Infektionserkrankungen auch in den Industrieländern wieder auf dem Vormarsch
Begrenzung der antimikrobiellen Therapie durch Resistenzenzwicklungen
cEdward Jenner:
Impfstoff gegen Pocken
Infektionserkrankungen gehören weltweit zu den häufigsten Krankheitsursachen. Dabei sind vor allem Kinder unter 5 Jahren betroffen. Nach dem WHO-Report von 1995 erkran- ken jährlich etwa 1,8 Milliarden Personen an infektionsbedingten Durchfallerkrankungen, 248 Millionen an Atemwegsinfektionen, fast 100 Millionen an Chlamydien- und Trichomo- nadeninfektionen, 80 Millionen an Gonorrhoe sowie knapp 50 Millionen an Masern und Keuchhusten. Darüber hinaus gehören Infektionserkrankungen auch zu den häufigsten Todesursachen. Allein 4,1 Millionen Todesfälle pro Jahr sind auf Atemwegsinfektionen zurückzuführen. 3 Millionen Todesfälle werden aufgrund von Durchfallerkrankungen ver- zeichnet.
Infektionserkrankungen sind nicht ausschließlich ein Problem der unterentwickelten Re- gionen, auch in industrialisierten Ländern sind sie wieder auf dem Vormarsch: Infektionen sind dort in den vergangenen zehn Jahren von der 5. auf die 3. Stelle der häufigsten Todes- ursachen angestiegen. Laut dem Bundesministerium für Gesundheit beziehen sich etwa 25-30 % aller Diagnosen und Behandlungen in der Bundesrepublik Deutschland auf Infek- tionen.
In Industrienationen stellen die Infektionskrankheiten auch deshalb ein Problem dar, weil dort ein sehr breites Spektrum von Infektionserregern aufzufinden ist. Auf der einen Seite werden immer wieder Ausbrüche von Infektionen verschiedener bekannter Erreger wie z.B. Salmonellen, enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) usw. beobachtet. Zudem kommt den „neuen“ Infektionserregern wie etwa Legionellen, Chlamydia pneumoniae oder Helicobacter pylori eine wichtige Bedeutung zu. In den vergangenen 20 Jahren wur- den über 30 dieser “neuen” Erreger entdeckt. Schließlich zeigen zunehmende Resistenz- entwicklungen (z.B. multiresistente Staphylococcus aureus, Vancomycin-resistente Ent- erokokken) die Grenzen der antimikrobiellen Therapie auf.
Hieraus wird deutlich, daß die Prävention von Infektionserkrankungen in Zukunft wieder einen größeren Stellenwert erlangen wird.
Problematik von Impfstoffen
Die Prävention von Infektionserkrankungen durch Impfstoffe ist ein außerordent- lich effizientes und, verglichen mit den Kosten für die Behandlung von Infektionser- krankungen, preiswertes Verfahren. Heute vor 200 Jahren hat c Edward Jennerden ersten Impfstoff gegen die Pocken (in einem von heutigen Ethikkommissionen wohl kaum mehr genehmigten Experiment) erfolgreich angewendet und eine Impfstoff- Entwicklung in Gang gesetzt. Diese hat letzlich dazu geführt, daß die WHO die Erde 1980 für “pockenfrei” erklären konnte.
I. B. Autenrieth •A. Noll• Max von Pettenkofer-Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie der Ludwig Maximilians-Universität München
Perspektiven
für die Entwicklung neuer Impfstoffe
Prof. Dr. I.B. Autenrieth • Max von Pettenkofer-Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie, Ludwig Maximilians-Universität München, Pettenkofer Straße 9a, D-80336 München
Fo rt bildung Neue Impfstoff e
Monatsschr Kinderheilkd
1998 •146:355-364 © Springer-Verlag 1998
Redaktion
B. Koletzko • München D. Reinhardt • München
Die Beiträge der Rubrik „Fortbildung“ sollen dem Wissenstand zur Facharztprüfung für den Pädia- ter entsprechen und zugleich dem Facharzt als Repetitorium dienen. Die Rubrik beschränkt sich auf klinisch gesicherte Aussagen zum Thema.
ger aus einer Population verbannt werden
cProbleme verfügbarer Impfstoffe:
• Eingeschränkte Wirkung
• Toxische Nebenwirkungen
• Mehrmalige Gaben erforderlich
cProbleme mit Impfstoffen in unterentwickelten Ländern
Gegen viele der häufigsten Infektionserre- ger existieren bislang keine Impfstoffe
Den idealen Impfstoff gibt es noch nicht
cWahl des geeigneten Antigens
Mutationsraten der Gene für Erreger- antigene: Keine breite Schutzwirkung !
Nicht alle Antigene werden von Bakterien in verschiedenen Infektionsphasen gebildet
Möglicherweise könnten bald Polioviren dem Beispiel der Pockenviren folgen und als ausgerottet gelten.
