K l i n i s c h e U n t e r s u c h u n g e n z u r e n d o s k o p i s c h k o n t r o l l i e r t e n S a m e n ü b e r t r a g u n g b e i
W a r m b l u t s t u t e n u n t e r P r a x i s b e d i n g u n g e n
I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades eines
D O C T O R M E D I C I N A E V E T E R I N A R I A E durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Nils Neale Ismer
aus Diepholz
Hannover 2002
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. B. Meinecke
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. E. Klug
Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2002
meinen Eltern
Seite
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2.1 Physiologie der Spermien im weiblichen Genitale 3 2.2 Transport- und Selektionsmechanismen bei Pferd und Schwein 4 2.3 Funktionelle Anatomie des utero-tubalen Überganges bei Pferd
und Schwein 6
2.4 Reproduktionseffizienz der Stute 7
2.4.1 Parameter der Fruchtbarkeitsleistung 7
2.4.2 Reproduktionseffizienz der Stute unter Zuchtbedingungen 8
2.5 Reproduktionseffizienz des Hengstes 10
2.5.1 Parameter der Fruchtbarkeitsleistung 10
2.5.2 Reproduktionseffizienz des Hengstes unter
Zuchtbedingungen 11
2.6 Methoden der assistierten Reproduktion beim Pferd 13
2.6.1 Instrumentelle Samenübertragung 13
2.6.1.1 Frischsperma 14
2.6.1.2 Gefriersperma 17
2.6.2 Deponierungsort des Inseminates 20
2.6.2.1 Corpus uteri 20
2.6.2.2 Cornua uteri 20
2.6.2.3 Ostium uterinum tubae 21
2.6.2.4 Tuba uterina 24
2.7.1 Funktionelle Spermatologische Merkmale 25 2.7.1.1 Spermienmotilität: subjektive mikroskopische
Bestimmung der Vorwärtsbewegung 25
2.7.1.2 Computergestützte Motilitätsmessung 26
2.7.1.3 Spermienmorphologie 27
2.7.2 Methoden zur Anreicherung motiler Spermien 28
2.7.2.1 Swim-up-Verfahren 28
2.7.2.2 Sephadex-Filtration 29
2.7.2.3 Percoll- Dichtegradientenfraktionierung 29
2.7.2.4 L4-Membranfiltration 30
2.7.3 Dichtebestimmung 30
2.8 Assistierte Befruchtung 31
2.8.1 Oozytentransfer 31
2.8.2 In-vitro-Fertilisation (IVF) 32
2.8.3 Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) 32
2.8.4 Subzonale Spermieninjektion (SUZI) 33
3 Eigene Untersuchungen 34
3.1 Material und Methoden 34
3.1.1 Versuchstiere 34
3.1.1.1 Stuten 34
3.1.1.2 Hengste 37
3.1.2 Samenentnahme 40
3.1.3 Samenaufbereitung 40
3.1.4 Endoskopisch kontrollierte Insemination 41
3.1.4.2 Inseminationstechnik 43
3.1.5 Trächtigkeitskontrolle 45
3.1.6 Integration der endoskopisch kontrollierten Insemination in
den Arbeitsablauf 46
3.1.7 Graviditätsraten der Kontrollgruppen der Hengste A und B aus der konventionellen Besamung des Jahres 2000 46 3.1.8 Zeitlicher Abstand von der Samenentnahme bis zur
Insemination 47
3.1.9 Biometrische Analyse 50
3.2 Ergebnisse 50
3.2.1 Verteilung der Stuten gemäß ihrer Fertilitätsprognose 50 3.2.2 Verteilung der Stuten gemäß ihres Alters 52 3.2.3 Ejakulatcharakteristika der Hengste A, B, C 52 3.2.4 Graviditätsraten (D 16-18) nach endoskopisch kontrollierter
Insemination in Relation zur Inseminationsdosis 54
3.2.4.1 Hengst A 55
3.2.4.2 Hengst B 56
3.2.4.3 Hengst C 56
3.2.5 Graviditätsraten (D 16-18) nach endoskopisch kontrollierter Insemination in Relation zur wiederholten Insemination 57
3.2.5.1 Hengst A 57
3.2.5.2 Hengst B 58
3.2.5.3 Hengst C 59
3.2.6 Graviditätsraten (D 16-18) nach endoskopisch kontrollierter Insemination in Relation zur Fruchtbarkeitsprognose 61
3.2.6.2 Hengst B 62
3.2.6.3 Hengst C 62
3.2.7 Graviditätsraten (D 16-18) nach endoskopisch kontrollierter
und konventioneller Insemination 63
3.2.7.1 Hengst A 63
3.2.7.2 Hengst B 64
3.2.7.3 Hengst C 65
3.2.8 Graviditätsraten (D 16-18) in Abhängigkeit vom Alter der
besamten Stuten 66
3.2.8.1 Hengst A 67
3.2.8.2 Hengst B 67
3.2.8.3 Hengst C 68
3.2.9 Graviditätsraten (D16-18) in Abhängigkeit vom zeitlichen Abstand von der Samenentnahme bis zur
Insemination 69
3.2.10 Graviditätsraten (D16-18) in Abhängigkeit von der
Anzahl der Besamungen pro Rosse 70
3.2.11 Graviditätsraten (D16-18) in Abhängigkeit von der Station 71 3.2.12 Die Integration der endoskopisch kontrollierten
Insemination in den Arbeitsablauf 71
4 Diskussion 74
4.1 Bewertung möglicher Einflussfaktoren auf die
Versuchsergebnisse 74
4.2 Effizienz der endoskopischen Insemination 76
4.2.2 Einflußfaktoren der Stuten auf die erzielten Ergebnisse 79 4.3 Bewertung der Durchführbarkeit der hysteroskopischen
Besamung 80
4.4 Einsatzmöglichkeiten und Vergleich mit anderen Biotechnologien 82
5 Zusammenfassung 85
6 Summary 88
7 Literaturverzeichnis 91
8 Anhang 115
8.1 Abkür zungsverzeichnis 115
8.2 Herkunftsverzeichnis der verwendeten Materialien 116 8.3 Tabellarische Darstellung der Einzelergebnisse 117 8.4 Verzeichnis der bereits veröffentlichten Auszüge der Arbeit 127
1 Einleitung
Die Bedeutung und der Umfang der Pferdezucht hat in den letzten drei Jahrzehnten international stetig zugenommen. Das Reiten findet sowohl als Hobby als auch als Profisport in den Disziplinen Dressur, Springen, Vielseitigkeit, Western und Rennsport ständig wachsenden Zulauf.
Der anhaltende Bedarf an guten Sportpferden, verbunden mit der Hoffnung auf immer höhere Erlöse hat zur Folge, daß die Pferdezucht in immer größerem, aber auch professionellerem Rahmen praktiziert wird. Die Anzahl der eingetragenen Zuchtstuten (nur Reitpferde) hat sich dabei in Deutschland von 24.350 im Jahr 1965 auf 76.444 im Jahr 2000 mehr als verdreifacht. Ähnliche Werte weisen die Zahlen der Bedeckungen (nur Reitpferdehengste) auf. Wurden im Jahr 1960 noch ca. 15.000 gezählt, so waren es im Jahr 2000 schon 48.414 (Deutsche Reiterliche Vereinigung, 2000).
Um der stetig wachsenden Nachfrage an Pferden, aber auch dem Wunsch nach gezielterer Nutzung einzelner Spitzenpferde gerecht werden zu können, wurde deshalb eine intensive tierärztliche Betreuung von Deckstationen im Zusammenhang mit der Nutzung neuer Biotechnologien nötig. Dabei hat die instrumentelle Besamung als Technik der Samenübertragung den Natursprung weitgehend abgelöst. Hierdurch ist es möglich geworden, aus einem Ejakulat je nach Spermaqualität bis zu 20 Besamungsdosen für die instrumentelle Besamung zu gewinnen, was bereits eine intensivere Nutzung eines Hengstes ermöglicht.
