten, kovalent an. bildung 2.2).. das Serin gebundenen Acyl-Enzym-Komplex (Abbildung 2.3). Entwickelt wird dieser durch den nukleophilen Angriff des aktivierten Serins. O. auf die Estercarbonylgruppe unter Abspaltung. O. des Glycerins.. O. O O. +. H2O. Anschließend wird das Acylenzym durch den nukleophilen Angriff eines Wassermoleküls. O. wieder deacyliert; man erhält das freie Enzym und die abgespaltene Fettsäure. Als Reaktions-. Lipase. produkte entstehen Fettsäuren, Diacylglyceride, OH. Monoacylglyceride und Glycerin. Dieser soge-. O. O O. O. +. nannte Ping-Pong-Mechanismus ist allen Serin-. HO. Hydrolasen gemeinsam.. O. Neben der Spaltung von Ester- und Amid-. Abb. 2.2: Schema einer lipasekatalysierten Esterspaltung anhand des natürlichen Substrats Triacylglycerol. In weiteren Schritten können auch die zwei verbleibenden Estergruppen gespalten werden.. substraten kann auch die Übertragung von Acylresten unter Bindung kovalenter EnzymAcyl-Intermediate. in. einem. Zwei-Schritt-. Mechanismus stattfinden. Dabei wird zunächst der Acylrest an das Serin des aktiven Zentrums gebunden und im zweiten Schritt auf ein Nucleophil überführt.. 8.

(18) Kapitel 2. Biologisches System. Wird der Acylrest auf Wasser als nukleophil. siert. Bei Candida antarctica Lipase B (CAL B). übertragen, handelt es sich um die oben be-. beispielsweise wird das "Oxyanion" von den. schriebene Hydrolyse, bei einer Übertragung. Amidgruppen des Gln 106 und Thr 40 stabili-. auf einen Alkohol um eine Umesterung, bei der. siert, zusätzlich interagiert die Alkoholgruppe. Übertragung auf ein Amin um eine Amidie-. der Seitenkette des Thr 40 mit dem Sauerstoff,. rung.. wie in Abbildung 2.3 dargestellt.. Abbildung 2.4 zeigt den detaillierten Reakti-. Die Ausbildung des tetraedrischen "Oxyanion"-. onsmechanismus der enzymatischen Hydrolyse.. Intermediates stellt vermutlich den geschwin-. Zunächst wird das Substrat im Michaelis-. digkeitsbestimmenden Schritt der Hydrolyse. Menten-Komplex (1) gebunden und über Was-. dar (Kraut, 1977).. serstoffbrücken zu Stickstoffatomen zweier Das vom Serin auf den Imidazolring des Histi-. Peptidbindungen der Proteinhauptkette im so-. dins übertragene Proton wird im Folgenden an. genannten "Oxyanion-hole" polarisiert. Das. den Ester-O weitergegeben. Anschließend er-. Serin wird über das Histidin der Triade in einer. folgt unter Bindungsspaltung die Freisetzung. allgemeinen Basenkatalyse deprotoniert. Dann. des Alkohols (3). Der Enzym-Acyl-Komplex. erfolgt der nukleophile Angriff des Serins ent-. (4) wird durch einen weiteren nucleophilen. lang der Bürgi-Dunitz-Trajektorie und die gleichzeitige. Umhybridisierung. des. Angriff eines Wassermoleküls hydrolysiert (5),. sp2-. wobei das Restsubstrat als Carbonsäure ab-. Carbonylkohlenstoff von einer planaren in eine. gespalten wird (6).. tetrahedrale sp3-Geometrie. Der gebildete tetrahedrale Zwischenzustand (2) trägt eine negative Ladung am CarbonylSauerstoff, dem "Oxyanion". Dieses besetzt eine Tasche der Substratbindungsstelle, dem erwähnten "Oxyanionhole", und wird durch mindestens zwei Wasserstoffbrücken stabiliSer 105. G ln 1 0 6. HO. Thr 40. Abb.2.3: Darstellung der Stabilisierung des tetraedrischen Zwischenzustands mit den Aminosäuren im oxyanion-hole von Candida antarctica Lipase B 9.

(19) Kapitel 2. Biologisches System Thr 40. Thr 40 N H. O H. O H. O. Ph. O. O. R. O. R. 1. N H. + HN. O. + HN. O N. Ser 105. His 224. Ser 105. His 224. 6. N. Enzym + Säure Enzym + Ester. Thr 40. Thr 40. N H. O H. 2. O H Ph. R O H N. N H. Gln 106. OH. O. O O. 5. R. + HN. H N. N. + HN. O. Gln 106 Ser 105. His 224. Ser 105. tetrahedrales Intermediat Tet 1. N His 224. tetrahedrales Intermediat Tet 2. Thr 40 O H. N H. Ph HO. H2O. R. 3. 4. O O. Ser 105. N. N His 224. Acyl-Enzym Abb. 2.4: Schematische Darstellung der Esterspaltung durch Lipasen: (1) Michaelis-Komplex mit dem Ester, (2) erster tetraedrischer Übergangszustand, (3) Bildung des Acylenzyms und Freisetzung des Alkohols, (4) Angriff des Wassermoleküls an das Acylenzym, (5) zweiter tetrahedraler Übergangszustand, (6) Freisetzung der Fettsäure 10.