Die o.g. Beispiele verdeutlichen die eminente Potenz von Impfstoffen in der Prävention von Infektionserkrankungen. Gleichwohl existieren jedoch eine Reihe von c Problemen mit gegenwärtig verfügbaren Impfstoffen(Tabelle 1). Einige Impfstoffe sind nur eingeschränkt und transient wirksam oder weisen gelegentlich to- xische Nebenwirkungen auf. In der Regel sind mehrmalige Gaben via Injektionen notwendig - ein Umstand, der angesichts mangelnder Compliance in der “impfmü- den” Bevölkerung immer wieder Probleme aufwirft. In der Tat sind bislang nur we- nige Impfstoffe für eine orale Applikation geeignet.
cProbleme mit Impfstoffen in unterentwickelten Ländernsind ferner eine mangelnde Stabilität (d.h., eine Kühlkette ist erforderlich) und ein zu hoher Preis.
Ein grundsätzliches und viel schwerwiegenderes Problem ist allerdings, daß ge- gen viele der häufigsten Erreger von Infektionserkrankungen bis heute überhaupt keine Impfstoffe existieren.
Aus all diesen Gründen wird deutlich, daß trotz einzelner durchschlagender Er- folge solche Impfstoffe, die im Idealfall billig und hitzestabil sind und einmalig oral appliziert einen effizienten Immunschutz ohne gravierende Nebenwirkungen ver- mitteln, noch auf sich warten lassen. Im folgenden soll jedoch ein Überblick gege- ben werden, welche Entwicklungen und Neuerungen auf dem Gebiet der Impfstoff- entwicklung gegenwärtig zu verzeichnen sind und wie die Impfstoffe der Zukunft auf der Basis dieser Entwicklungen möglicherweise aussehen könnten [weitere Übersichten siehe 1, 6, 13].
Identifizierung und Herstellung protektiver, rekombinanter Antigene
Eine der zentralen Überlegungen bei der Impfstoffentwicklung ist die Frage des cgeeigneten Antigens(Tabelle 2): Welche Bestandteile eines Erregers sollten Teil einer Vakzine sein und welche nicht?
Früher wurden meist ganze attenuierte (z.B. Mycobacterium bovis Bacille Cal- mette-Guerin (BCG), Salmonella) oder abgetötete (z.B. Vibrio cholerae, Bordetella pertussis) Bakterienzellen als Impfstoff eingesetzt. Solche Impfstoffe haben bei den Geimpften u.a. zur Produktion von Antikörpern gegen bakterielle Oberflächenpro- teine geführt, die zwar oftmals immundominant, andererseits jedoch variabel sind, wie z.B. Lipopolysaccharide (LPS). Aufgrund der Mutationsraten der für die Errege- rantigene kodierenden Gene (wie LPS) konnte daher keine breite Schutzwirkung er- zielt werden.
Ein weiterer wichtiger Punkt bei der Suche geeigneter Impfstoffantigene ist die Tatsache, daß nicht alle Antigene von Bakterien in verschiedenen Phasen der Infek- tion produziert (“exprimiert”) werden. Der Grund liegt darin, daß die für diese Fak- toren kodierenden Gene oftmals einer komplexen, durch äußere Stimuli wie Tempe- ratur, Ionenkonzentration etc. “getriggerten” Regulation unterliegen. Das folgende Beispiel soll dies verdeutlichen: Während der nasopharyngealen Schleimhautkolo-
Tabelle 1
Impfstoffe: Ist- und Soll-Zustand
Idealer Impfstoff Derzeit verfügbare Impfstoffe Nebenwirkungsfrei z.T. unerwünschte Nebenwirkungen
Protektiv z.T. eingeschränkt wirksam
Orale Gabe Meist Injektion notwendig
Einmalige Gabe Mehrmalige Gabe notwendig Stabil Mesit nicht stabil (Kühlung notwendig)
Billig Oft teuer
Nasopharyngeale Schleimhautkolonisie- rung durch Meningokokken
cDesign einer Vakzine
Wichtig: Durch Umwelt- und Wirtsfaktoren stimulierte Antigenexpression beachten
Verwendung neuer molekulargenetischer Verfahren und Reportergene:
In vivo - Identifikation möglicher bakterieller Virulenzfaktoren cin vivo expression technology cGFP (Green fluorescent protein)
cBakterielle Virulenzfaktoren
nisierung exprimieren Meningokokken Pili und teilweise eine Kapsel. Allerdings in- vadieren nur die unbekapselten Meningokokken die Mukosa und gelangen somit in die Lamina propria. Bei der weiteren Dissemination in die Blutbahn bzw. in die Meningen kommt es aber wieder zur Kapselexpression, die zur Evasion der Immun- abwehr beiträgt und vor Phagozytose schützt. Demnach werden offenbar zu ver- schiedenen Infektionsphasen (Transmission, Schleimhautkolonisierung, Invasion und Dissemination) verschiedene Antigene exprimiert werden.
