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The identification and
characterization of TMX3: a novel thioredoxin-like transmembrane protein of the endoplasmic
reticulum
Doctoral Thesis Author(s):
Haugstetter, Nicolas Johannes Publication date:
2007
Permanent link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-005396924 Rights / license:
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Diss. ETH No. 17075
The Identification and Characterization of TMX3 - a Novel Thioredoxin-Iike Transmembrane Protein of the
Endoplasmic Reticulum
A dissertation submiUed to ETH ZURleH
for the degree of Doctor of Natural Sciences
presented by
Nicolas Johannes Haugstetter Dip!. Natw. ETH, ETH Zurich
born 19.07.1976
cltlzen of Lucerne / LU and Winterthur / ZH
Examiner: Prof. Dr. Ari Helenius Co-examiner: Prof. Dr. Rudolf Glockshuber Co-examiner: Assoe. Prof. Dr. Lars Ellgaard
2007
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Summary
The formation of native disulfide bonds is critical for the correct folding of a large number of proteins synthesized in the endoplasmic reticulum (ER). The introduetion of biosynthetie disulfide bonds in ER-resident proteins and secretory proteins is catalyzed by enzymes of the protein disulfide isomerase (PD!) family, In this thesis, the identification and characterization of TMX3 (thioredoxin-related transmembrane protein 3), a novcl member of the human PDI family, is described. The TMX3 gene encodes a protein of 454 amino acid rcsidues that contains a predicted N-tcrminal signal sequencc, an ER-Iuminal region comprising approximately 350 amino acid residues followed by a potential transmembrane region and about 50 residues facing the cytosol.
At the C-terminus TMX3 contains a KKKD tetrapeptide sequence that matches the classical KKXX-type consensus sequence for ER retrieval of type I transmembrane protcins.
The TMX3 transcript was found in a variety of tissues and is not upregulated by the unfolded protein response (UPR). In line with this, RNAi-mediated dcpletion of TMX3 in the nematode Caenorhabditis elegans does neither induce the UPR, nor any phenotypic change. Endogenous TMX3 in tissue-eulture cells contains endoglycosidase Hssensitive glycans, localizes to the ER by immunofluorescence microscopy, and is present in the membrane fraction after alkaline extraetion ofthe ER luminal eontent. In vivo TMX3 is found partially in the oxidized form, giving TMX3 the potential to aet as a cellular oxidase, reductase or isomerase,
The redox potential of the recombinantly expressed luminal region of TMX3 was determined to be -157 mV, similar to the values previously found for PDI and the ER-oxidoreductase ERp57. All dornain constructs ofTMX3 show oxidase activity towards a model pcptide substrate, although with slightly different reaction kinetics. In tenns ofreaetion kinctics with GSSG, TMX3 is comparable to human POL
Employing limited proteolysis and sequcnce analysis it was shown that the ER- luminal region ofTMX3 contains three thiorcdoxin-Iike domains, an N-tem1inal redox- active domain (a) with a CGI-IC active-site sequence, followed by two enzymatically inaetive dornains (b and b'). Using the recombinantly cxpressed TMX3 a, abandabb' domain construets, we havc compared struetural stability and enzymatie properties.By CD and NMR spectroscopy, the reduced a domain shows features typical of a properly foldcd domain. Whereas it is markedly destabilized upon oxidization, inter-domain stabilization by the b domain renders the a domain more resistant towards chcmical denaturation and proteolysis. Molecular modeling ofTMX3 abb'reveals a hydrophobie pateh - potentially involved in substrate interaction - in the vieinity of the active-
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site cysteines. The results presented here provide asolid framework for understanding the relation between the rnultidomain structure of TMX3 and its function as a redox enzyme.