(20) Kapitel 2. 2.5. Biologisches System. Das moderne "induced-fit"-Modell von D. E.. Enzymkinetik. Koshland aus den 1960er Jahren berücksichtigt Enzyme sind in der Lage, biochemische Reak-. zusätzlich. tionen extrem zu beschleunigen. Dabei spielen. Modell Fischers die Flexibilität im Protein bei. die Wechselwirkungen bestimmter Aminosäu-. der Bindung und damit die induzierte Anpas-. ren im aktiven Zentrum eine entscheidende. sung an verschiedene Substrate (Koshland,. Rolle bei der Substratbindung, der Stabilisie-. 1994).. zum. starren. Schlüssel-Schloss-. rung eines Übergangszustandes, der anschliessenden Produktbildung und der nachfolgenden. Die molekulare Erkennung ist in diesem Fall. Produktfreisetzung.. ein dynamischer Anpassungsprozess zwischen dem Substrat und den Aminosäuren in der Bin-. Chemische Reaktionen können durch Enzyme. detasche.. 8. um einen Faktor von bis zu 10 beschleunigt Den Extremfall eines "induced fit" stellt die. werden und verlaufen trotzdem sehr selektiv.. Bewegung ganzer Domänen oder Teile der Ein Enzym erniedrigt wie jeder andere Kataly-. Hauptkette eines Enzyms während der Katalyse. sator die freie Aktivierungsenthalpie einer che-. dar, z. B. um das gebundene Substrat vollstän-. mischen Reaktion. Unter der Annahme eines. dig vom umgebenden Solvens abzuschirmen.. Gleichgewichts zwischen dem Reaktanden und. Ein weiteres Modell geht auf M. J. S. Dewar. dem. Eyring-. aus dem Jahr 1985 zurück und versucht, den. Gleichung (Eyring & Polanyi, 1931), die den. Unterschied zur Reaktion in Lösung in einem. Zusammenhang zwischen der Geschwindig-. Desolvatationsmodell zu erklären (Dewar &. keitskonstanten kb einer bimolekularen Reakti-. Storch, 1985).. Übergangszustand. gilt. die. on und der freien Aktivierungsenthalpie DG* Diese Modelle machen verständlich, warum ein. herstellt.. zu großes Substrat nicht umgesetzt werden. kb =. kT h. e. kann und ein zu kleines Substrat, das das Sol-. DG * RT. vens nicht vollständig aus der Bindetasche verdrängt, nur langsam reagiert. Diese ursprünglichen Modelle sind bis heute erweitert worden,. Eyring - Gleichung. aber im Grundsatz unangetastet geblieben. An-. k=Boltzmann-Konstante, h=Planck’sches Wirkungsquantum, T=absolute Temperatur, R=allgemeine Gaskonstante. gewandt auf den Übergangzustand, stabilisiert das Enzym so den produktiven Enzym-. Es wurden verschiedene Modelle entwickelt,. Substrat-Komplex und senkt dessen Energie.. um diese Beschleunigung zu erklären. Der erste. Dieser Vorgang wird in Anlehnung an die mo-. bedeutende Beitrag wurde durch das Schlüssel-. derne stereoelektronische Orbitaltheorie der. Schloß-Prinzip von E. Fischer aus dem Jahre. organischen Chemie "orbital steering" genannt.. 1894 geleistet (Fischer, 1894). 11.