Die Kenntnis dieser durch Umwelt- und Wirtsfaktoren stimulierten differentiel- len Antigenexpression der Infektionserreger ist für das rationalec Design einer Vakzine entscheident. Soll eine Vakzine durch die Stimulation sekretorischer IgA- Antikörper primär die Invasion eines Erregers verhindern, so muß gewährleistet sein, daß die Vakzine auch diejenigen Antigene enthält, die bei der Kolonisierung und Invasion exprimiert werden und pathogenetisch relevant sind. Soll hingegen eine Vakzine hergestellt werden, die primär zu einer T-Zellantwort führt, um gegen eine systemische Infektion mit beispielsweise intrazellulären Erregern zu schützen, müssen möglicherweise andere, z.B. zytosolische Antigene wie Hitzestreßproteine [11] in der Vakzine verwendet werden (Tabelle 2).
Durch Verwendung neuer molekulargenetischer Verfahren wie z.B. der „in vivo expression technology“ (IVET) oder Reportergenen wie der Luciferase oder des
„green fluorescent protein“ (GFP) kann heute die Erreger-Genexpression unter in vivo Bedingungen analysiert und somit mögliche Virulenzfaktoren bakterieller Er- reger gezielt identifiziert werden.
Bei der c in vivo expression technologywird z.B. eine Promotor-Fusions-Gen- bank konstruiert, wobei die Promotoren die Expression von Genen steuern, die den Pathogenitätsdefekt einer auxotrophen Bakterienmutante unter in vivo - Bedingun- gen komplementieren. Einfacher funktioniert das c GFP. Hierbei handelt es sich um ein Protein, das stabiles grünes Fluoreszenzlicht emitiert. Bakterien, die das GFP produzieren, leuchten mittels Fluoreszenzmikroskop grün. Wird das GFP so in ein Bakterium kloniert, daß es unter der Kontrolle eines Promotors liegt, der die Ex- pression eines Virulenzfaktors steuert, so kann anhand der grünen Fluoreszenz be- urteilt werden, in welcher Situation (z.B. bei einer Infektion in vivo) das Gen für den Virulenzfaktor (und GFP) eingeschaltet ist.
cVirulenzfaktoren von Bakteriensind z.B.Adhäsine, Invasine, Toxine, Flagellen und Moduline, d.h. Faktoren, die Wirtszellen schädigen (z.B. Toxine), die zur Evasi- on der Immunantwort beitragen (z.B. Moduline), die für die Kolonisierung (z.B. Fla- gellen, Adhäsine), die Invasion (Invasine), das Persistieren oder die Dissemination im Wirt essentiell sind.
Fo rt bildung Neue Impfstoff e
Tabelle 2
Protektive Eigenschaften verschiedener Bakterienantigene in Impfstoffen
Bakterienstruktur Vor (+) - und Nachteile (-) Oberflächen-Antigene (+) Protektive Antikörper möglich
(+) „Immune exclusion“ via sIgA möglich (mukosale Immunität)
(-) Oft variabel, Mutationen (z.B. Lipopolysaccharide) Zytosolische Antigene (+) Protektive T-Zellantwort möglich
(-) Oft keine protektive Antikörperantwort (-) Wahrscheinlich keine mukosale Immunität (+/-) Meist konserviert, kaum Mutationen
(Hitzestreßproteine) (-) Autoimmunität ??
Virulenzfaktoren (+) In vivo exprimiert
(+) Keine Mutationen, da Selektionsdruck im Wirt
als Bestandteil von Impfstoffen
cImmunogene oder immun- dominante Virulenzfaktoren
cSelektierte rekombinante Antigene
Impfstoffe mit rekombinanten Antigenen sollten spezifischer, effizienter und mit weniger Nebenwirkungen behaftet sein
cKlassische Adjuvantien:
Aluminiumhydroxid oder -phosphat
cNeuere Adjuvantien
Neuere Adjuvantien führen zu einer sehr gezielten Stimulierung der Immunantwort
cInterleukin-12
cAluminiumverbindungen
außerordentlich sinnvoll, da diese Faktoren für die Pathogenität eines Erregers in vivo essentiell sind; ohne sie wären die Erreger apathogen, d.h. nicht in der Lage, eine Infektionserkrankung auszulösen. Sind die Virulenzfaktoren darüber hinaus auch c immunogenoder c immundominant, so sollten sie als rekombinante Anti- gene in Impfstoffen verwendet werden: Eine Mutation im Gen eines Virulenzfaktors, die zu einer Veränderung von dessen Immunogenität führen könnte, würde sehr wahrscheinlich gleichermaßen die Pathogenität des Erregers, d.h. die Wirkung eines Virulenzfaktors attenuieren. Ein weiterer Vorteil der Verwendung c selektierter re- kombinanter Antigeneist die Aussparung toxischer Antigene, die in Ganzzellvakzi- nen und Spaltvakzinen vorkommen können. Insofern sollte ein Impfstoff mit re- kombinanten Antigenen nicht nur spezifischer und effizienter, sondern wahrschein- lich auch mit weniger Nebenwirkungen behaftet sein.