Hohe Stutenzahlen, aber auch pathologische Faktoren einzelner Hengste können jedoch dazu führen, daß es zu Engpässen bei der Besamung der Stuten kommen kann.
In den letzten Jahren sind bereits verschiedene neuartige Methoden, wie z. B.
Embryonentransfer, In-vitro-Fertilisation, Oozytentransfer oder Intrazytoplasmatische Spermieninjektion im Bereich der equinen Reproduktionsmedizin entwickelt worden, von denen sich jedoch nur wenige in der Praxis durchsetzen konnten.
Praktische Relevanz könnte die endoskopisch kontrollierte Besamung erlangen, die im Vergleich zur konventionellen Besamung mit extrem niedrigen Spermienzahlen zu guten Befruchtungsergebnissen (MORRIS et al. 2000) führen kann. Bei dieser Technik wird das Sperma mit Hilfe eines Endoskopes direkt auf die Eileiterpapille der uterotubalen Verbindung verbracht. Während beim Pferd für die übliche intrauterine Besamung mit Frischsperma eine Besamungsdosis von 500 bis 600 x 106 vorwärtsbeweglichen Spermien empfohlen wird (HOUSEHOLDER et al. 1981, SIEME et al. 2001), können mit der videoendoskopisch kontrollierten Besamung bereits mit 5 x 106 vorwärtsbeweglichen Spermien Trächtigkeitsraten von bis zu 75 % pro Zyklus erzielt werden (MORRIS et al. 2000).
In der vorliegenden Studie sollte untersucht werden, ob sich die andernorts unter experimentellen Bedingungen mittels endoskopischer Besamung erreichten hohen Trächtigkeitsraten bei Stuten in der Praxis bestätigen lassen und inwieweit sich die Technik der endoskopischen Besamung in den täglichen Arbeitsablauf von kommerziell arbeitenden Besamungsstationen einbinden läßt.
2 Literaturübersicht
2.1 Physiologie der Spermien im weiblichen Genitale
Vom Zeitpunkt der Deponierung des Spermas im weiblichen Genitale bis zur Befruchtung der Eizelle durchlaufen die Spermatozoen verschiedenste Reifungsprozesse und unterliegen dabei einer Reihe von Selektionsmechanismen.
Diese finden sowohl im Uterus selbst als auch im Eileiter statt und sorgen grundsätzlich dafür, dass eine ausreichende Anzahl, befruchtungsfähiger Spermien für die Fertilisation zur Verfügung steht. Dabei wird die Gesamtheit der Reaktionen, welche die Spermatozoen zur Akrosomreaktion befähigen als Kapazitation bezeichnet (AUSTIN 1952; CHANG 1951). Sie findet hauptsächlich im kaudalen Isthmus des Eileiters statt (CHANG 1951). Die akrosomale Membran wird hierbei zunächst von schützenden Proteinen befreit, um so ein Einfließen von freien Calcium (Ca)++ -Ionen zu ermöglichen, was wiederum eine hyperaktive Bewegung der Geißel zur Folge hat (NOYES 1953; BEDFORD 1983). Diese Hyperaktivität scheint notwendig zu sein, um den Bindungen an das Eileiterepithel zu entkommen und die Penetration der Zona pellucida zu ermöglichen. Bei In-Vitro-Versuchen zeigten BRACKETT et al. (1982), dass diese Vorgänge 18-20 Stunden dauern. Nicht genau bekannt ist, welche Zeit die Spermien im Uterus benötigen, um eine erfolgreiche Kapazitation abzuschließen.
Zusätzlich kommt es zu Veränderungen in der Plasmamembran der Spermatozoen.
Hierbei wird vor allem Cholesterin mit Hilfe von lipidbindenden Proteinen des weiblichen Genitaltraktes aus der Plasmamembran entfernt, was wiederum zu einer Destabilisierung der Membran besonders im Bereich des Akrosoms führt. Dadurch
wird eine Reorganisation der Membran ermöglicht, welche für die spätere Akrosomreaktion notwendig ist (LANGLAIS u. ROBERTS 1985).
2.2 Transport- und Selektionsmechanismen bei Pferd und Schwein
Bei der Kopulation des Pferdes gelangt das Ejakulat während der mehrphasigen Ejakulation direkt in das Uteruslumen der Stute (Uterusbesamer) (GINTHER u.
PIERSON 1984; BOYLE et al. 1987), wo es sowohl durch aktive Flagellenbewegung der Spermatozoen, als auch durch passive Transportmechanismen des Uterus wie Kontraktionen der glatten Muskulatur, Zilienaktivität und Flüssigkeitsbewegung in Richtung uterotubaler Verbindung (UTV) gelangt (HAWK 1983). KATILA et al. (2000) berichten von 5 bis 65 Uteruskontraktionen in den ersten 30 Minuten nach der Besamung.
Dabei ist nach HUGHES und LOY (1970) nicht das Besamungsvolumen, sondern die Spermienzahl für das Erreichen der uterotubalen Verbindung von entscheidender Bedeutung. BADER (1982) dokumentierte, dass die Zahl der Spermien im Ovidukt bis 4 Stunden (h) nach der Besamung ansteigt und 6 h nach der Besamung bereits wieder absinkt. PARKER et al. (1975) beobachteten 12 h nach der intrauterinen Besamung mit 30 ml Frischsamen 2 % der Spermien im Eileiter. Allerdings fanden sie bei 37 % der Stuten keine Spermien im Ovidukt. Sie beschreiben ebenfalls, dass bei der Nutzung von Sperma mit einer geringeren Vorwärtsbeweglichkeit auch weniger Spermatozoen im Eileiter zu finden waren. SCOTT et al. (1995) geben an, dass die Zahl der Spermien im Eileiter bei der Nutzung von Sperma von subfertilen Hengsten weitaus geringer ist als bei normal fertilen. Ebenso verhält es sich ihrer Ansicht nach bei der Besamung von normal fertilen und subfertilen Stuten: Auch hier
ist die Zahl der im Eileiter nachweisbaren, motilen Spermien 4 h nach der Besamung bei den fertilen Stuten signifikant höher.
KRAUSE (1980) berichtet, dass während des Östrus mehr Spermien in den Eileiter gelangen, als während des Diöstrus. KATILA et al. (2000) untersuchten den Spermientransport im Reproduktionstrakt der Stute mit Hilfe von radioaktiven Markersubstanzen und stellten dabei fest, dass bereits 8-20 Minuten nach der Besamung die ersten Spermien in der Spitze des Uterushornes zu finden waren.
Nach 2,5 Stunden hatten die meisten Spermatozoen den Uterus schon wieder verlassen. Bereits 4,5 Stunden nach der Insemination war nur noch eine geringe Spermienaktivität im Uterus feststellbar, und der größte Teil der Spermien war von der Stute transzervikal eliminiert worden.
SCOTT et al. (2000) fanden große Zahlen an morphologisch unveränderten Spermien in den Longitudinalfalten an der Basis der uterinen Seite der Eileiterpapille, woraus sie folgerten, dass die uterine Seite der UTV als präovulatorisches Spermienreservoir dienen kann. Sie beschreiben des weiteren, dass ein Großteil der morphologisch veränderten Spermien die Papille des Eileiters gar nicht erreicht beziehungsweise keine Verbindung zum Epithel der Schleimhaut aufnehmen kann.