(21) Kapitel 2. Biologisches System. Diese Theorien erklären die hohe Substrat- und. Daraus folgt, dass "steady-state"-Messungen. Produktselektivität enzymkatalysierter Reaktio-. nur pauschal für die Gesamtreaktion zu inter-. nen.. pretieren sind und keine direkte Aussage über den detaillierten Reaktionsmechanismus erlau-. Das minimale kinetische Schema für eine en-. ben. Die beobachtete Reaktionsgeschwindigkeit. zymkatalysierte Reaktion wurde 1913 von Mi-. v im "steady-state"ist für jeden Reaktionsme-. chaelis und Menten aufgestellt: k1. E+S. ES. chanismus durch den folgenden Ausdruck bestimmt:. k2. E+P. k-1. v /[ E 0 ] =. Michaelis-Menten Kinetik. k cat [ S ] K m + [S ]. Die einzelnen kinetischen Konstanten, die den. Aus diesem vereinfachten Schema mit irreversiblem Zerfall des ES-Komplexes, ohne Be-. komplex zusammengesetzten Konstanten KM. rücksichtigung der Produktbindung an das En-. und kcat. zugrunde liegen, können nicht be-. stimmt werden. Aus diesen beiden kinetischen. zym, erhält man für die kinetischen Konstanten. Konstanten, KM und Kcat, die experimentell aus. kcat = k2 und KM=(k2 + k-1)/k1.. einfachen "steady-state"-Messungen zugänglich Eine noch weitergehende Vereinfachung stellt. sind, lassen sich jedoch einige Abschätzungen. die Annahme dar, dass k -1 > k2 ist, und somit. für die einzelnen Teilschritte eines Mechanis-. Km direkt der Dissoziationskonstanten Kd des. mus ableiten. So kann kein Teilschritt der Hin-. Enzym-Substrat-Komplex entspricht.. reaktion langsamer sein als kcat.. Ein realistischeres Schema für den kinetischen. Der als Spezifizitätskonstante bezeichnete Pa-. Ablauf von Haldane (1930) berücksichtigt die. rameter kcat/Km definiert eine untere Grenze für. Reversibilität der Reaktionsschritte und ist um. eine. die Existenz eines Enzym-Produkt-Komplexes. zweiter Ordnung der Substratbindung. Die. erweitert.. wirkliche. scheinbare. Geschwindigkeitskonstante. Geschwindigkeitskonstante. muss. jedoch um einen Faktor größer sein, der die. E+S. k1. ES. k-1. k2. EP. k-2. k3 k-3. Dissoziation bzw. Reaktion des ES-Komplexes. E+P. in den nächsten Zustand der Gesamtreaktion. Haldane -Kinetik. beinhaltet. Daher ist die genaue Bestimmung Die "steady-state"-Parameter für den quasi sta-. der Substratspezifität einer enzymatischen Re-. tionären Zustand im Fliessgleichgewicht er-. aktion nur mit Hilfe transienter Methoden durch. rechnen sich jetzt nach folgenden Gleichungen:. k cat = Km =. k2 k3 k 2 + k -2 + k 3. die Analyse der individuellen Reaktionsschritte unter direkter Beobachtung der intermediären. und. Zustände vor der Einstellung des Fliessgleich-. k 2 k 3 + k -1 k - 2 + k - 1 k 3 k 1 ( k 2 + k -2 + k 3 ). gewichts möglich.. 12.

(22) Kapitel 2. Biologisches System. schnell gebildet wird. Dieser Schritt ist diffusi-. 2.5.1 Kinetischer Enzym-. onskontrolliert und daher den normalen kineti-. mechanismus von Lipasen. schen Methoden nicht zugänglich. Ultraschnelle Betrachtet man das vereinfachte kinetische. kinetische Methoden im Mikrosekundenbereich. Modell für eine typische Serin-Hydrolase, das. wie z. B. Temperatur-Sprung- oder Druck-. die Bildung eines Acyl-Enzyms und die Rever-. Sprung-Techniken haben jedoch gezeigt, dass. sibilität der einzelnen Reaktionsschritte bein-. dieser Schritt für die meisten Enzyme nur von. haltet, so erhält man folgendes Schema :. der Viskosität des Lösungsmittels bzw. von der. E+S. k1. k2. ES. k3. E-A. EP k-3. k-2. k-1. k4. Temperatur E+ P. (Cryoenzymologie). abhängt. (Gutfreund, 1996).. k-4. Im zweiten Schritt wird das Enzym acyliert und E = Enzym E-A =Acyl-Enzym. S = Substrat P = Produkt. der Alkoholrest abgespalten. Die Geschwindigkeit der Alkoholfreisetzung ist daher eine direk-. Die kinetischen Konstanten Km und kcat sind in. te Observable für die transiente Kinetik der. diesem Schema durch die folgenden Ausdrücke. Reaktion. Betrachtet man den Verlauf der Al-. gegeben (Gutfreund):. koholbildung vor der Ausbildung eines Fliess-. k cat =. k 2 k 3k 4. gleichgewichts mit Hilfe geeigneter kinetischer. ( k 2 + k -2 )( k -3 + k 4 ) + k 2 k 3 + k 3 k 4. Methoden, so erhält man Aufschluss über die Geschwindigkeit der Acylierung und des nach-. Km =. k -1 ( k -2 ( k -3 + k 4 ) + k 3 k 4 ) + k 2 k 3 k 4 k 1 (( k 2 + k -2 )( k -3 + k 4 ) + k 2 k 3 + k 3 k 4 ). folgenden Schrittes. Beobachtet man die transiente Kinetik der Al-. Mit Hilfe der transienten Kinetik ist es nun. koholbildung und damit die Bildung von E-A,. möglich, einzelne Teilreaktionen zu charak-. so können entsprechend dem nachfolgend an-. terisieren, indem man die Konzentration der. gegebenen Schema getrennt die Geschwindig-. Zwischenprodukte ES, EF oder EP als Funktion. keitskonstanten k2, k-2, k3 und k-3 bestimmt. der Zeit bestimmt.. werden. Mit dieser Methode ist es möglich, die. Damit. werden. einzelne. Bindung verschiedener Substrate sowie den. Geschwindig-. Einfluss von Mutationen im aktiven Zentrum. keitskonstanten innerhalb des kinetischen Me-. direkt miteinander zu vergleichen, ohne auf die. chanismus einer direkten Messung zugänglich.. pauschalen Konstanten KM und kcat angewiesen. Interessant ist die Frage nach dem geschwin-. zu sein.. digkeitsbestimmenden Schritt eines solchen mehrstufigen Mechanismus. Es wird allgemein angenommen, das der Michaelis-Menten-Komplex mit dem Ester sehr 13.

