Introduction
La pomme de terre, originaire d’Amé- rique du Sud, est une des espèces vi- vrières importantes de notre planète.
Selon le CIP (Centre international de la pomme de terre), elle occupe la troi- sième place après le blé et le riz (CIP, 2008). Elle se cultive sous toutes les la- titudes et dans des conditions clima- tiques variées, allant des plaines sub- tropicales aux régions montagneuses arides. Dans de nombreux pays en dé- veloppement, la pomme de terre consti- tue la source alimentaire principale (ou secondaire) en raison de son apport énergétique et de son rendement relati- vement stable dans des conditions qui pourraient être fatales à d’autres cul- tures (FAO, 2008).
En Suisse, la culture in vitro de la
pomme de terre (S. tuberosum L.) est couramment utilisée dans le domaine de la biotechnologie appliquée à l’agri- culture comme moyen d’élimination des maladies virales (Lê et Collet, 1985), comme alternative pour la conservation ex situ des ressources génétiques des pommes de terre (Lê, 2002) ou encore comme technique de multiplication ra- pide de plants de haute qualité sanitaire (Reust et Lê, 1985).
Pour la production de plants de pomme de terre, l’utilisation des microplantes produitesin vitroreprésente un progrès important pour la constitution de maté- riel de qualité (Lê, 1991), mais leur transfert dans le cycle normal de cul- ture nécessite un investissement consi- dérable en main-d’œuvre qui renchérit les travaux de mise en place de matériel de base. La production de microtuber-
culesin vitrode qualité améliorée quant à la robustesse du plant permettrait d’offrir ainsi un moyen sûr et économi- quement intéressant de reproduction de semences de haute qualité.
Dans ce travail sont exposés les résul- tats d’essais portant sur l’effet du mode de tubérisation en milieu contrôlé sur la qualité des pommes de terrein vitro.
Matériel et méthodes
Le matériel végétal utilisé dans ce travail comprend dix génotypes de la liste suisse des variétés de pommes de terre 2009 (Schwärzelet al., 2008) représentant diffé- rents groupes de précocité. Sa reproduction in vitroest assurée par des cultures qui sont réinitialisées toutes les quatre semaines, selon le protocole décrit auparavant par Lê (1991).
S c h w e i z e r i s c h e E i d g e n o s s e n s c h a f t C o n f é d é r a t i o n s u i s s e
C o n f e d e r a z i o n e S v i z z e r a C o n f e d e r a z i u n s v i z r a
Station de recherche Agroscope Changins-Wädenswil ACW Directeur: Jean-Philippe Mayor •www.acw.admin.ch
Production de microtubercules de pomme de terre in vitro
C.L. LÊ et D. THOMAS, Station de recherche Agroscope Changins-Wädenswil ACW, CP 1012, 1260 Nyon E-mail: cong-linh.le@acw.admin.ch
Tél. (+41) 22 36 34 422.
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Résumé
Une technique de production de microtubercules in vitroa été développée pour les variétés cultivées de pomme de terre (Solarum tuberosum L.). Des seg- ments uninodaux prélevés sur des microplantes de pomme de terre propagées in vitroselon Lê (1991) sont utilisés comme explants initiaux. Ces explants ont été placés dans un récipient de culture conte- nant des solutions nutritives appropriées à chaque étape du processus de tubérisation (croissance, in- duction et tubérisation) en vue de favoriser la forma- tion de tubercules en milieu contrôlé. Dans ces conditions de culture, la qualité des microtubercules a pu être améliorée en termes de nombre, de taille et de poids, permettant ainsi la production de matériel d’un calibre supérieur indispensable à la plantation aux champs.
Microtubercules de la variété Victoria produitsin vitro.쑱
Le procédé de tubérisationin vitroconsiste à soumettre les microplantes de pomme de terre à deux différentes phases de culture:
Croissance in vitro
Cette phase de croissance vise à obtenir un développement optimal des structures végé- tatives nécessaires à la réception des stimuli inducteurs de la tubérisation (Hannapel, 2007). Dans ce but, des microplantes de pomme de terre cultivées sur un milieu de base M&S (Murashige et Skoog, 1962) sont évaluées pour leur capacité de croissance in vitrosur deux types de support de culture (solide et liquide). De même, l’influence de la teneur en azote indispensable à cette croissance a été examinée en incorporant différentes concentrations en N au milieu de base (tabl. 2).
Les cultures sont maintenues dans un envi- ronnement climatique à photopériode longue (16 h) avec un éclairement de 80 µmole/
m2/sec, fourni par des tubes fluorescents de type OSRAM L15W/954. La température est de 22 ± 1 °C de jour/18 ± 1 °C de nuit.