Darin sehen die Autoren Anhaltspunkte für eine Spermienselektion während des Transportes im weiblichen Genitale. Aufgrund der starken Selektion ist die bei der Frischbesamung notwendige, hohe Anzahl an vorwärtsbeweglichen Spermien zu erklären. Diese These würde auch die von MORRIS et al. (2000) erreichten, guten Trächtigkeitsergebnisse bei der hysteroskopischen Besamung mit geringen Zahlen an Spermien auf die UTV unter der Verwendung von Sperma, welches zuvor mit Percoll-Dichtegradienten-Technik aufbereitet wurde, unterstreichen.
2.3 Funktionelle Anatomie des utero-tubalen Überganges bei Schwein und Pferd
Die UTV besitzt beim Uterusbesamer sowohl eine Selektions- als auch eine Reservoirfunktion für das deponierte Ejakulat. Während des Oestrus bilden sich sowohl im Uterus als auch im Isthmus des Eileiters oedematöse Longitudinalfalten, die größtenteils nach der Ovulation wieder verschwinden (BOYLE et al. 1987).
Dieselben Autoren beschreiben die UTV als eine blasse, im Querschnitt 1-2 mm große Erhebung in der Spitze des Uterushornes. Zudem fanden sie in der direkten Nachbarschaft der UTV zilientragende und nichtzilientragende Zellen, wobei die zilientragenden in der Mehrzahl waren. Sie wurden vor allem am Rand der Schleimhautfalten gefunden. Die Zilien hatten offensichtlich eine gerichtete Orientierung. Sie entdeckten ebenfalls, dass die Zelltypen im kaudalen Isthmus zwar denen der UTV entsprachen, die zilientragenden Zellen dort aber eine höhere Dichte aufwiesen. Desweiteren konnten sie Spermien in tiefen Furchen der Longitudinalfalten nachweisen, was die Reservoirfunktion der UTV unterstreicht.
Beim Schwein konnten die Longitudinalfalten bereits von verschiedenen Autoren als funktionelles Spermienreservoir identifiziert werden (FLECHON u. HUNTER 1981;
RIGBY 1966).
Beim Pferd bestätigen Untersuchungen von PARKER et al. (1975) und BADER (1982) ebenfalls diese These. SCOTT et al. (2000) fanden bei der Analyse der UTV 4 Stunden nach der Insemination die meisten Spermien in den Falten der uterinen Seite der Papille der UTV. Dabei waren die gefundenen Spermien im Bereich der gesamten UTV zu über 90 % morphologisch normal, was die Annahme zuläßt, dass morphologisch veränderte Spermien die UTV entweder nicht erreichen oder eine
geringere Fähigkeit haben, an Epithelzellen zu binden als morphologisch intakte. Die Untersuchungen deuten an, dass ein präovulatorisches Spermienreservoir an der Uteruspapille zur Verfügung steht.
Die UTV ist bei Uterusbesamern die wichtigste Selektionsbarriere, da die Zervix, die bei Scheidenbesamern das erste große Hindernis darstellt, als Barriere entfällt.
Dabei stellt die räumliche Enge der UTV neben der funktionellen Anheftung von Spermien an das Epithel des Eileiters den größten Selektionsmechanismus bei Uterusbesamern dar (THOMAS et al. 1994).
2.4 Reproduktionseffizienz der Stute
2.4.1 Parameter der Fruchtbarkeitsleistung
Unter den landwirtschaftlichen Nutztieren ist das Pferd dafür bekannt, die geringste Reproduktionseffizienz zu besitzen. Der gebräuchlichste Parameter, um diese in einem Bestand darzustellen, ist die jährliche Lebendfohlenrate. OSBORNE (1975) und MEARNS (1977) nutzen sie, um die Fertilität von Beständen zu befunden. Sie stellt die Anzahl lebend geborener Fohlen im Verhältnis zur Anzahl der besamten Stuten dar. Allerdings spiegelt dieser Wert nur das endgültige Resultat verschiedenster Einflüsse auf die Reproduktionseffizienz wider. Um eine genauere Analyse der Daten über das reproduktive Niveau einer Gruppe zu erhalten und damit auch Ursachenforschung betreiben zu können, sind weitere, detailliertere Parameter zu erheben. Grundlegende Aussagekraft über die reproduktive Leistungsfähigkeit einer Stutengruppe besitzt neben der oben genannten jährlichen Lebendfohlenrate auch die Trächtigkeitsrate pro Zyklus und pro Saison, welche bei den meisten
Autoren als Fruchtbarkeitsparameter genutzt wird (GINTHER 1983; WOODS et al.
1987).
Die Erhebung und Untersuchung dieser und im Bedarfsfall weiterer Daten wie z. B.
die Aufschlüsselung der Trächtigkeitsraten nach Stutengruppen und einzelnen Hengsten, bringen zum einen Aufschluß über das reproduktive Niveau einer Stutengruppe, zum anderen zeigen sie mögliche Fehlerursachen für schlechte Fertilitätsparameter auf.
2.4.2 Reproduktioneffizienz der Stute unter Zuchtbeding ungen
Neben den biologischen Voraussetzungen einer jeden Stute oder auch eines Bestandes haben sowohl die züchterische als auch die veterinärmedizinische Betreuung – das sogenannte Management – einen maßgeblichen Einfluß auf die Fortpflanzungsdaten.
Bei der Stute haben neben biologischen Faktoren, wie z. B. das Alter, auch pathologische Faktoren Einfluß auf die Konzeptionschancen. So berichten verschiedene Autoren über ein Absinken der Lebendfohlenraten besonders ab dem 12. Lebensjahr (LAING u. LEECH 1975; BADI et al. 1981). Während BADI et al.
(1981) bei den 2-4 -jährigen Stuten noch eine Lebendfohlenrate von 85 % beschreiben, sind es bei den über 17 -jährigen nur noch 43 %.
Um die Konzeptionschancen im Zusammenhang mit den pathologischen Faktoren bewerten zu können, haben MERKT et al. (1987) ein Schema angewendet, nach dem die Stuten anhand von klinischen Daten in ein „Score“-System mit fünf
verschiedenen Gruppen eingeteilt werden. Diese fünf verschiedenen Gruppen stehen gleichbedeutend mit den Konzeptionschancen für die neue Zuchtsaison (Tab.
4, Kap. 3.1.1.1).
Weitere Möglichkeiten das reproduktive Potential einer Stute zu kategorisieren beschreiben sowohl KENNEY (1978), als auch SCHOON et al. (2001). Sie nehmen die histopathologische Untersuchung einer Endometriumsbiopsie in Zusammenhang mit klinischen-anamnestischen Daten als Grundlage für die Einschätzung der Konzeptionschancen einer Stute.
Wie sehr das Zuchtmanagement die Fortpflanzungseffizienz steigern kann, schildern RICKETTS und YOUNG (1990) in ihrer Abhandlung, nach der die Trächtigkeitsraten mit Hilfe einer systematischen Gestütsbetreuung in 19 Jahren um mehr als zehn Prozent gesteigert werden konnten.
Repräsentative Werte für die Trächtigkeitsraten pro Zyklus beschreiben WOODS et al. (1987) mit Werten von 47 % bis 58 % sowie SULLIVAN et al. (1975) mit 34 % bis 56 %. Höhere Raten beobachten GINTHER und BERGFELDT (1988) mit 85 % sowie McKINNON et al. (1988b) mit 84 %. Allerdings handelt es sich bei diesen beiden Arbeiten um experimentelle Studien, so dass die höheren Werte auf optimierte Bedingungen zurückzuführen sind. Lebendfohlenraten sind von mehreren Autoren zwischen 60 % und 70 % angegeben (MAHAFFEY 1968; LAING u. LEECH 1975;
OSBORNE 1975). MORRIS und ALLEN (2001) beschreiben eine Trächtigkeitsrate von 59,9 % pro Zyklus und 94,8 % pro Saison bei 1393 Vollblutstuten.