(23) Kapitel 2. Biologisches System. k2. E+S. k3. 2.5.2 Burst-Kinetik. E-X. E-A k-3. k-2. Eine spezielle Variante der transienten Kinetiken sind die sogenannten "Burst"-Kinetiken.. R-OH. Der Name dieser Messungen resultiert aus der E + S = Enzym + Sunbstrat E-A = Acyl Enzym E-X nichtaufgelöste Teilschritte. Tatsache, dass Enzyme, deren langsamster Schritt die Deacylierung des E-A Komplexes. Essentiell für die Rückgewinnung aktiven En-. ist, zunächst schnell ein Äquivalent Alkohol. zyms ist die schnelle Freisetzung des Produkts.. freisetzen und sich damit zu Beginn der Reakti-. Aktuelle theoretische Untersuchungen der Par-. on fast vollständig im acylierten Zustand befin-. tialladungen an der solvens-zugänglichen Ober-. den,. fläche im aktiven Zentrum von Esterasen und. Fliessgleichgewicht einstellt. Der typische Ver-. Lipasen verweisen auf ein negatives elektrosta-. lauf einer "Burst"-Kinetik ist in Abbildung 2.5. tisches Potential in der Bindetasche am pH-. dargestellt.. Optimum der untersuchten Enzyme.. bevor. sich. anschliessend. ein. -. Aus der Grösse und der Geschwindigkeit des. Dieses negative Potential würde eine negativ. sogenannten "Bursts" können dann unter An-. geladene Säure, die als Produkt entsteht, absto-. nahme des unten aufgestellten minimalen kine-. ßen, und somit sollte eine Rückbindung des. tischen Schemas die Enzymmenge und die ki-. Produkts effizient verhindert werden ("product-. netischen Parameter Ks k2 und k3 direkt be-. catapult-model") (Neves Petersen, Fojan &. stimmt werden.. Petersen, 2001). P2. E + S = Enzym + Sunbstrat E-A = Acyl Enzym P1= Produktalkohol E+P2= Enzym + Produktsäure. Dieses Schema lässt sich unter der Annahme ableiten, dass Substratbindung als schnelles vorgelagertes Gleichgewicht mit der Dissoziationskonstanten Ks beschrieben werden kann und die Rückreaktionen k-2 und k-3 vernachlässigt werden können. Zeit Abb. 2.5 Typische „burst“ kinetik der Alkoholfreistzung bei langsamer Deacylierung des Enzyms. Die Höhe des „burst“ ist von der eingesetzten Enzymmenge E abhängig.. 14.

(24) Kapitel 2. Biologisches System. ein "Deckel" den Zugang zum aktiven Zentrum. 2.5.3 Grenzflächenaktivierung. verschließt (Brzozowski et al., 2000). Lipasen unterscheiden sich von den anderen Enzymen ihrer Proteinfamilie durch ihre soge-. Je nach betrachteter Lipase besteht der "lid" aus. nannte. Interphasen-. einer (Pseudomonas glumae, humane Pankreas-. aktivierung. Lipasen folgen im Gegensatz zu. lipase) oder zwei a-Helices (Geotrichum can-. Esterasen keiner einfachen Michaelis-Menten-. didum). Die Innenseite des "lid" ist dabei li-. Kinetik, sondern erfordern zusätzlich einen. pophil, die Außenseite hydrophil, wie in Abbil-. vorgelagerten Schritt zur Aktivierung des En-. dung 2.8 dargestellt.. Grenzflächen-. oder. zyms. Abbildung 2.6 zeigt eine Gegenüberstellung der jeweiligen Kinetik. Kinetische und thermodynamische Untersuchungen an micellären Systemen konnten diese Aktivierung. durch. ein. einfaches. Zwei-. Zustands-Modell erklären (Cajal et al., 2000). Die Lipase liegt in der wässrigen Phase in einer inaktivien Konformation vor und wird in einem vorgelagerten Schritt aktiviert, bevor das Substrat binden kann. Abb. 2.6: Interphasenaktivierung einer Lipase im Vergleich mit einer Esterase; aufgetragen ist die jeweilige Enzymaktivität als Funktion der Substratkonzentration, die in Vielfachen der Substratlöslichkeit angegeben ist. Die gestrichelten Linien zeigen die Micellenbildung an (aus: Jaeger und Wohlfarth, 1993).. Wasser. E = Enzym. S = Ester. Ea =adsorbiertes Enzym Ea* = offenes ads. Enzym P1 = Produktalkohol. P2 = Produktsäure. "Steady-state"-Fluoreszenzuntersuchungen und Fluoreszenz-Korrelationspektroskopie bestätigten ein solches Zwei-Zustands-Modell der Aktivierung durch Micellen oder organische Lösungsmittel (Jutila et al., 2000). Diese Aktivierung wird auf ein bewegliches Strukturelement ("flap" oder "lid") (Berg et al., 1998) zurückgeführt (Abbildung 2.7), das wie 15.