Le pH du milieu nutritif est ajusté à 5,7 avec du NaOH ou de l’HCl à 0,1 N avant l’autoclavage à 121 °C (1,1 kg/cm2de pres- sion) pendant 15 minutes.
Tubérisation
Inductionin vitro
Des segments de tige uninodaux prélevés sur les plantes-mèresin vitrosont cultivés sur un milieu de base contenant les macro- éléments définis par Charleset al. (1992) ainsi que les micro-éléments de Lê et Collet (1985), additionnés de 8% de saccharose.
L’action conjuguée d’une forte teneur en saccharose dans le milieu nutritif de base et d’une photo-thermopériode courte et alter- née permet l’initiation des structures tubéri- sées. A cet effet, les cultures sont mainte- nues dans un environnement climatique où elles reçoivent un éclairement de 8 heures par jour à 20 °C et de 16 heures de nuit à 12 °C. L’humidité relative est de 60% dans la chambre de culture pendant toute la durée de l’expérimentation.
Selon les génotypes cultivés, un séjour mi- nimal de trois semaines ou plus dans ces conditions est nécessaire pour obtenir entiè- rement l’initiation de la tubérisation sur les microplantes de pomme de terre.
Grossissement des tubercules L’apport d’azote (60 à 120 mM), sous forme d’ammoniac (NH4), de nitrate (NO3) ou de nitrate d’ammonium (NH4NO3), est égale- ment évalué durant cette phase de dévelop- pement en vue de permettre le grossissement des tubercules. Les cultures sont ensuite transférées à l’obscurité, à une température de 20 ± 1 °C, jusqu’à la récolte des micro- tubercules.
Les essais ont été conduits dans des conte- neurs en polycarbonate munis de flotteurs (Lifeguard®). L’expérimentation a été répé- tée trois fois pour une durée de culture de 16 semaines par cycle de production.
Résultats et discussion
Croissance in vitro
Influence du support de culture Les résultats de l’influence du type de support de culture sur la croissance des microplantes in vitro sont illustrés par la figure 1. La capacité de croissance des microplantes cultivées sur milieu liquide est nettement favorisée par rap- port à celle des microplantes sur milieu nutritif agarisé. L’action bénéfique d’un support liquide sur la croissance des microplantes de pomme de terrein vitro pourrait être expliquée, dans nos condi- tions d’expérimentation, par la facilita- tion de l’absorption des éléments nutri- tifs (Faye et al., 1986), d’une part, et par la dilution éventuelle des métabo- lites toxiques exsudés par le matériel végétal durant la culture, d’autre part.
Au contraire, sur un support solidifié par de l’agar, ces éléments toxiques s’accu- mulent fortement, rendant difficile la
croissance des microplantes (George, 1993). Dans le cas présent, la qualité des microplantes développées sur le mi- lieu liquide est fortement améliorée en termes de taille et de biomasse.
Influence de la teneur en azote La capacité de croissance des micro- plantes de pomme de terrein vitroa été examinée sur le milieu de base renfer- mant différentes concentrations en azote (tabl.1). Chez la variété Urgenta, une réduction importante de la croissance des microplantes cultivées est observée sur les milieux contenant de fortes te- neurs en azote. La meilleure croissance, dans nos conditions d’expérimentation, a été obtenue avec les faibles concen- trations en N de 10 à 20 mM. L’opti- mum a été obtenu avec 15 mM, permet- tant d’avoir des microplantes dont la biomasse produite est significativement plus importante, en particulier la ma- tière sèche; les concentrations élevées en azote (30 à 60 mM) s’avèrent moins
Tableau 1. Influence de la teneur en azote sur la croissance des microplantes in vitro(cv. Urgenta).
*Dans les colonnes, les valeurs suivies d’une même lettre ne sont pas significativement différentes (p = 0,05).
[mM] Croissance*
[cm]
Poids frais*/microplante [mg]
Poids sec*/microplante [mg]
10 7,15 ± 0,22a 127,70 ± 5,47ab 8,03 ± 0,28bc
15 7,08 ± 0,21a 134,14 ± 3,72a 10,17 ± 0,34a
20 7,38 ± 0,22a 126,77 ± 4,77ab 8,63 ± 0,25b
30 6,48 ± 0,16b 126,70 ± 3,7 ab 7,70 ± 0,22bc
45 6,35 ± 0,15b 115,10 ± 4,82b 7,58 ± 0,55c
60 6,38 ± 0,16b 100,44 ± 4,27c 7,80 ± 0,27bc
Fig. 1.Influence du support de culture sur la croissance des microplantesin vitro(cv. Charlotte).