Die Fortschritte der molekularen Genetik und Gentechnologie in den vergange- nen 10 Jahren haben dazu geführt, daß die Pathogenese einzelner Infektionserkran- kungen auf molekularer Ebene genauestens analysiert und immundominante Anti- gene identifiziert und kloniert wurden. Andererseits wurden effiziente Methoden zur Produktion rekombinanter Antigene entwickelt und verfahrenstechnisch in der Biotechnologie umgesetzt. Gleichwohl sind für viele Infektionserreger noch große wissenschaftliche Anstrengungen bis zur Identifikation relevanter Antigene, die sich als Bestandteile von Impfstoffen eignen, notwendig.
Neue Adjuvantien zur gezielten Immunstimulation
Bei einem Adjuvans handelt es sich um denjenigen Teil eines Impfstoffs, der dem Antigen beigemischt wird, um die Immunogenität des Antigens bzw. die Effizienz der Wirtsimmunantwort gegen das Antigen zu verstärken.c Klassische Adjuvanti- en, die bislang überwiegend in Impfstoffen Verwendung finden, sind z.B. Alumini- umhydroxid oder Aluminiumphosphat. Nachteil dieser Adjuvantien sind mögliche toxische Nebenwirkungen sowie die oftmals wenig definierte Art und Weise ihrer immunstimulatorischen bzw. immunmodulatorischen Eigenschaften.
c Neuere Adjuvantien [9] (Tabelle 3) wie Saponine (immunstimulierende Komplexe (ISCOM), Quil-A), nicht ionische Block-Copolymere (TiterMax), oder re- kombinante Zytokine wie Interleukin-2, Interleukin-12, Interleukin-1 oder Inter- feron-γhaben den Vorteil, daß sie zumindest teilweise eine ebenso gute immunsti- mulierende Wirkung haben und eine effizientere Immunantwort gegen das Antigen hervorrufen. Insbesondere jedoch führen sie zu einer viel gezielteren Stimulierung der Immunantwort.
Neuere Ergebnisse dokumentieren, daß c Interleukin-12als Adjuvans gezielt eine T-Helfer 1 Immunantwort stimuliert, während c Aluminiumverbindungen eher eine TH2 Antwort fördern. Dies ist für die Induktion einer protektiven Immunant-
Tabelle 3
Neue Adjuvantien in Impfstoffen
Substanz Mukosal applizierbar
Saponine x
• Immunstimulierende Komplexe (ISCOMs)
• Quil A
Nicht-ionische Block-Copolymere Rekombinante BCG
Muramyldipeptid
Interleukine (z.B. IL-2, IL-12) (x)
Inteferon-γ (x)
Pertussistoxid (x)
Rekombinantes Choleratoxin (CT) x
Rekombinantes Enterotoxin von E. coli (LT) x
DNA (CpG-Dinukleotide)
cT-Helferzellantwort:
2 Qualitäten
cOrale Applikation von rekombinanten Zytokinen
Eine lokale Immunantwort sollte am Ort der Erregerinvasion (Mukosa) erzeugt werden Am Ort der mukosale Stimulation wird die stärkste lokale Immunantwort ausgelöst Oral oder nasal applizierbare Vakzine werden angetrebt
cSpezifische mukosale Adjuvantien:
• Enterotoxin
• Choleratoxin
• Zonula-occludens Toxin sowie
• ISCOM (Immunstimulierende Komplexe)
wort von grundsätzlicher Bedeutung. In den vergangenen 10 Jahren wurde klarge- stellt, daß die c T-Helferzellantwort 2 verschiedene Qualitäten aufweisen kann:
CD4+ T-Helfer 1 - Lymphozyten produzieren typischerweise Interferon-γund Inter- leukin-2 und vermitteln deshalb zellvermittelte Immunantworten, die für die Pro- tektion v.a. gegen intrazelluläre Erreger wichtig sind. Die sogenannten T-Helfer 2 Lymphozyten produzieren vor allem Interleukin-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 und verstärken insbesondere humorale Immunantworten, die bei der Abwehr von extra- zellulären Erregern und Parasiten von Bedeutung sind.
Entgegen aller Erwartungen konnte sogar gezeigt werden, daß c rekombinante Zytokine auch oral appliziertwerden können, um eine Immunantwort des Mukosa- assoziierten Immunsystems bei gleichzeitig geringeren systemischen Nebenwir- kungen gezielt zu stimulieren.
Mukosal - applizierbare Adjuvantien
Die Mehrzahl aller Infektionserreger invadiert den Wirt über die Mukosa (Atemwe- ge, Gastrointestinaltrakt, Genitaltrakt). Ein idealer Impfstoff sollte daher eine lokale Immunantwort vornehmlich am Ort der Erregerinvasion (Mukosa) erzeugen [12].
Neuere Erkenntnisse auf dem Gebiet der Mukosaimmunologie haben gezeigt, daß üblicherweise am Ort der mukosalen Stimulation (afferenter Schenkel der mukosa- len Immunantwort) i.d.R. auch die stärkste lokale Immunantwort (efferenter Schen- kel der mukosalen Immunantwort) ausgelöst wird. Diesen Erkenntnissen Rechnung tragend sowie aus Gründen der einfacheren Applikationsweise ist es wünschens- wert, zukünftig oral oder nasal applizierbare Vakzine zu entwickeln.