2.5 Reproduktionseffizienz des Hengstes
2.5.1 Parameter der Fruchtbarkeitsleistung
Als Parameter der Fruchtbarkeitsleistung eines Hengstes werden direkte und indirekte Werte erhoben. Als direkte Werte sind Befunde der Spermauntersuchung zu sehen, welche Aufschluß darüber geben sollen, welches Fertilisationspotential das Ejakulat in Bezug auf die einzelne Stute (Motilität, Morphologie) und auf die Gesamtheit der Stuten (Spermiengesamtzahl = Spermiendichte x Ejakulatvolumen) hat. Weitere wichtige Parameter wie z. B. die Kapazitationsfähigkeit, können zwar unter experimentellen Bedingungen ermittelt werden, sind aber aufgrund ihres hohen Arbeits- und Kostenaufwandes für die Praxis unbrauchbar. Als indirekte Werte können die Trächtigkeitsraten in einer Stutenpopulation, die von einem bestimmten Hengst inseminiert worden ist, betrachtet werden. Diese Parameter sind im Kap.
2.4.2 erläutert. Dabei muß berücksichtigt werden, dass durch die Abhängigkeit der Trächtigkeitschancen vom Reproduktionspotential der Stute nur eine bedingte Aussagefähigkeit über die Fruchtbarkeit des Hengstes möglich ist.
Die wichtigsten Parameter für die biologische Samenqualität sind nach SIEME et al.
(2001) die Beurteilung der Spermienmorphologie und –funktion sowie die Analyse von Seminalplasmakomponenten. Auch um vergleichbare Standards zur Beurteilung von Sperma zu erreichen, analysierten sowohl DOWSETT und PATTIE (1982) als auch PICKETT et al. (1976) Sperma anhand von Volumen, Spermienkonzentration, Spermiengesamtzahl, Spermienmotilität, Spermienmorphologie und pH-Wert.
Eine positive Korrelation zwischen Spermienmotilität und Fruchtbarkeit fanden SAMPER et al. (1991), ANDERSSON und KATILA (1992) ebenso wie JASKO et al.
(1992). DOWSETT und PATTIE (1982) entdeckten hingegen keine Korrelation der beiden Werte.
BIELANSKY (1975), JASKO et al. (1992) sowie CLEMENT et al. (1991) berichten über eine signifikante Beziehung zwischen Spermienmorphologie und Fruchtbarkeit eines Hengstes.
2.5.2 Reproduktionseffizienz des Hengstes unter Zuchtbedingungen
Das sexuelle Leistungsvermögen des Hengstes ist von zahlreichen endogenen und exogenen Faktoren abhängig. Dabei spielen neben genetischen Anlagen auch äußere Einflüsse wie Ernährung, Haltung, Umgang und eventuelle Erkrankungen eine wesentliche Rolle.
Über die reproduktive Effizienz von Hengsten unter natürlichen Bedingungen ist nur wenig bekannt, obwohl verschiedene Studien über die Fruchtbarkeit freilebender Equiden durchgeführt wurden. COLLERY (1974) berichtet über eine Trächtigkeitsrate von 100 % in einer Herde von sechs Ponystuten, die mit einem Hengst zusammen gehalten wurden. ICKES (1965) fand eine um 16,3 % gesteigerte Trächtigkeitsrate bei Pferden in der Gruppenhaltung gegenüber Pferden die kontrolliert gepaart wurden. BRISTOL (1982) hielt in seiner Untersuchung 20 Stuten zusammen mit einem Hengst, von denen 17 (85 %) nach der ersten Rosse tragend waren. Er untersuchte zudem die Intervalle der Paarung und fand heraus, dass im Durchschnitt
nur 72 Minuten zwischen den einzelnen Paarungen des Hengstes mit verschiedenen Stuten lagen.
STEINBJÖRNSSON und KRISTJANSSON (1999) beobachteten in zwei Herden, die jeweils aus einem Hengst und 23 bzw. 10 Stuten bestanden ein Kopulationsintervall von 6,0 bzw. 5,7 Bedeckungen pro Rosse, wobei die Abfohlraten der beiden Gruppen bei 87 % bzw. 90 % lag.
Alle erwähnten Arbeiten geben jedoch wenig Aufschluß über das wirkliche reproduktive Potential von Hengsten unter natürlichen Bedingungen, da die Gruppen zum einen eine kontrollierte Größen hatten und zum anderen auch nur auf einen bestimmten Zeitraum begrenzt waren.
MERKT et al. (1979) stellten in einer Untersuchung über Abfohlraten, in Abhängigkeit von der Anzahl der gedeckten Stuten pro Hengst fest, dass die Abfohlrate ab einer Zahl von mehr als 80 Stuten und pro Saison stark absinkt. Die Zahlen bezogen sich auf im Natursprung erzielte Ergebnisse.
Mithilfe der instrumentellen Besamung (IB) können jedoch höhere Stutenzahlen mit dem Sperma eines Hengstes besamt werden. PICKETT et al. (1976) beschreiben einen Spermienausstoß von 10 bis 22 x 109 Spermien pro Ejakulat bei einem Mittelwert von 15 x 109 Spermien, was bei einer Inseminationsdosis von 600 x 106 Spermien (SIEME et al. 2001) 16 bis 36 Besamungsportionen pro Tag bedeuten würde. In einer weiteren Studie berichten SULLIVAN und PICKETT (1975) über Werte von 3,2 bis 6,6 x 109 und 3,3 bis 5,8 x 109 Spermien pro Ejakulat in zwei unterschiedlichen Gruppen von Hengsten. ROUSSET et al. (1987) beschreiben
einen Mittelwert von 5,8 x 109 Spermatozoen, welcher neun Besamungsdosen pro Ejakulat ergeben würde.
2.6 Methoden der assistierten Reproduktion beim Pferd
2.6.1 Instrumentelle Samenübertragung
Historische Entwicklung
Die instrumentelle Besamung beim Pferd wurde das erste Mal 1322 in arabischen Texten erwähnt (PERRY 1945). Im späten 18. Jahrhundert entwickelte der Italiener Spallanzani (SPALLANZANI 1803) eine Methode zur KB beim Hund, welche er später auch beim Pferd anwendete. Gegen Ende des 19. Jahrhunderts berichteten sowohl der Franzose Repiquet als auch der Amerikaner Pearson von erfolgreicher IB beim Pferd (zit. nach PERRY 1945). Große Fortschritte machte der russische Forscher Ivanoff (IVANOFF 1922) am Anfang des 20. Jahrhunderts. Ihm gelang es bereits 1912 von 39 instrumentell besamten Stuten 31 Trächtigkeiten zu erzielen. In dem von Ivanoff gegründeten Institut in Moskau wurde in den 30er Jahren die erste künstliche Scheide für Pferde entwickelt. Im Jahr 1938 wurden in Rußland bereits mehr als 120.000 Stuten instrumentell besamt (PERRY 1945; PERRY 1968).
In Deutschland wird die IB seit dem 2. Weltkrieg in stetig wachsendem Umfang betrieben. Heute ist sie in den meisten Zuchtverbänden das Mittel der Wahl zur züchterischen Nutzung von Stuten. So wurden in der deutschen Warmblutzucht im Jahr 2000 von 24.458 Stuten 17.874 mit Frischsperma besamt, was einem Satz von 73,1 % entspricht (DEUTSCHE REITERLICHE VEREINIGUNG 2000).
2.6.1.1 Frischsperma
Besamungszeitpunkt
Damit eine erfolgreiche Befruchtung der Eizelle durch ein Spermium erfolgen kann, müssen progressiv motile Spermien (PMS) im Eileiter auf eine intakte Eizelle treffen.