0 2 4 6 8 10 12
Liquide Agar
Croissancedesmicroplantes[cm]
0 50 100 150 200 250 300
Poidsfrais/microplante[mg]
Taille des microplantes Poids frais
favorables à la croissance des micro- plantes in vitro. L’effet bénéfique d’un milieu de base renfermant une faible dose d’azote corrobore les observations de Charles et al. (1992) rapportant qu’une réduction de la teneur en azote durant cette phase de culture permet d’avoir une bonne croissance des mi- croplantes de pomme de terrein vitro.
Un bon développement de l’appareil végétatif est effectivement nécessaire pour la mise en réserve d’éléments nu- tritifs indispensables à la production de tubercules (Garner et Blake, 1989). Ces résultats nous ont amenés à fixer, pour la phase de croissance des microplantes in vitro, la teneur en azote dans le mi- lieu de culture de base à 15 mM pour la suite des essais.
Tubérisation in vitro
Effet de l’azote
Pour la production de semences de pomme de terre de qualité, il est impor- tant d’amener les tubercules à se déve- lopper jusqu’à une taille suffisante, car le risque de perdre du matériel par dés- hydratation est trop grand pour les pe- tits tubercules durant leur conservation.
Dans nos conditions de culture, l’ap- port d’azote a effectivement permis le grossissement des tubercules durant la phase de tubérisation. Cependant, l’ef- fet bénéfique de cet ajout dépend gran- dement de la forme d’azote apportée aux cultures. La biomasse produite avec du NH4NO3est nettement supérieure à celles obtenues avec l’ammoniac (NH4) ou le nitrate (NO3) seuls (fig. 2). De même, l’augmentation de la biomasse évolue également à mesure que l’on élève la teneur en NH4NO3dans le mi- lieu de culture (fig. 3). La meilleure réponse a été obtenue avec une concen- tration de 100 mM, tandis qu’une ré- duction du poids du tubercule a été en- registrée pour une concentration plus élevée (120 mM). Cet effet positif de l’azote sur le développement de nou- veaux tubercules durant la phase de tu- bérisation confirme les résultats rap- portés auparavant. A ce propos, Grison (1991) relève la nécessité de cet élé- ment durant cette phase de grossisse- ment en soulignant qu’un apport d’azote insuffisant peut non seulement entraî- ner une réduction du rendement, mais encore celle de la taille des tubercules.
Par contre, un excès d’azote peut retar- der leur maturation. Garner et Blake (1989) signalent que la disponibilité de la source d’azote dans le milieu est un facteur d’influence majeur sur la taille des tubercules au cours de la tubérisa- tion. Ils rapportent que de gros tuber-
cules peuvent être produits lorsque le milieu de culture renferme du NH4NO3 dans un rapport de 1:4, car l’apport excessif d’azote ammoniacal dans le milieu nutritif s’avère défavorable à la tubérisation en réduisant la taille et le nombre de tubercules formés. Dans notre étude, l’ajout de 100 mM d’azote sous forme de NH4NO3, en respectant le même rapport entre les deux formes d’azote, a permis d’obtenir effective- ment des microtubercules de plus d’un gramme/tubercule de poids frais en moyenne, par rapport aux 68 mg/tuber- cule obtenus par Garner et Blake (1989) avec la variété Maris Piper. Cette quan-
tité de 100 mM d’azote a été retenue pour une production satisfaisante de nos génotypes cultivés.
Effet du génotype
L’influence du génotype cultivé sur le développement des microtubercules a également été examinée dans nos essais.
Une variation importante quant à la ca- pacité de développer des tubercules a été observée au sein des variétés expéri- mentées (tabl. 2). En général, seuls deux microtubercules utilisables (> 0,5 cm) ont été produits par explant initial mal- gré un taux de tubérisation élevé (> 95%) Fig. 2. Effet de la source d’azote sur le développement des microtubercules in vitro (cvs. Bintje et Charlotte).
Bintje
Charlotte
NH4
NO3
NH4NO3
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Poidsfrais/tubercule[mg]
Fig. 3. Effet de l’apport de l’azote sur le développement des microtubercules in vitro (cv. Bintje).
0 0,4 0,8 1,2 1,6
Poidsdutubercule[g]
-0,3 0,1 0,5 0,9 1,3 1,7 2,1 2,5
Nombredetubercules/explant
Poids du tubercule Nombre
60 80 100 120
NH4NO3
[mM]
tandis que, sur le même milieu de cul- ture, le cultivar Charlotte développait en moyenne trois tubercules par ex- plant. Le taux le plus bas (1,8/explant) a été enregistré avec la variété Fontane.