Auf der Basis dieser Rationale wurden eine Reihe c spezifischer mukosaler Ad- juvantien entwickelt [12, 13] (Tabelle 3). Neben den bereits erwähnten Zytokinen sind hier u.a. Choleratoxin, hitzelabiles Enterotoxin von Escherichia coli, Zonula- occludens-Toxin sowie immunstimulierende Komplexe (ISCOM) zu erwähnen. Ein oraler Impfstoff mit den vorgenannten Substanzen als Adjuvants sollte insbesonde- re in der Lage sein, neutralisierende, sekretorische Immunglobulin A-Antikörpe- rantworten auszulösen, um einen protektiven Immunschutz im Sinne einer “Immu- nexclusion” zu erzeugen. Andererseits ist bislang nur unzureichend untersucht, in- wieweit sekretorische IgA-Antikörper tatsächlich einen lang anhaltenden Immun- schutz gegen Infektionserreger vermitteln.
Impfstoffträgersysteme
Impfstoffträgersysteme sollen das Antigen möglichst gezielt und langsam freiset- zen, um eine effiziente Immunantwort gegen das in einem Impfstoff enthaltene An- tigen zu erzielen. Es gibt heute eine Reihe sowohl lebender als auch abgetöteter mi- krobieller Trägersysteme sowie verschiedene synthtetische Trägermoleküle (Tabelle 4).
Um zu verhindern, daß Antigen und Adjuvans bei einer oralen Applikation durch Magensäure oder Enzyme des Verdauungstraktes inaktiviert werden, wurden eine Reihe neuer Trägersysteme entwickelt, die es erlauben, einen Impfstoff zu “ver- packen” und auch via mukosale Oberflächen effizient zu applizieren.
Fo rt bildung Neue Impfstoff e
Tabelle 4
Neue Trägersysteme für Impfstoffe
• Biodegradierbare polymere Mikrosphären (Poly- (D,L-Laktid-o-Glykolid)
• Liposomen
• Immunstimulierende Komlexe (ISCOMs)
• Proteosomen
• Attenuierte rekombinante Bakterien (Salmonellen,Vibrio)
• Attenuierte rekombinante Viren (Adenovirus,Vacciniavirus)
• Bakterielle „Ghosts“
cImmunstimulierende Komplexe:
Auslösen von MHC-Klasse I-restringierten zytotoxischen CD8-T-Zellantworten
cBakterielle “ghosts”
„Ghosts“ möglicherweise als stabile Träger mit immanenter Adjuvansaktivität zur mukosalen Immunisierung
cLebende attenuierte Bakterien oder Viren als Träger für heterologe Antigene
Beispiel: Helicobacter pylori
cLive carrier vaccines Neuere Vakzine sind subtiler
gentechnologisch manipuliert
Studien zur Erprobung neuer Trägersysteme und rekombinanter Antigene
Partikel wie Hydroxylapatit (Tabelle 4). c Immunstimulierende Komplexe (ISCOMs), die aus Quil A (adjuvansaktives Extrakt aus der Rinde eines südamerika- nischen Baumes), Cholesterol, Phosphatidylcholin und dem gewünschten Antigen (i.d.R. ein Peptid) zusammengesetzt sind, haben ferner den Vorzug, daß sie ein An- tigen in das Zytosol einer Zelle schleusen können und auf diese Weise MHC- Klasse I-restringierte zytotoxische CD8-T-Zellantworten auslösen.
Ob die kürzlich beschriebenen c bakteriellen “ghosts”beim Menschen einge- setzt werden können, muß sich noch erweisen. Bei bakteriellen “ghosts” handelt es sich um Bakterien, die durch Phagentoxine zerstört wurden. Solche Bakterien ohne Zytosol, also “leere” Bakterienhüllen (ghosts), werden mit einem heterologen Antigen beladen und können möglicherweise als stabile Träger mit immanenter Adjuvans- aktivität auch zur mukosalen Immunisierung eingesetzt werden.
Eine andere Strategie besteht darin,clebende attenuierte Bakterien oder Viren als Träger für heterologe Antigene zur Immunisierung einzusetzen [4,10]. Hierbei wird z.B. ein Gen eines Infektionserregers (z.B. Helicobacter pylori) in einen attenu- ierten Salmonellenstamm überführt und dort zur Expression gebracht (Abb. 1).
Wird dieser attenuierte Salmonellenstamm oral appliziert, wird er in die Peyerschen Plaques aufgenommen und setzt dort eine Immunantwort gegen das heterologe An- tigen von H. pylori in Gang. Der Geimpfte sollte daraufhin gegen eine H. pylori-In- fektion immun sein.