(25) Kapitel 2. Biologisches System. Abb. 2.7: Schema der Lipaseaktivierung. Gezeigt ist eine Lipase mit Substrat links in der geschlossenen und rechts in der aktiven, geöffneten Konformation.. Durch das Öffnen des "lid" vergrößert sich. Konformationen der Candida Rugosa Lipase. daher die lipophile Oberfläche des Proteins, das. aufgeklärt werden (Grochulski et al., 1993).. Enzym kann besser an die Lipid-Wasser-. Weitere Untersuchungen an verschiedenen Li-. Grenzschicht anlagern und ermöglicht gleich-. pasen. zeitig einen Zugang zum aktiven Zentrum.. (Brzozowski et al., 2000). Pancreaslipasen be-. bestätigten. diesen. Mechanismus. nötigen zusätzlich zur Grenzflächenaktivierung Dieses Phänomen der Grenzflächenaktivierung. mittels. (engl. "interfacial activation") konnte erstmals. Gallensäuren. noch. eine. Colipase. (Hermoso et al., 1997) (Egloff et al., 1995).. 1993 durch Röntgenstrukturanalyse der beiden Die zugängliche Oberfläche ändert sich z. B. bei der Rhizomucor miehei-Lipase von 10560 Å2 im geschlossenen Zustand auf 11816 Å2 in der offenen Form (Vasel et al., 1993). Gleichzeitig entsteht ein ausgedehnter hydrophober Bereich um das katalytische Zentrum herum. Der "Lid" scheint somit die Aktivität der Lipase zu kontrollieren; wenn keine hydrophobe Umgebung zugegen ist, bleibt er geschlossen und die Lipase ist nicht aktiv. In Gegenwart einer Phasengrenzfläche wird die katalytische Triade durch die Bewegung des helikalen „Lid“Abschnitts zugänglich und die Lipase wird aktiviert. Abb 2.8: Seitenansicht der geschlossenen amphiphilen ´lid´ Helix in Pseudomonas glumae über dem aktiven Zentrum. Die Aminosäuren des ´Lids´ sind nach ihrer Eigenschaft farbig markiert: grün=lipophil, magenta = hydrophil. Die hydrophilen Seitenketten weisen in der geschlossenen Konformation zum Solvens.. 16.

(26) Kapitel 2. Biologisches System. Da die Substratmoleküle an der Phasengrenz-. tätsbestimmung von Lipasen gegenüber Mem-. fläche eine gewisse Orientierung und somit eine. branlipiden beruht auf der Messung der Ober-. Ordnung vorweisen und zudem die Diffusion in. flächenspannung. das aktive Zentrum auf eine zweidimensionale. Triglyceridfilmes mittels eines Tensiometers. Oberfläche reduziert wird (Abbildung 2.9),. (Ransac et al., 1999; Verger, 1976). Die fort-. erklären sich die hohen Umsatzzahlen für Lipa-. schreitende Hydrolyse der Triglyceride durch. sen an Micellen (Brown, Yada & Marangoni,. die Lipase führt zur Abnahme der Oberfläche. 1993; Chapus et al., 1978; Ferrato et al., 1997).. des Films.. 2.5.4 Aktivitätsbestimmungen. Die pH-Methode zur Aktivitätsbestimmung der. eines. monomolekularen. Esterspaltung von Triacylglyceriden beruht auf Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität. der Quantifizierung der freigesetzten Fettsäuren. wurden eine Reihe von Methoden entwickelt.. mittels kontinuierlicher pH-Messung. Man un-. Man unterscheidet direkte Methoden, die unab-. terscheidet zwei Methoden, die pH-statische. hängig von der chemischen Natur des Substrats. Messung, bei der die frei werdende Säure mit. sind, chromogene und fluorogene Nachweisver-. einer Base gegentitriert wird und der Verbrauch. fahren, die auf der Anwesenheit von bestimm-. der Base ein direktes Maß für die Aktivität dar-. ten chromrophren Gruppen im Substrat beru-. stellt, sowie die Messung der pH-Erniedrigung. hen. Diese verändern ihr Absorptions- oder. in ungepufferter Lösung durch die freigesetzte. Emissionsspektrum durch die enzymatische. Säure (Schmid & Verger, 1998).. Spaltung signifikant. Am häufigsten wird die pH-Stat-Methode anDie erste veröffentlichte Methode zu Aktivi-. gewandt, da unter definierten pH-Bedingungen sowohl in homogener Phase als auch mit micellären Substraten gemessen werden kann. Der Nachteil dieser beiden Methoden ist jedoch die Dauer eines Experimentes und der apparative Aufwand für die exakte pH-Bestimmung. Die pH-Drop-Methode ist durch die Firma Thermogen in jüngerer Zeit für HochdurchsatzAktivitätsmessungen als Methode zur Enatioselektivitätsbestimmung mit chromogenen Indika-. Abb. 2.9 :Modell der Grenzflächenaktivierung von Lipasen. Der „Lid“ Wechselwirkt mit der Oberfläche einer Micelle und stabilisiert die aktive Konformation.. toren als pH-Sonden kombiniert worden, um in Mikrotiterplatten mit Hilfe von Absorptionsmessung den pH-Verlauf vieler Reaktion parallel verfolgen zu können (Moris-Varas et al., 1999). Dieses Messprinzip unterliegt jedoch der 17.