Par ailleurs, des microtubercules d’une taille supérieure à 1 cm de diamètre ont été obtenus avec les variétés Eba, Fon- tane, Lady Claire et Victoria. Cela con- firme les remarques de Hossain (2005) sur l’importance du caractère génotypi- que des cultivars de pomme de terre pour leur capacité de tubérisation in vitro.
L’auteur observe cette variabilité géno- typique indifféremment dans les condi-
tions de culture en présence (ou en l’absence) de lumière. Il souligne que le potentiel de tubérisation est une ca- ractéristique dépendant de la variété et suggère, par conséquent, la mise au point de protocoles de culture spécifi- ques à chaque cultivar. Dans nos condi- tions de culture, les variétés Eba, Fon- tane, Lady Claire et Victoria ont formé des tubercules dont le poids atteint ou dépasse 1,0 g (fig. 4). Le plus grand nombre de tubercules a été obtenu dans ce travail avec les variétés Charlotte, Ratte et Urgenta. Cependant, leurs tu- bercules avaient un poids plus faible
(600 à 700 mg) pour un diamètre de moins d’un centimètre. Pour ces varié- tés qui produisent des tubercules trop légers, jugés moins intéressants sur le plan pratique, un séjour prolongé en milieu de tubérisation pourrait s’avérer indispensable pour améliorer leur qua- lité, car, selon nos observations, les tu- bercules continuent à grossir encore au-delà des 16 semaines imparties au cycle de production. Des travaux sont en cours afin de déterminer l’influence de la durée de culture en phase de tubé- risation sur la qualité des tubercules.
Conclusions
❏ Depuis de nombreuses années, l’utilisation des microtubercules comme matériel initial entrant dans le schéma de production de plants de pré-base a été pratiquée par les producteurs de semences de pomme de terre en Suisse.
❏ Ce mode de production repré- sente, en complément des micro- plantesin vitro, fragiles et vulné- rables aux conditions de culture conventionnelles, une alternative intéressante permettant d’envisa- ger la constitution rapide de maté- riel de base dans le cadre d’un approvisionnement en plants de haute qualité.
❏ Le développement des explants uninodaux de pomme de terre peut être orienté vers la production de microtubercules de qualité, en termes de nombre, de taille et de poids, par:
– une phase de croissance sur un milieu de base contenant une faible teneur en azote (15 mM);
– une phase d’induction à la tubé- risation sur un milieu nutritif contenant les macro-éléments de Charleset al.(1992) et les microéléments de Lê et Collet (1985) enrichis de 8% de sac- charose, avec une photo-ther- mopériode alternée (8 h/20 °C, jour et 16 h/12 °C, nuit);
– un apport supplémentaire de 100 mM d’azote sous forme de NH4NO3 au cours de la pé- riode de tubérisation (20 °C, obscurité) permettant le gros- sissement des tubercules.
Remerciements
Nous remercions Mme Monique Tho- rimbert pour la traduction du résumé en italien.
Tableau 2. Influence du génotype sur la tubérisation des pommes de terrein vitro.
Variétés Nombre de tubercules utilisables/explant
Poids frais/tubercule [mg]
Diamètre [mm]
Charlotte 3,0 700 ± 50 9,0 ± 0,2
Désirée 2,1 900 ± 60 10,0 ± 0,4
Ditta 2,2 900 ± 40 9,0 ± 0,1
Eba 2,2 1400 ± 150 11,0 ± 0,6
Fontane 1,8 1000 ± 80 11,0 ± 0,4
Lady Claire 2,1 1000 ± 75 12,0 ± 0,4
Ratte 2,7 700 ± 30 7,0 ± 0,3
Urgenta 2,5 600 ± 30 8,0 ± 0,3
Victoria 2,1 1000 ± 80 11,0 ± 0,4
Fig. 4.Microtubercules de pomme de terre développésin vitro.De gauche à droite:Eba et Fontane(en haut), Lady Claire et Victoria(en bas). La barre représente une longueur de 1 cm.
Bibliographie
Charles G., Rossignol L. & M., 1992. Environ- mental Effects on Potato Plantsin vitro. J. Plant Physiol.139, 708-713.
CIP, 2008.In:L’Odyssée de la pomme de terre, CIP – Exposition itinérante de l’Année inter- nationale de la pomme de terre, ISBN 978-92- 9060-349-8, 41.
FAO, 2008. Potato and food price inflation – International Year of the Potato 2008.
http://www.potato2008.org/en/potato/food prices.html [17 avril 2009]
Faye M., David A. & Lamant A., 1986. Nitrate reductase activity and nitrate accumulation in in vitroproduced axillary shoots, plantlets and seedlings ofPinus pinaster. Plant Cell Rep.5, 368-371.