Abb. 1 mPrinzip der Herstellung eines lebenden Impfstoffträgers (live carrier vaccine). Die Virulenz des bakteriellen Impfstoffträgerstammes (hier: Salmonella oder Yersinia) wird durch Veränderung der Viru- lenzgene attenuiert. Es resultiert ein apathogener Impfstamm. Sodann wird in diesen attenuierten Impf- stamm ein Gen desjenigen Erregers (hier: H. pylori) eingeführt und als Antigen (hier: Urease von H. pylo- ri) exprimiert, gegen das beim Geimpften eine Immunantwort ausgelöst werden soll. Im Idealfall wäre der Geimpfte durch die entstehende Immunantwort (z.B. Produktion Urease-spezifischer Antikörper) ge- gen eine Infektion mit H. pylori geschützt
In Tiermodellen konnten derartige Impfstoffe bereits mit Erfolg eingesetzt wer- den [4]. Die in der Vergangenheit in klinischen Phase 1 bis Phase 3-Studien geteste- ten c “live carrier vaccines”mit Salmonella oder Vibrio cholerae haben jedoch nicht die Erwartungen erfüllt [3]. Die “Zweitgeneration”-life carrier vaccines, die subtiler gentechnologisch manipuliert sind, sollten allerdings stabiler sein und daher bessere klinische Ergebnisse liefern.
Die Verwendung neuer Trägersysteme und rekombinanter Antigene wurde für einzelne Impfstoffe bereits klinisch erprobt. Kürzlich wurde in einer Studie aus Lau- sanne berichtet, daß die mukosale Applikation eines attenuierten Salmonella typhi - Stammes, der das Gen für ein Hepatitis B-Virus-Core-Pre-S Protein trägt, sicher ist [10]. Gegen das heterologe Hepatitis B-Virus-Protein konnte allerdings bei nur ei- nem der Probanden eine Immunantwort erzielt werden. Die mukosale Applikation ei-
cOrale Applikation von Liposomen cNeue Pneumokokkenvakzine
cOrale Immunisierung mit einer rekombinanten Urease von Helicobacter pylori
cKurativer Einsatz von Vakzinen
DNA-Vakzinierung erzeugt stärkere, breitere und länger andauernde Immunant- worten als herkömmliche Impfstoffe cEukaryontisches Expressionsplasmid
nes attenuierten Salmonella typhimurium-PhoPc-Stammes, der das L1-Hauptkap- sidprotein von humanen Papillomaviren (HPV 16) exprimiert, löste hingegen eine effiziente Immunantwort inklusive sekretorischer IgA-Antikörper im Vaginalsekret geimpfter Tiere aus. Ob dies auch beim Menschen der Fall ist, muß weiter untersucht werden.
Durch die c orale Applikation von Liposomen mit Streptococcus mutans-Gly- kosyltransferase Antigen kann bei Kindern eine mukosale systemische Immunant- wort inklusive der sekretorischen IgA2-Antikörperproduktion im Speichel erzeugt werden. Ferner könnten c neue Pneumokokkenvakzine, bei denen äußere Mem- branproteine mit Konjugaten sowie rekombinante Antigene wie Pneumolysin, PspA (pneumococcal surface protein A), PsaA (pneumococcal surface adhesion pro- tein A) und Autolysin verwendet werden, effizienter als die bislang zur Verfügung stehenden Vakzine sein.
Eine klinische Studie bei gesunden Individuen in Lausanne zeigte zudem, daß die c orale Immunisierung mit einer rekombinanten Urease von Helicobacter pylori sicher ist und Immunantworten bei Geimpften hervorruft. Da bereits bei Katzen eine therapeutische Immunisierung mit Helicobacter pylori gegen eine vorbeste- hende Helicobacter spp.-Infektion wirksam war, kann man vermuten, daß bald eine wirksame Helicobacter Vakzine zur Verfügung stehen sollte, die sowohl prophylak- tisch als auch möglicherweisec kurativ eingesetztwerden kann.
Genetische Immunisierung mit DNA
Seit einigen Jahren wird in vielen Laboratorien an der Entwicklung der DNA-Im- munisierung (Synonym: Genetische Vakzinierung, Vakzinierung mit “nackter”
DNA) gearbeitet [2,5]. Eine DNA-Vakzinierung erzeugt wesentlich stärkere, breitere und länger andauernde Immunantworten als herkömmliche Impfstoffe. Bei der DNA-Vakzinierung wird ein c eukaryontisches Expressionsplasmidentweder in physiologischer Kochsalzlösung (Immunisierung mit nackter DNA) oder an Lipide, Liposomen oder Goldpartikel gekoppelt appliziert. Ein solches eukaryontisches Ex- pressionsplasmid (Abb. 2) enthält das Gen, welches für bakterielle oder virale Anti-
Fo rt bildung Neue Impfstoff e
Abb. 2 bPrinzipieller Aufbau einer DNA-Vakzine.