Sowohl die Lebensspanne der Eizelle als auch die Lebensspanne von Spermien im weiblichen Genitale ist variabel. Dabei ist die Lebensspanne der Spermatozyten für eine erfolgreiche präovulatorische Besamung und die Lebensspanne der Eizelle für eine mögliche Besamung post ovulationem bestimmend (WOODS et al. 1990).
DAY (1942) erreicht bei einer kleinen Gruppe von Stuten mit einer Besamung von 2 x 109 Spermien jeweils an einem der letzten sechs Tage vor der Ovulation miteinander vergleichbare, gute Trächtigkeitsergebnisse (insgesamt 16 von 25 Stuten tragend).
Keine Trächtigkeit erzielte er bei Besamungen am 7. Tag vor (n=2) und am 1. Tag nach der Ovulation (n=5). Den Grund für diese lange Überlebensfähigkeit von Sperma im weiblichen Genitale sehen DOBRINSKI et al. (1996) in der Reservoirfunktion des kaudalen Isthmus des Ovidukts. Experimentell wurden von WOODS et al. (1990) die höchsten Trächtigkeitsergebnisse erzielt, wenn die Stuten am Tag vor der Ovulation besamt wurden (88 %, n=8). Stuten, die 1-3 Tage vor der Ovulation besamt wurden (76 %, n=41), erreichten ähnliche Konzeptionsergebnisse wie Stuten, die sechs Stunden post ovulationem besamt wurden (79 %, n=14).
MARTIN (1980) erhielt vergleichbare Trächtigkeitsergebnisse bei einer Besamung innerhalb von sechs Stunden entweder einmal vor der Ovulation, oder einmal vor und einmal nach der Ovulation. CLEMENT et al. (2000) führten eine retrospektive Studie durch, in der sie Stuten innerhalb eines Zyklus zu festgelegten Abständen von drei
verschiedenen Hengsten besamten, um hinterher durch DNA-Typisierung der Fohlen festzustellen, welcher der drei Hengste der Vater ist. In einer Gruppe wurden die Stuten mit dem Sperma von nur zwei Hengsten besamt, nämlich zwischen Tag 4 und Tag 2 vor der Ovulation von einem Hengst und zwischen Tag 2 und Tag 0 vor der Ovulation von einem anderen. Dabei stammten 14 von 17 erzielten Trächtigkeiten von der Besamung zwischen Tag 4 und Tag 2 vor der Ovulation. Weitere 18 Stuten, die am Tag 6-4, 4-2 bzw. 2-0 vor der Ovulation besamt worden waren (jeweils n=6) wurden in 16,7 %, 33,3 % bzw. 50,0 % der Fälle gravid.
Besamungsvolumen
ROWLEY et al. (1990) fanden heraus, dass die Trächtigkeitsrate ab einem Inseminationsvolumen von 100 ml negativ beeinflußt wird. JASKO et al. (1992) kamen zu dem Ergebnis, dass eine Konzentration von 25-50 x 106 Spermien pro ml zu maximalen Trächtigkeitsergebnissen führt, was bei einer Besamungsdosis von 500 x 106 Spermien einem Volumen von 10-20 ml pro Inseminat entsprechen würde.
SIEME et al. (2001) sind der Ansicht, dass das Inseminat nicht mehr als 50 ml umfassen sollte.
Besamungsdosis
Als jeweilige Dosis einer Frischbesamung wird von den meisten Autoren (PICKETT u. VOSS 1975; HOUSEHOLDER et al. 1981) eine Menge von 500 x 106 Spermien pro Inseminierung empfohlen.
Nach SCOTT et al. (1995) scheinen diese hohen Spermienzahlen notwendig zu sein, um trotz des zügig einsetzenden uterinen Selektionsmechanismus ein für die
Befruchtung ausreichendes, funktionelles Spermienreservoir im kaudalen Isthmus zu ermöglichen.
Verschiedene Autoren beschreiben, dass bei guter Spermaqualität Inseminationsdosen von 250 x 106 und sogar 100 x 106 ausreichend sein können, um Trächtigkeiten zu erzielen (KENNEY et al. 1975; PICKETT et al. 1975).
HOUSEHOLDER et al. (1981) erreichten mit 50 x 106 (37 %) geringere Trächtigkeitsraten, als mit 500 x 106 (75 %). GAHNE et al. (1998) finden keinen signifikanten Unterschied der Trächtigkeitsraten von Stuten (n=64), die mit 300 x 106 (75 %) oder mit 500 x 106 (64 %) PMS besamt wurden. SIEME et al. (2001) empfehlen 300 x 106 Spermien, wenn das Inseminat noch am gleichen Tag auf der Station versamt wird und 600 x 106 Spermien für Versandsperma.
Die von den verschiedenen Autoren angewendeten Inseminationsdosen, Inseminationsvolumina sowie der genutzte Zeitpunkt der Insemination sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1:
Besamung mit Frischsperma beim Pferd (Auswahl)
Autor Jahr Inseminations-
dosis (x 106 )
Inseminations- volumen (ml)
Besamungs- zeitpunkt
DAY 1942 2000 10-30 1-6 Tage vor
Ovulation
KENNEY et al. 1975 100-250 vor Ovulation
PICKETT et al. 1975 100-500 10-30
PICKETT u. VOSS 1975 500 11,6-11,8
MARTIN 1980 6 h vor bis 6 h
nach Ovulation HOUSEHOLDER et al. 1981 500
ROWLEY et al. 1990 < 100
WOODS et al. 1990 > 400 1 Tag vor
Ovulation
JASKO et al. 1992 10-20
GAHNE et al. 1998 300 / 600
CLEMENT et al. 2000 > 200 10 2-4 Tage vor
Ovulation
SIEME et al. 2001 300-600 < 50
2.6.1.2 Gefriersperma
Über die erste Trächtigkeit mit Tiefgefrier (TG) -Sperma beim Pferd berichteten bereits BARKER und GANDIER (1957). Trotzdem findet der Einsatz von TG-Sperma in der Pferdezucht auch heute noch keine allzu breite Nutzung, was vor allem an dem höheren technischen Aufwand und den damit verbundenen Kosten als auch den erzielten Trächtigkeitsergebnissen (50 %, KLUG et al. 1975; 52 %-57 %, BARBACINI
et al. 1999) liegen dürfte, wobei letztere oftmals nur leicht geringer sind als die mit Frischsperma erreichten.
Zudem werden in der Literatur (KLUG et al. 1975; PACE u. SULLIVAN 1975; ALIEV 1981; AMANN u. PICKETT 1987; BARBACINI et al 1999) eine Reihe von Methoden für die Anwendung von TG-Sperma beim Pferd beschrieben, jedoch gibt es bis heute kein einheitliches Verfahren der Konservierung und Anwendung von TG- Sperma beim Pferd.
Besamungszeitpunkt und Trächtigkeitsraten
Neben der optimalen Terminierung der Insemination ist es bei der Nutzung von TG- Sperma auch wichtig, so selten wie möglich zu besamen, um kein Sperma zu verschwenden. PACE und SULLIVAN (1975) erzielten die besten Ergebnisse, wenn die Stuten 0-12 Stunden vor oder nach der Ovulation besamt wurden (35 %, n=20).
Hingegen waren die erzielten Trächtigkeiten der Stuten, die 12-36 Stunden vor der Ovulation besamt wurden (30 %, n=20), vergleichbar mit denjenigen der Stuten, bei denen die Besamung 12-24 Stunden nach der Ovulation durchgeführt wurde (27 %, n=22). Ähnliche Ergebnisse gewann ALIEV (1981). Er besamte 2-12, 12-24, 25-36 und 37-48 Stunden vor der Ovulation und erlangte dabei Trächtigkeitsraten von 62
%, 72 %, 33 % und 18 % (n=200 Stuten).