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Zusammenfassung
Die Bildung von Disulfidbrücken ist für die korrekte Faltung vieler Proteine des Endoplasmatischen Retikulums (ER) essentiell. Die Verknüpfung derjenigen Cysteine die im nativen Protein Disulfidbrücken ausbilden, wird durch Enzyme der Proteindisulfidisomerase-Familie (POL-Familie) katalysiert, Im Rahmen dieser Dissertation wird die ldentifkation und Charakterisierung von TMX3 (Thioredoxin verwandtes Transmembranprotein) beschrieben; einem neu entdeckten Mitglied der PDI-Proteinfamilie des humanen ERs. Das TMX3-Gen codiert ein Pro tein von 454 Aminosäuren für welches computer-gestützte Sequenzanalysen folgende Eigenschaften voraussagen: an seinem Amino-Terminus besitzt TMX3 ein Signalpeptid, gefolgt von ungefähr 350 Aminosäureresten welche den intralumenalen Teil bilden, einer Transmembranregion und etwa 50 Aminosäuren die ins Cytosol ragen. An seinem Carboxyl-Terminus besitzt TMX3 eine KKKD-Tetrapcptidesequenz, die dem KKXX- Motiv entspricht das typischerweise für Typ l-Transmembranproteine ER-Lokal isation vermittelt,
TMX3 codierende Transkriptc wurden in diversen menschlichen Geweben gefunden. Die Menge der TMX3·Transkripte bleibt unverändert unter Bedingungen die zur Akkumulation von ungefalteten und aggregierten Proteinen im ER und einer entsprechenden zellulären Reaktion (UPR) führen. Ebenso führte die durch RNA- Interferenz gehemmte Expression von TMX3 im Nematoden Caenorhabditis elegans weder zur Auslösung der UPR, noch zu einem veränderten Phenotyp. Endogenes TMX3 in Gewebekulturzellen besitzt Oligosaccharide die mit dem Enzym Endoglycosidase H gespalten werden können, und wurde mittels Immunftuoreszenz-Mikroskopie im ER lokalisiert. Die vorausgesagte Membranständigkeit konnte gezeigt werden, indem ER in einen lösliche und einen unlöslichen Anteil aufgetrennt wurde, wobei TMX3 in einer Fraktion mit unlöslichen Proteinen gefunden wurde.In vivo liegt TMX3 teilweise oxidiert vor und hat daher das Potential als zelluläre Oxidase, Reduktase oder lsomerasc zu wirken.
Das Redoxpotential des intraluminalen Teils von TMX3 wurde auf -157 mV bestimmt was dem Redoxpotential der mit TMX3 verwandten Proteine POL und ERp57 sehr ähnlich ist. Sämtliche Domänenkonstrukte zeigen Oxidaseaktivität gegenüber einem Pcptidsubstrat, allerdings mit verschiedenen Reaktionskinetiken. Die Reaktionsgeschwindigkeit von GSSG mit TMX3 ist vergleichbar mit derjenigen mit POL
Wie dureh limitierte Proteolyse und durch Sequenzanalyse gezeigt werden konnte, besteht der ins ER-Lumen hineinragende Teil von TMX3 aus drei Domänen mit struktureller Ähnlichkeit zu Thioredoxin, Die amino-terminale a-Domäne beinhaltet
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die redox-aktive Aminosäuresequenz CGHC, während die zwei carobxyl-terminalen Domänen (b und b') keine enzymatische Aktivität besitzen. Die rekombinant hergestellten Domänenkonstrukte TMX3 a,ab und abh' wurden einer Stabilitätsanalyse gegenüber chemischer Denaturierung und einer Charakterisierung der enzymatischen Aktivität unterzogen. Während das Protein TMX3 a im reduzierten Zustand CD- und Nlvlk-spektroskopische Eigenschaften eines gefalteten Proteins aufweist, führt die Oxidation von TMX3 a zu einer erheblichen Destabilisierung der Struktur. Diese Destabilisierung der a-Domäne, die durch die Ausbildung der Disulfidbrücke im der aktiven Zentrum verursacht wird, ist erheblich kleiner in Anwesenheit der b-Domäne, die auch gegenüber Proteasen eine erhöhte Stabilität vermittelt. Ein molekulares Modell der drei Domänen von TMX3, zeigt einen hydrophoben Bereich im Umfeld der redox- aktiven Cysteine, der möglicherweise eine Rolle bei der Interaktion mit Substraten spielt. Die hier präsentierten Resultate bilden die Grundlage zum Verständnis des Zusammenhangs zwischen der Multidomänenorganisation von TMX3 und dessen Funktion als redox-aktives Enzym.