Es handelt sich um einen eukaryontischen Expressions- vektor, d.h. um ein Plasmid, welches von Wirtszellen (z.B. dendritische Zellen, Muskelzellen) aufgenommen wird und dessen Gene, je nach dem Vorhandensein ge- eigneter Promotoren, transkribiert und translatiert wer- den. Ein Teil der auf dem Plasmid lokalisierten Gene wie das Ampicillin-Resistenzgen (ampR) werden nur in Bak- terienzellen, d.h. beim Herstellungsprozeß (Klonierung, Vermehrung) exprimiert, andere Gene werden im Wirt exprimiert (Gene für Antigen und Immunmodulation) ISS = immunstimulierende Sequenzen (z.B. CpG Motive);
IMS = immunmodulierende Sequenzen (z.B. Gene für Zytokine oder co-stimulatorische Moleküle)
gene kodiert. Weiter sind DNA-Abschnitte wie etwa ein Promotor für die effiziente Transkription des Antigen-Gens sowie verschiedene andere Gensequenzen, die für den Herstellungsprozess der DNA-Vakzine benötigt werden (z.B. die Klonierung, Vermehrung und Selektion in Bakterien), vorhanden.
Nach der intramuskulären, subkutanen oder intradermalen Applikation wird die DNA in Wirtszellen (Muskelzellen, Antigen-präsentierende Zellen) aufgenom- men und das Gen, welches für das Antigen kodiert, transkribiert, translatiert und das Antigen über MHC-Klasse 1- und MHC-Klasse 2-Moleküle an CD-4 und CD-8 T- Zellen präsentiert (Abb. 3). Weiterhin kann das in Wirtszellen synthetisierte Antigen auch effizient B-Zellen stimulieren, so daß es zur Produktion hoher Antikörpertiter kommt.
cMukosale Applikation von DNA
cZweite Generation DNA-Vakzine:
Auf dem Expressionsplasmid ist zusätzlich ein Gen für ein Adjuvans einkloniert
Verschiedene neuere Arbeiten zeigen ferner, daß es möglich ist,c nackte oder an Liposomen gekoppelte DNA auch mukosal (oral, intranasal, intratracheal) zu ap- plizieren. Solche Vakzine können, wie in zahlreichen tierexperimentellen Studien bereits gezeigt wurde, eine effiziente Immunität gegen Influenzaviren, Hepatitisvi- ren, gegen Bakterien wie Borrelien, Mykobakterien und Yersinien, aber auch gegen Pa- rasiten wie Leishmanien oder Toxoplasma gondii erzeugen. Beim Menschen gibt es bereits eine erste klinische Phase 1- Studie bei HIV-infizierten Patienten in den USA.
Interessanterweise gibt es auch bereits eine c zweite Generation DNA-Vakzine, bei der auf dem eukaryotischen Expressionsplasmid neben dem Gen für das Anti- gen ein Gen für ein Adjuvans (wie Interleukin-2, Granulozyten-Makrophagen-Kolo- nie-Stimulierender Faktor) oder für ein co-stimulatorisches Molekül (CD80, CD86) einkloniert wurde, um die Immunantwort gezielt zu stimulieren [14,7] (Abb.4).
Andererseits induziert die Mehrzahl der DNA-Vakzine neben einer zytotoxischen T-Zellantwort insbesondere TH1-Immunantworten. Dies könnte damit zusammen- hängen, daß bakterielle DNA, v.a. die darin enthaltenen CpG-Dinukleotidmotive, eine immunstimulierende Wirkung haben und zur Zytokinausschüttung (v.a.
TNF-α, IL-12, IL-6) führen kann, die die Entwicklung einer TH1-Antwort fördert und eine TH2-Antwort hemmt [8].
einer Immunantwort. Das im Wirt endogen synthetisierte Antigen wird sowohl via MHC- Klasse I- und II- Moleküle für CD8- und CD4-T-Zellen präsen- tiert. Ferner kommt es zur B-Zellstimulation mit Antikör- perproduktion
Abb. 4 bNeben dem Gen für das Anti- gen können Gene für die Immunmo- dulation (z.B. Stimulation) in die DNA-Vakzine einkloniert werden (hier: Zytokine). Die produzierten Zytokine könnten autokrin und para- krin die Art der gegen das Antigen entstehenden Immunantwort (z.B. TH1- oder TH2-Antwort) gezielt modulieren
cVorteile der DNA-Immunisierung:
• Niedrige Produktionskosten
• Lang anhaltende Immunität
• Breite Immunität
• Hitzestabilität
• Für Immunkompromitierte/ Schwangere
Autoimmunreaktionen, Immunkomplexe und Entzündungsreaktionen noch unbekannt
cMaligne Transformation der Zelle:
Risiko muß geklärt werden
cSchwangerschaftsverhütung und Autoimmunkrankheiten cTumorspezifische Antigene
cVorteile der DNA-Immunisierungsind sicherlich die niedrigen Produktions- kosten, die lang (evtl. lebenslang) anhaltende Immunität, die breite Immunität (T-Helferzellen, zytotoxische T-Zellen, Antikörper), die Hitzestabilität, sowie der Umstand, daß es sich um einen Totimpfstoff handelt, der auch bei immunkompro- mitierten Patienten und Schwangeren eingesetzt werden kann (Tabelle 5). Verschie- dene Bedenken hinsichtlich der Sicherheit von DNA-Vakzinen werden jedoch bis zu deren Klärung eine Anwendung in der Humanmedizin verzögern. So ist nicht be- kannt, ob eine langandauernde Antigenexpression durch die in vivo transfizierten Zellen nicht etwa zu Autoimmunreaktionen, Immunkomplexen und Entzündungs- reaktionen führen könnte. Ferner könnte eine Anti-DNA-Vektorimmunität eine mehrmalige DNA-Immunisierung unmöglich machen. In der Tat wurde von der Bil- dung von anti-DNA Antikörpern bereits berichtet.