KLUG et al. (1975) erzielten in einer Saison bei 50 % (n=116) der mit TG-Sperma besamten Stuten eine Trächtigkeit. Bei den mit Frischsperma besamten waren es 70
% (n=10).
AMANN und PICKETT (1987) berichten in einer mehrere Jahre umfassenden Studie über den Vergleich von TG-Sperma mit Frischsperma. Laut ihrer Abhandlung wurden mit TG-Sperma Trächtigkeitsraten zwischen 10 % und 61 % (n=241 Stuten) pro Zyklus erzielt. Mit Frischsamen erreichten sie im gleichen Zeitraum Ergebnisse von 40 % bis 79 % (n=252) Trächtigkeiten pro Zyklus.
BARBACINI et al. (1999) erreichten mit TG-Sperma über einen Zeitraum von vier Jahren Trächtigkeitsraten von 75,7 % (n=293 Stuten) pro Saison und von 38,4 % pro Zyklus. Dabei erzielten sie bei Stuten, die postovulatorisch besamt wurden, 37,8 % (n=351) Trächtigkeiten und bei präovulatorischer Besamung 39,1 % (n=225) pro Zyklus.
Besamungsdosis
SIEME et al. (2001) empfehlen für TG-Sperma eine Dosis von 800 x 106 Spermien mit einer Auftaumotilität von mindestens 35 % progressiv motilen Spermien (PMS).
AMANN und PICKETT (1987) verwendeten in ihrer Arbeit ähnliche Dosen zwischen 100 x 106 und 479 x 106 PMS. SQUIRES et al. (1999) empfehlen 800 x 106 bis 1000 x 106 bei TG-Sperma. BARBACINI et al. (1999) besamten mit einer Mindestdosis von 200 x 106 PMS. KLUG et al. (1975) nutzten eine Gesamtspermienmenge von 201 x 106 bis 545 x 106 bei einer Vorwärtsbeweglichkeit von Mindestens 40 %.
Die von den verschiedenen Autoren angewendeten Inseminationsdosen, Inseminationsvolumina sowie der genutzte Zeitpunkt der Insemination sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2:
Besamung mit TG-Sperma beim Pferd (Auswahl) Autor Jahr Inseminations-
dosis(x 106 )
Inseminations- volumen (ml)
Zeitpunkt
PACE u. SULLIVAN 1975 40-160 10 12 h vor bis 12 h nach der Ovulation
KLUG et al. 1975 201-545 20
ALIEV 1981 2 h bis 24 vor der
Ovulation AMANN u. PICKETT 1987 100-479
BARBACINI et al. 1999 > 200 SQUIRES et al. 1999 800-1000
SIEME et al. 2001 800
2.6.2 Deponierungsort des Inseminates
2.6.2.1 Corpus uteri
KENNEY et al. (1975) beschreiben eine Methode, bei der das Sperma in den Uteruskörper verbracht wird. Hierbei handelt es sich um den noch heute gebräuchlichen Vorgang bei der Besamung mit Frisch-, Nativ- oder Tiefgefriersperma.
2.6.2.2 Cornua uteri
RIGBY et al. (2000) berichten über eine Technik, bei der die Besamungsdosis anstatt in den Uteruskörper, tief in das dem ovulationsnahen Follikel benachbarte
Uterushorn appliziert wurde. Dies geschah mit Hilfe eines flexiblen Plastikkatheters, der unter rektaler Kontrolle in das Uterushorn geführt wurde. RIGBY et al. (2000) zeigten, dass bei den in das ipsilaterale Uterushorn besamten Stuten, anschließend ca. die doppelte Zahl an Spermien aus dem ipsilateralen Eileiter gewonnen werden konnte als bei den konventionell inseminierten Stuten.
SQUIRES et al. (2000) erzielten mit dieser Methode bei Verwendung einer Spermiendosis von 25 x 106 und 5 x 106 und einem Besamungsvolumen von einem Milliliter Ergebnisse von 57 % (n=21) und 35 % (n=20) Trächtigkeiten pro Zyklus.
BUCHANAN et al. (2000) wandelten die von RIGBY et al. (2000) beschriebene Arbeitsweise insofern ab, dass sie die Lage des Katheters im Uterus per transrektaler Ultraschalluntersuchung kontrollierten. Dabei erzielten sie pro Zyklus mit 5 x 106 und 25 x 106 Spermien pro Inseminat und einem Besamungsvolumen von einem Milliliter 35 % (n=20) respektive 53 % (n=21)Trächtigkeitsraten.
Kürzlich berichteten RIGBY et al. (2001) von einer Trächtigkeitsrate von 50 % (n=20) pro Zyklus. Dabei wurde der flexible Katheter unter manuell rektaler Kontrolle bis in die Spitze des Uterushornes geführt.
2.6.2.3 Ostium uterinum tubae
MANNING et al. (1998) und VAZQUEZ et al. (1998) waren die ersten, die eine neue Besamungsmethode beschrieben, bei der das Inseminat unter endoskopischer Kontrolle in der Uterushornspitze direkt auf die uterotubale Verbindung deponiert wird. Den Vorteil dieser Methode sehen MANNING et al. (1998) darin, dass wie bei
entsprechenden Untersuchungen beim Menschen, die für eine erfolgreiche Konzeption benötigte Spermienzahl erheblich gesenkt werden könnte. Bei der Stute führten sie dazu ein Videoendoskop transzervikal in den Uterus ein, welcher dann mit Kohlendioxid (CO2) distensiert wurde. Anschließend schoben sie das Endoskop unter Sichtkontrolle in das ipsilaterale Uterushorn des dominanten Follikels, bis die Papille des Eileiters dargestellt werden konnte. Nun wurde das Inseminat mit Hilfe eines Katheters, der über den Arbeitskanal des Endoskopes geführt wurde, genau auf der Eileiterpapille abgesetzt.
In dieser Untersuchung besamten sie eine Gruppe von Stuten (n=12) mit 100 x 106 PMS in 12 ml Inseminationsvolumen (IV) und eine andere Gruppe (n=12) mit 10 x 106 PMS und 2,5 ml IV auf konventionelle Weise. Zwei weitere Gruppen wurden endoskopisch besamt, eine (n=11) mit 10 x 106 PMS (0,25 ml IV) und die andere (n=9) mit 1 x 106 PMS (< 0,16 ml IV). Bei den beiden konventionell besamten Stutengruppen wurden 4 (33 %) und 2 (17 %) der Stuten tragend. In den beiden endoskopisch besamten Gruppen erreichten MANNING et al. (1998) keine, respektive 2 (22 %) Trächtigkeiten. VAZQUEZ et al. (1998) berichten von 3 (30 %) tragenden Stuten aus einer Gruppe von 10, die mit 3,8 x 106 PMS und einem Volumen von 20 µl endoskopisch besamt wurden. Die von ihnen benutzte Methode ist mit der von MANNING et al. (1998) beschriebenen vergleichbar. Auch MORRIS et al. (2000) wendeten diese Technik an. Sie erreichten in den verschiedenen Stutengruppen, welche mit 10 x 106 (n=10), 5 x 106 (n=8), 1 x 106 (n=25), 0,5 x 106 (n=14), 0,1 x 106 (n=11) und 0,001 x 106 (n=10) PMS in einem Inseminationsvolumen von 0,03 bis 0,15 ml besamt wurden, Trächtigkeitsraten von 60 %, 75 %, 64 %, 29 %, 22 % und 10 %. Gründe für die im Vergleich zu den vorher durchgeführten Arbeiten höheren Trächtigkeitsraten vermuten MORRIS et al. (2000), vor allem in der
Tatsache, dass das verwendete Sperma mittels Percoll-Dichtegradienten-Verfahren vorbehandelt wurde.