(27) Kapitel 2. Biologisches System. Beschränkung auf homogene, wässrige und. die Anwendbarkeit dieser Methode begrenzt.. schwachgepufferte Systeme. Ein Problem bei Das Gleiche gilt für hochempfindliche fluoro-. der quantitativen Auswertung ist die nichtlinea-. gene Substrate wie Umbelliferon-Carbonsäure-. re Abhängigkeit der Indikatorabsorption vom. Ester (Simons et al., 1996), die zur Freisetzung. pH-Verlauf.. von fluoreszierendem Umbelliferon führen. Weitere direkte Methoden beruhen auf der disZur Aktivitätsmessung von Glycerol-Estern. kontinuierlichen Messung des Gehalts an Pro-. wurden spezielle Methoden entwickelt, von. dukt durch analytische Verfahren, wie z. B.. denen der Rosorufin-Test(Cardenas et al.,. HPLC, Gaschromatographie oder NMR. Durch. 2001). Wahl von geeigneten enantioselektiven Trenn-. (1,2-O-dilauryl-rac-glycero-3-Glutar-. säure-Resorufinylester) kommerziell erhältlich. methoden ist auch die Unterscheidung von Ste-. ist.. reoisomeren im Produkt möglich. Um den kompletten Verlauf einer Reaktion zu erfassen,. Weitere Aktivitätsmessungen beruhen auf spe-. ist die Entnahme und Aufbereitung von vielen. ziell synthetisierten fluorogenen Fettsäuren in. Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten und. Kombination mit fluoreszenzunterdrückenden. ein hoher apparativer Aufwand nötig. Ein Vor-. Fettsäuren im Triacyl-glycerolester. Bei der. teil dieser Methode ist die generelle Anwend-. Hydrolyse wird die fluorogene Fettsäure ab-. barkeit, die Unabhängigkeit von der speziellen. gespalten und so eine Änderung der Fluores-. Substratstruktur und von dem verwendeten. zenzeigenschaften erreicht. Diese Methode ist. Lösungsmittel.. besonders empfindlich, wenn die verbleibenden. Chromogene. Substrate,. wie. z.. B.. fluoreszenzunterdrückenden Diacyl- und Tria-. para-. cylglycerole in Micellen gebunden bleiben.. Nitrophenyl-Ester mit Carbonsäuren unterschiedlicher Kettenlänge, sind kommerziell erhältlich und erlauben die kontinuierliche Aktivitätsmessung durch die einfache Quantifizierung. des. abgespaltenen. para-Nitro-. phenolat-Ions durch die Absorptionsmessung bei 405 nm. Der Alkoholteil des Ester ist somit für dieses Essay festgelegt und nur die Säure kann variiert werden. Durch die Kombination mit chiralen Carbonsäuren ist die direkte Bestimmung der Aktivität gegenüber Estern mit vorgegebener Stereochemie im Säureteil möglich, da Lipasen aber nur langkettige, unverzweigte Fettsäuren als Substrate akzeptieren, ist. 18.

(28) Kapitel 2. Biologisches System. 2.5.5 Inhibition von Lipasen. O Als nichtkovalente Inhibitoren von Lipasen sind. X. vor allem Substratanaloge mit nichthydrolysierbaren Amido- oder Keto-Gruppen, wie z. B. alpha-Keto-triacylglycerol-Derivate. das. serinaktive. Diethyl-p-nitro-. phenylphosphat sowie Histidin-modifizierende Sulfone bekannt. Der promineteste Inhibitor, das Tetrahydro-Lipstatin wird als OrlistatÔ therapeutisch eingesetzt. Die ersten lipasespezifische Inhibitoren waren langkettige Phosphonsäure-Derivate der in Abbildung 2.10 gezeigten Grundstruktur, die analog dem tetraedrischen Übergangszustand an das katalytische Serin binden. In den letzten Jahren gelang auch die Synthese von Phosphonsäurederivaten mit enantiomerenreinen chiralen Alkoholen. Zu beachten ist, dass bei asymmetrischer Substitution am Phosphor ein Stereozentrum auftritt, so dass Diastereomere erhalten werden. Zur Untersuchung der Enantioselektivität gegenüber Acyl-glycerolen bzw. sekundären Alkoholen. sind. X. P C5H11 R. Abb. 2.10: typische kovalente Inhibitoren von Lipasen, links Boronsäure, rechts PhosphonsäureDerivate, abgeleitet vom Herbizid E605 X = para-nitro-Phenyl als Abgangsgruppe. Als kovalent bindende Liganden sind Inhibitowie. B OH. bekannt. (Simons et al., 1999).. ren. R. Diacylglycerophosphonate. (Stadler et al., 1996) und Menthylalkoholderivate(Grochulski et al., 1994a) synthetisiert worden.. 19.