Garner N. & Blake J., 1989. The induction and development of potato microtubersin vitroon media free of growth regulating substances.
Annals of Botany63, 663-674.
George E. F., 1993.In:Plant propagation by tis- sue culture (Part 1). The Technology, second edit., Exegetics Ltd, Edington, Wilts. England, ISBN 0-9509325-4-X.
Grison C., 1991. Influence des facteurs d’environ- nement sur le cycle végétatif de la pomme de terre.La Pomme de Terre française462, 7-15.
Hannapel D. J., 2007. Signalling the induction of tuber formation.In:Potato Biology and Bio- technology-Advances and Perspectives. Dick Vreugdenhil (ed.), Elsevier, ISBN-13: 978-0- 444-51018-1.
Hossein M. J., 2005.In vitromicrotuberisation in potato obtained from diverse sources. Plant Tissue Cult. & Biotech.15(2), 157-166.
Lê C. L. & Collet G. F., 1985. Assainissement de la variété de pomme de terre Sangema. Mé- thode combinant la thermothérapiein vitroet la culture de méristèmes. Premiers résultats.
Revue suisse Agric.17(4), 221-225.
Lê C.L., 1991. Aspects pratiques de la micropro- pagation de la pomme de terre (Solanum tube- rosumL.).Revue suisse Agric.23(6), 357-358.
Lê C. L., Thomas D. & Nowbuth L., 2002. Conser- vation des pommes de terrein vitroet carac- térisation des variétés cultivées en Suisse.
Revue suisse Agric.34(3), 133-136.
Murashige T. & Skoog F., 1962. A revised me- dium for rapid growth and bioassays with to- bacco tissue cultures.Physiologia Plantarum 15, 473-479.
Reust W. & Lê C. L., 1985. La multiplication ra- pide des pommes de terre par le microboutu- rage.Revue suisse Agric.17(1), 11-18.
Schwärzel R., Reust W., Torche J.-M., Ballmer T., Musa T. & Hebeisen T., 2008. Liste suisse des variétés de pommes de terre 2009.Revue suisse Agric.40(6), I-IV.
Summary
In vitroproduction of potato microtubers
A procedure forin vitroproduction of potato microtubers was developed for common- ly grown potatoes (Solanum tuberosumL.). Single nodal segments excised from in vitropropagated microplants according to Lê (1991) are used as initial explants. These explants were placed in a culture vessel containing nutrient media suitable to each stage of the tuberization process (growth, induction and tuberization) in view of promoting the tuber formation under controlled conditions. Under our conditions of culture, the quality of microtubers could be enhanced in terms of number, size and weight leading to the production of plant material with large calibre necessary for field planting.
Key words: potato, Solanum tuberosum L., microtubers, nodal cuttings, in vitro tuberisation.
Zusammenfassung
In vitroProduktion von Kartoffel-Mikroknollen
Eine Technik zur Produktion von Mikroknollen ist für Anbaukartoffeln entwickelt worden. Als Initial-explantat wurden Achsenknospen entnommen von in vitro ver- mehrten Kartoffelmikropflanzen verwendet. Diese Explantate wurden in ein Kulturge- fäss gesetzt mit einer für jede Etappe des Knollenbildungsprozesses geeigneten Nähr- lösung (wachsen, Ingangsetzung und Knollenbildung) um die Knollenbildung unter kontrollierten Bedingungen zu fördern.
Mit diesen Kulturbedingungen konnte die Qualität der Mikroknollen verbessert wer- den im Bezug auf Anzahl, Grösse und Gewicht und ermöglichen damit die Produktion von Pflanzenmaterial vom grösserem Kaliber was für Feldanbau unerlässlich ist.
Riassunto
Produzione di microtuberi di patatein vitro
Una tecnica di produzione di microtuberiin vitroè stata sviluppata per delle varietà coltivate di patate (Solanum tuberosumL.). Dei segmenti uninodali prelevati su micro- piante di patate propagatein vitrosecondo Lê (1991) sono usati come espianti iniziali.
Questi espianti sono stati posti in un recipiente di coltura contenente soluzioni nutri- tive appropriate per ogni tappa del processo di tuberizzazione (crescita, induzione e tuberizzazione) in vista di favorire la formazione di tubercoli in condizioni controllate.
Nelle nostre condizioni di coltura, la qualità dei microtuberi ha potuto essere miglio- rata in termini di numeri, di taglia e di peso, permettendo così la produzione di mate- riale di un calibro superiore indispensabile per il trapianto nei campi.
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