In einer weiteren Studie untersuchten SQUIRES et al. (2000) Trächtigkeitsraten von Stuten, die mit 5 x 106 PMS und einem IV von 0,1 bis 0,24 ml hysteroskopisch besamt wurden. Hierbei erzielten sie bei 5 (50 %) von 10 Stuten eine Konzeption. In einer Vergleichsgruppe wurden 10 Stuten mit der gleichen Spermiendosis, allerdings mithilfe eines flexiblen Plastikkatheters, tief intrauterin besamt. Hiervon konnte bei keiner Stute eine Trächtigkeit festgestellt werden. In einem weiteren Versuch besamten SQUIRES et al. (2000) vier Stutengruppen (jeweils n=10) hysteroskopisch mit jeweils 5 x 106 PMS und einem IV von 0,1 bis 0,24 ml pro Stute. Die erste Gruppe wurde mit normalem Frischsperma besamt, die zweite mit frischem, mittels Durchflußzytometrie gesextem Sperma, die dritte mit aufgetautem Gefriersperma und die vierte mit aufgetautem Gefriersperma, welches zuvor gesext worden war. Die Ergebnisse der ersten drei genannten Gruppen waren sehr ähnlich (40 %, 37,5 %, 37,5 %). Nur in der vierten Gruppe lagen die erzielten Trächtigkeitsraten niedriger (13,3 %).
Während MANNING et al. (1998) und VASQUEZ et al. (1998) das größte Potential der endoskopisch kontrollierten Besamung darin sehen, das Sperma von subfertilen oder stark genutzten Hengsten gezielter einzusetzen und eine höhere Zahl an Stuten zu besamen, sehen MORRIS et al. (2000) und SQUIRES et al. (2000) darüber hinaus eine wichtige Indikation in der Nutzung von gesextem Sperma, da bei den bisher genutzten Methoden zum Sexen von Sperma eine nur geringe Anzahl (15 x 106 pro h) an selektierten Spermien gewonnen werden kann (LINDSEY et al. 2001).
Zusätzlich sehen die Autoren einen Vorteil dieser Arbeitsweise darin, dass es
aufgrund der verminderten Spermienzahl und des geringen Volumens nur zu einer schwächer ausgeprägten transienten Begleitendometritis kommt.
2.6.2.4 Tuba uterina
Über die chirurgische Übertragung von männlichen Gameten in den Eileiter schreiben McCUE et al. (2000). Sie erreichten durch die Anwendung dieser Methode eine Trächtigkeitsquote von 21,4 % (n=14) bei chirurgisch besamten Stuten. Hierbei wurde bei den Probandinnen zunächst der Uterus samt Ovar über eine Inzision in der Flanke vorgelagert. Nachfolgend wurden 5 x 104 Spermien in einem Volumen von 0,05 ml über das Infundibulum 2 cm tief in den ipsilateralen Eileiter injiziert. Danach wurden die Organe in die Bauchhöhle zurück verlagert und die Bauchwand chirurgisch verschlossen.
Die von den verschiedenen Autoren angewendeten Inseminationsdosen, Inseminationsvolumina sowie der Deponierungsort des Inseminates sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3:
Besamung an verschiedene Deponierungsorte des Inseminates beim Pferd (Auswahl)
Autor Jahr Deponierungs-
ort
Inseminations- dosis (x 106 )
Inseminations- volumen (ml)
SQUIRES et al. 2000 5 / 25 1
BUCHANAN et al. 2000 5 / 25 1
RIGBY et al. 2000 RIGBY et al. 2001
Cornua uteri
MANNIG et al. 1998 10 / 1 0,25 / 0,16
VASQUEZ et al. 1998 3,8 0,02
MORRIS et al. 2000 0,001-10 0,03-0,15
SQUIRES et al. 2000
Ostium uterinum tubae
5 0,1-0,24
McCUE et al. 2000 Tuba uterina 0,05 0,05
2.7 Ejakulatmerkmale
2.7.1 Funktionelle spermatologische Merkmale
2.7.1.1 Spermienmotilität: subjektive mikroskopische Bestimmung der Vorwärtsbewegung
Die klassische Bestimmung der Spermienmotilität erfolgt durch visuelle Beurteilung mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskopes mit beheizbarem Objekttisch. Dabei wird mit einer 150-200fachen Vergrößerung gearbeitet (SIEME et al. 2001). Die Vorteile dieser Methode sehen die Autoren in der einfachen und günstigen Durchführbarkeit, verbunden mit einer ausreichenden Genauigkeit. ROUSSET et al. (1987) zeigten,
dass 2-7 Ejakulate notwendig sind, um beurteilbare Aussagen über das Sperma eines Hengstes machen zu können.
2.7.1.2 Computergesteuerte Motilitätsmessung
Die computerassistierte Spermienanalyse (CASA) zur Bestimmung der Spermienmotilität wurde Mitte der achtziger Jahre zunächst für den humanmedizinischen Gebrauch eingeführt (DAVIS u. KATZ 1993).
Hierbei werden mit Hilfe einer Videosequenz des zu untersuchenden Spermas mit variierender Frequenz Einzelbilder angefertigt, auf denen die Bewegung der einzelnen Spermatozoen mittels Computer ausgewertet wird. Mehrere Geschwindigkeits- und Richtungsparameter werden dabei erhoben (KATZ et al.
1985). Die Wichtigsten sind die Geschwindigkeit entlang der Bahn (VCL), die Geschwindigkeit über die Start-Ziel-Strecke (VSL), die Geschwindigkeit entlang der gemittelten Bahn (VAP) und die seitliche Kopfauslenkung (LHD).
Verschiedene Studien über die Verläßlichkeit und die Wiederholbarkeit der Befunde wurden zu Beginn der neunziger Jahre von DAVIS et al. (1992) und AGARWAL et al.
(1992) durchgeführt. Sie zeigten, dass CASA auch mit verschiedenen Systemen verläßliche Ergebnisse bezüglich der objektiven Bewertung von Spermienmotilität liefert. BATAILLE et al. (1990) berichten über eine Variabilität von nur 2 % innerhalb einer Spermaprobe, untersucht an den Ejakulaten von 62 Hengsten. Allerdings konnte die Methode aufgrund der hohen Kosten bislang nur in einzelnen Veterinärlaboren etabliert werden.
2.7.1.3 Spermienmorphologie
Die Ergebnisse der morphologischen Untersuchung sind ein weiterer wichtiger Befund bei der Beurteilung von Sperma. Anhand der Art und der Lage von Veränderungen lassen sich Rückschlüsse auf die möglichen Ursachen für Normabweichungen finden. Dazu haben LEIDL et al. (1971) ein Schema entwickelt, nach dem die Unterteilung in primäre/sekundäre sowie spezifische/unspezifische Veränderungen vereinfacht wird. Ein ähnliches Schema wurde auch von DOTT (1975) entwickelt.
Um Sperma morphologisch beurteilen zu können, sollte es zunächst fixiert werden.
Bei Pferdesamen muß anschließend noch eine Färbung erfolgen, um eine gute Beurteilung zu ermöglichen. Das Sperma sollte zunächst unter 10facher und anschließend unter 1000facher Vergrößerung beurteilt werden. Neben der Hematoxylin-Eosin- ist die Eosin-Nigrosin-Färbung eine weitere Möglichkeit der Spermienfärbung (DOTT u. FOSTER 1972). OETTLE (1986) benutzte eine spezielle Akrosomfärbung (Spermac), die eine Untersuchung des Akrosoms ermöglichen.