(29) Kapitel 2. 2.6. Biologisches System. verschiedener Lipasen ist die relative Lage der. Struktur von Lipasen. Aminosäuren der katalytischen Triade im Raum. 2.6.1 Gemeinsame Raumstruktur. sehr ähnlich, selbst bei fehlender Sequenzähn-. der a/bHydrolasen. lichkeit und wenn die verbleibende Struktur deutliche Unterschiede aufweist (Abb. 2.11).. Lipasen haben zusammen mit Esterasen und Hydrolasen ein gemeinsames Faltungsmuster,. Es gibt vier Gruppen von Enzymen, die eine. die sogenannte a/b-Hydrolase Faltung. Der. solche katalytische Triade enthalten und durch. innere Aufbau ist ein mehrsträngiges b-. konvergente Evolution eines stabilen und funk-. Faltblatt, das von den verknüpfenden a-Helices. tionellen aktiven Zentrums als strukturell verwandt angesehen werden können: eukaryoti-. umgeben ist.. sche Serin-Proteasen, Cystein-Proteasen, Subtilisine und a/b-"Hydrolase-fold" Enzyme.. Das Serin der katalytischen Triade liegt in einer Haarnadelschleife zwischen einer a-Helix und einem b-Strang mit der hochkonservierter Sequenz aus den fünf Aminosäuren (G-X-S-X-G). Bei einer Überlagerung der Raumstrukturen. Abb. 2.11: Vergleich des a/b-Hydrolase Faltungsmusters von Ca L B und Ps. Lipase (schwarz b-Faltblatt) aus (Theil, 1997).. 20.

(30) Kapitel 2. Biologisches System. mit und ohne kovalent gebundenem Inhibitor.. 2.6.2 Offene und geschlossene. Es ist nicht bekannt, welche Faktoren den offe-. Raumstrukturen von Lipasen. nen Zustand ohne gebundenen Liganden im Für verschiedene Lipasen gelang es inzwischen,. Kristall stabilisieren können (Cygler et al.,. röntgenstrukturanalytisch. 1994).. hochaufgelöste. Raumstrukturen zu ermitteln. Die meisten dieser Strukturen liegen im geschlossenem Zu-. Abbildung 2.12 zeigt eine Überlagerung der. stand vor, einige wenige vermitteln aber auch. experimentell bestimmten Strukturen der Lipa-. Einblicke in den offenen oder halboffenen Zu-. se aus Rhizomucor miehei in offener (gelb) und. stand.. geschlossener (orangerot) Konformation. Die katalytische Triade ist in rot dargestellt, vom. Der offene Zustand kann durch den Einbau. verbleibenden Protein ist schematisch nur der. eines kovalent gebundenen Inhibitors (z. B.. Verlauf der ProteinHauptkette dargestellt.. Diethylphosphat) erzwungen werden, der eine ähnliche Geometrie wie das Substrat im tetra-. Das Vorliegen und die Bedeutung eines solchen. hedralen Zwischenzustand besitzt. Von CRL. beweglichen Strukturelements über dem akti-. und CAL B gibt es offene Strukturen sowohl. ven Zentrum wurde inzwischen auch für die. Abbildung 2.12: offene („Lid“ gelb) und geschlossene („Lid“ orangerot) Struktur von RML, akt. Zentrum rot. 21.