Das gravierendste Problem hinsichtlich der Impfsicherheit ist jedoch die Mög- lichkeit, daß das Plasmid in das Wirtschromosom integrieren und zu einer c mali- gnen Transformation der Zelleführen könnte. Obgleich hierfür experimentell noch keine Evidenz erbracht worden ist, müssen doch weitere Studien mit Langzeitversu- chen durchgeführt werden, um zu klären, ob diese Risikobedenken ausgeräumt werden können oder nicht.
Für besonders Interessierte sei ferner angemerkt, daß man sich sogar via Inter- net unter http://www.genweb.com./DNAvax/Announce/apollon95.html” auf dem neuesten Stand über DNA-Vakzinierungsstudien etc. halten kann.
Fo rt bildung Neue Impfstoff e
Tabelle 5:
Vor- und Nachteile verschiedener Impfstrategien
Lebendimpfstoffe Totimpfstoffe
Attenuierter Attenuierter Erreger Ganzzellvakzine Proteine DNA
Erreger + heterologes Antigen Spaltvakzine
Zytotoxische T-Zell-Antwort + + - - +
T-Helferzellantwort + + + + +
Vakzine mit allen Erreger- Antigenen + - + - -
Vektorimmunität - + - - ?
Sicher bei Immundefizienz - - + + +
Reversionsrisiko + + - - -
Wirksamkeitseinschränkung
durch maternale Antikörper + + + + -
Leicht produzierbar - - + - +
Hitzestabil - - -/+ - +
Preiswert - - +/- - +
Zuletzt sollte noch angemerkt sein, daß Impfstoffe nicht nur zur Prävention von Infektionserkrankungen eingesetzt werden können, sondern möglicherweise auch in der c Schwangerschaftsverhütung oder in der Therapie von Autoimmunkrank- heiten eine Bedeutung erlangen könnten. Kürzlich wurde sogar gezeigt, daß eine DNA-Vakzine sogar Immunität gegen Tumoren wie B-Zell-Lymphome vermitteln kann [14]. Dies ist jedoch nur dann der Fall, wenn cTumorspezifische Antigene (wie im experimentellen Modell eines B-Zell-Lymphoms) existieren und bekannt sind.
4. Welche Komponenten des Immunsystems werden durch Impfung mit nackter Plasmid DNA (genetische Vakzinierung) stimuliert, welche Immunantworten resultieren ?
T Zellen und B Zellen. Immunatwort v.a. durch T Helfer-1 Zellen, zytotoxische T Zellen, Antikörper.
5. Könnte eine DNA Vakzine bei abwehrgeschwächten Patienten eingesetzt werden?
Ja, DNA ist ein Totimpfstoff.
Fragen und Antworten zur Erfolgskontrolle
1. Welche Gründe sprechen dafür, bakterielle Virulenzfaktoren als Antigene in einem Impfstoff zu verwenden?
Expression unter in vivo Bedingungen (z.B. bei einer Infektion).
Selektionsdruck macht Mutation unwahrscheinlich.
2. Welche Adjuvantien stimulieren gezielt eine T Helfer-1 Immunantwort gegen das Impfstoffantigen?
Immunstimulierende Komplexe (ISCOMs), Interleukin-2, Interleukin-12.
3. Welchen Vorteil haben attenuierte Salmonellen als live carrier vaccines?
Orale Applikation möglich. Gezielte Aufnahme in die Peyerschen Pla- ques via M Zellen mit Stimulation des Mukosa-assoziierten Immun- systems. Stabile “Verpackung”der heterologen Antigens auf der Schleimhaut.
cTransgene Pflanzen für die Impfstoffentwicklung: Zukunft?
Zusammenfassend läßt sich somit feststellen, daß wir trotz des Einsatzes rekom- binanter Antigene, neuer Adjuvantien und Trägersubstanzen sowie der eleganten DNA-Immunisierung gegenwärtig von einer Idealvakzine, welche billig, sicher, hit- zestabil sowie oral möglichst nur einmalig appliziert werden muß, um protektiv zu sein, noch weit entfernt sind. Jede der hier diskutierten Impfstrategien hat verschie- dene Vor- und Nachteile, die in Tabelle 5 nochmals gegenübergestellt sind.
Obgleich es zur Zeit noch sehr spekulativ scheint, könnten jedoch möglicher- weise c transgene Pflanzen(z.B. eine Banane, die ein oder mehrere Antigene eines Infektionserregers exprimiert) [6], einen Ausweg aus dem gegenwärtigen Dilemma der Impfstoffentwicklung weisen und billige, leicht zu “applizierende” Impfstoffe mit individueller “Geschmacksnote” der Zukunft werden.
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