(31) Kapitel 2. Biologisches System. Lipasen aus Geotrichum candidum (Schrag &. Im Fall der CrL (Candida rugosa) (Grochulski. Cygler, 1993), Candida rugosa (Grochulski et. et al., 1994a) und CaL B (Candida antartica B). al., 1993; Grochulski et al., 1994b) Candida. (Uppenberg et al., 1995) scheint dagegen keine. antartica B (Uppenberg et al., 1995), Pseudo-. Konformationsänderung in der Anordnung der. monas glumae (Noble et al., 1993), Rhizopus. katalytischen Reste und des "Oxyanion-hole". delemar, Penicillium camembertii (Derewenda. stattzufinden.. et. al.,. 1994). und. Humicola. lanuginosa Für CAL B wird aufgrund von kinetischen Un-. (Brzozowski et al., 2000; Lawson et al., 1994). tersuchung, die keine Interphasenaktivierung. nachgewiesen.. nachweisen konnten, die Funktionalität des Am Beispiel der Humicola lanuginosa-Lipase. "Lid" in Frage gestellt (Martinelle, Holmquist. konnte mit Hilfe von mehreren geschlossenen,. & Hult, 1995). Bei der Cutinase, die Tri-. halboffenen und offenen Strukturen unter ver-. glyceride hydrolysiert, aber keinen "Lid" besitzt. schiedenen. ein. und so als eine Art Zwischenstufe zwischen. Mechanismus für die Bewegung des "Deckels". Lipasen und Esterasen angesehen werden kann,. postuliert werden, der über die Isomerisierung. zeigen Strukturuntersuchungen, dass sich die. einer Disulfid-brücke und die Konformation-. Konformation der katalytischen Reste nicht. sänderung. ändert (Martinez et al., 1994; Prompers et al.,. Kristallisationsbedingungen. eines. Arginins. ausgelöst. wird. (Brzozowski et al., 2000). Ein besonderer Me-. 1999).. chanismus, der die Anwesenheit einer Colipase In Anwesenheit eines kovalent gebundenen. erfordert, konnte für die humane Pankreaslipase. Inhibitors wurde jedoch eine Anpassung der. (van Tilbeurgh et al., 1993), die Pankreaslipase. übrigen Reste in der Bindungstasche der Cuti-. des Pferdes (Bourne et al., 1994), und Lipopro-. nase (Carvalho, Aires-Barros & Cabral, 1999). tein-Lipase (Dugi et al., 1992) nachgewiesen. ("induced fit") festgestellt. Untersuchungen der. werden.. Dynamikmit Hilfe der NMR-Spektroskopie am Ob. dabei. auch. weitere. Konformations-. Protein-Rückrat der Cutinase (Prompers et al.,. änderungen im Inneren des aktiven Zentrums. 1999) zeigen eine erhöhte Mobilität der Reste. stattfinden, scheint für jede Lipase unterschied-. in der Bindetasche auf einer Zeitskala im Milli-. lich sein. Für RML (Rhizomucor miehei) und. sekundenbereich, d. h. Bewegungen, die in der. Pseudomonas glumae wurden solche Verände-. Größenordung der Katalysegeschwindigkeit für. rungen im Vergleich zu den offenen Strukturen. einen Substratwechsel liegen.. homologer Lipasen beobachtet.. 22.

(32) Kapitel 2. Biologisches System. Angegeben ist der jeweilige PDB-Code aus der. 2.6.3 Lipasen mit bekannter. Proteindatenbank sowie die vorliegende "Lid"-. Raumstruktur. Konformation zusammen mit der gegebenenIn der folgenden Auflistung (Tabelle 2.1) sind. falls möglichen Präsenz eines kovalent gebun-. die bakteriellen und pilzlichen Lipasen, von. denen Inhibitors.. denen bis zum Jahr 2000 die Raumstruktur aufgeklärt und veröffentlicht wurde, zusam-. Trotz der grossen Zahl an Strukturen mit ge-. mengefasst.. humane. bunden Inhibitoren ist bisher nur ein Beispiel. Pankreaslipase, die im Komplex mit einer Coli-. (Candida rugosa: 1lps/1lpo) mit chiralen Inhi-. pase aufgeklärt werden konnte und die Cutina-. bitoren bekannt, die einen direkten Vergleich. se, von der eine Reihe Mutanten untersucht. der beiden Bindungsmoden der gebundenen. wurden, aufgeführt.. Enantiomere ermöglichen.. Zusätzlich. ist. die. Tab. 2.1: Vorliegende Lipasestrukturen mit Abkürzung und PDB-Einträgen Name. Organismus. geschlossen. offen. mit Inhibitor (fett = chiral). CaL. Candida antarctica B. -. 1tca 1tcb1tcc. CrL. Candida rugosa. 1lpp. 1crl. 1lbs Tween80 1lbt n-Hexyl-ethyl-phosphonat 1lpn Dodecanesulfonat 1lps (1S)-Menthyl hexyl phosphonat 1lpo (1R)-Menthyl hexyl phosphonat. GcL HlL. Geotrichum candidum Humicola lanuginosa. 1thg. -. 1tib 1du4 1dte 1dt3 1dt5. 1tic,1dt5. 1ein Polyoxyethylen-5-octyl-ether. PcL. Pseudomonas cepacia. 1oil 2lip 3lip. 4lip R-Dioctylglycero-3octylphosphonat 5lip R-Dibutylglycero-3butylphosphonat 1hqd 1-Phenoxy-2-acetoxy butan. PgL (BpÖ) PaL RdL RmL. Pseudomonas glumae (Burkholderia plantarii) Pseudomonas aeruginosa Rhizopus delemar Rhizomucor miehei. HuPL. human pancreatic Lipase + sus scrofa Colipase (pig) Fusarium solani Cutinase. FsC. 1tah 1qge 1cvl C. viskosum. 1ex9 R-dioctylglycero-3octylphosphonat 1tic. 1tgl 2tgl 3tgl. -. 4tgl Diethylphosphonat 5tgl n-Hexyl-ethyl-phosphonat 1lpa Diundecyl phosphatidyl cholin 1lpb Undecane-methyl phosphonat. 1agy 1cex 1oxm (no LID) 2cut Diethyl-para-nitrophenyl phosphonat 33 Cutinase-Mutanten 1xzk Di(isopropyl) phosphonat 1cuu-1cuz 1ffa-1ffe 1xza-1xzj 1xzl n- Hexyl-ethyl-phosphonat. 23.