MAGISTRINI et al.(1997) wendeten eine Fluoreszenzfärbung für die morphologische Untersuchung des Spermas an. Hierbei binden monoklonale Antikörper an bestimmte Antigene an der Oberfläche des Akrosoms. Diese binden dann wiederum fluoreszierende Farbstoffe, welche optisch dargestellt werden können.
JASKO et al. (1990) beschreiben, dass Veränderungen im Bereich des Spermienkopfes mit verminderter Fertilität einhergehen. Einen ähnlichen Effekt entdeckte BIELANSKY (1975) im Zusammenhang mit Ejakulaten, deren Spermien mehr als 10 % primäre Abnormitäten zeigten.
BLACH et al. (1988) nutzten die Transmissionselektronenmikroskopie, um morphologische Veränderungen im Bereich der Spermienmembran darstellen zu können.
2.7.2 Methoden zur Anreicherung motiler Spermien
2.7.2.1 Swim-up-Verfahren
Die Fähigkeit der Migration motiler Spermien in ein angrenzendes Medium ist die Grundlage dieser Selektionsmethode (LOPATA 1976).
WALTER (1992) wendete dieses Verfahren bei Hengstsperma an und berichtet von einer Rückgewinnungsrate von lediglich 10,53 % der motilen Spermien, weshalb sie den praktischen Einsatz dieser Methode ausschließt.
PARRISH et al. (1995) zeigte, dass mit dieser Methode die Furchungsraten nach In- vitro-Fertilisation (IVF) signifikant verbessert werden konnten. Hierbei wird die Neigung von Spermien ausgenutzt, aktiv in Medien einzudringen. Hierzu wird Sperma mit einem Medium überschichtet, in das die motilen Spermatozyten einwandern. Dadurch wird es möglich, befruchtungsfähige und physiologische Spermiensubpopulationen gegenüber weniger vitalen zu selektieren. Dies ist eine Voraussetzung für die Anwendung von IVF-Verfahren (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 1997).
CHOI et al. (2002) wendeten ebenfalls das Swim-up Verfahren mit einem Albumin- Lactat-Pyruvat-Medium an, um Spermien für die intrazytoplasmatische Spermieninjektion zu gewinnen.
2.7.2.2 Sephadex- Filtration
Die Sephadex-Filtration beruht auf der Eigenschaft von geschädigten oder toten Spermatozyten, an bestimmten Oberflächen wie Glas haften zu bleiben (CRABO et al. 1992). Gleiches Verhalten zeigen sie an Sephadex-Kugeln, wodurch intakte, motile Spermien leichter durch einen entsprechenden Filter wandern. GRAHAM und GRAHAM (1990) berichten über bessere Trächtigkeitsraten mit Bullensperma nach vorheriger Filtration. WALTER (1992) konnte 37,7 % der Spermien mit einer Glaswoll- Sephadexsäule zurückgewinnen, SPRECKELS (1994) im Mittel sogar 61,1
%.
2.7.2.3 Percoll- Dichtegradientenfraktionierung
Die Verteilung von unterschiedlichen Dichtegradienten auf die verschiedenen Spermiensubpopulationen ist die theoretische Grundlage dieser Methode mit der auch andere Zellen und Viren fraktioniert werden. Das hierbei verwendete Medium Percoll besteht aus kolloidalen Silikonpartikeln, die mit PVP beschichtet sind, um eine Toxizität zu verhindern. PARRISH et al. (1995) berichten jedoch über einen schädigenden Effekt im Zusammenhang mit der Gewinnung von Spermien für die IVF. MORRIS et al. (2000) setzten ebenfalls Percoll-aufbereitetes Sperma in ihrer Untersuchung über endoskopische Besamung ein und erreichten mit geringen
Spermienzahlen (1-10 x 106) sehr gute Trächtigkeitsergebnisse (60-75 %) (s. Kap.
2.6.2.3)
2.7.2.4 L4-Membranfiltration
Diese Methode wird zuerst von AGARWAL et al. (1991) beschrieben. Hierbei wird Sperma durch ein faserförmiges Polyestermedium filtriert. Er konnte eine Steigerung des Anteiles der normalen Spermien von 53 % auf 84 % bei humanem Sperma erzielen. REIFENRATH (1994) berichtet von signifikant höheren Werten in den Bereichen Motilität, Vitalität und Morphologie bei der Bewertung von Hengstsperma welches Membranfiltriert wurde gegenüber Sperma welches zentrifugiert wurde.
2.7.3 Dichtebestimmung
Zur Bestimmung der Dichte einer Samenprobe gibt es unterschiedliche Verfahren.
Neben der Auszählung mit Hilfe eines Hämozytometers kann die Untersuchung auch mit einem Spektrophotometer durchgeführt werden (JASKO et al. 1992).
Die gebräuchlichste Dichtebestimmung ist zur heutigen Zeit die photometrische, bei der geeichte Geräte verwendet werden müssen. Allerdings kann nur unverdünntes Sperma untersucht werden, da es durch die unterschiedliche Dichte des hinzugefügten Verdünners zu einer Fehlbeurteilung kommen würde. Der Vorteil dieser Methode liegt in der Geschwindigkeit und der einfachen Handhabung. Nach THOMASSEN (1988) ist diese Methode gut geeignet, die Konzentration eines Ejakulates zu bestimmen.
In der Durchführung etwas komplizierter, dafür aber auch genauer, ist die Auszählung der Spermien mittels Zählkammer (Hämozytometer). Hier wird ein bestimmtes Spermavolumen exakt verdünnt und anschließend die Menge der Spermatozyten pro Milliliter mit Hilfe einer Zählkammer unter dem Mikroskop bestimmt.
2.8 Assistierte Befruchtung
2.8.1 Oozytentransfer
In frühen Studien berichten McKINNON et al. (1988a) und RAY et al. (1994) über eher geringe Konzeptionsraten nach Oozytentransfer (13 % bzw. 8 %). CARNEVALE und GINTHER (1995) sowie HINRICHS et al. (1998) erzielten höhere Werte (83 % bzw. 75 %). Allerdings wurden die Oozyten in den beiden letztgenannten Untersuchungen 24 h nach der Gabe von humanem Choriongonadotropin (hCG) aspiriert und anschließend 12-20 h vor dem Transfer kultiviert, was auch ein Grund für die, gegenüber früheren Studien, gestiegenen Werte sein könnte.
SCOTT et al. (2001) verglichen die Überlebensfähigkeit von equinen Oozyten, die in vivo im Follikel, in vitro und im Eileiter der Stute gereift waren. Dabei waren die Embryogewinnungsraten der in vivo im Follikel (82 %) gereiften Eizellen signifikant höher, als die der in vitro (9 %) oder im Eileiter (0 %) gereiften Oozyten.
Kürzlich berichten CARNEVALE et al. (2001) über eine Trächtigkeitsrate von 53 % (n=38) mit Hilfe von Oozytentransfer bei Stuten, bei denen zuvor in der instrumentellen Besamung und im Embryotransfer keine Trächtigkeit erzielt werden
konnte. Sie ziehen den Schluss, dass der Transfer von Oozyten eine wirtschaftliche Methode darstellt, um bei subfertilen Stuten Trächtigkeiten zu erzielen.
2.8.2 In-vitro-Fertilisation (IVF)
Die erste Studie über IVF beim Pferd stammt von BEZARD et al. (1989). ZHANG et al. (1990) berichten über die Auswirkungen von unterschiedlicher Spermabehandlung vor der IVF. Das erste lebende Fohlen nach IVF dokumentieren PALMER et al. (1991). Weitere Autoren beschreiben die Anwendung der IVF-Technik unter unterschiedlichen Voraussetzungen (MEINTJES et al. 1996; SQUIRES et al.
1996; GROENDAHL et al. 1997; DELL`AQUILA et al. 1997; SCHMID et al. 2000;
McKINNON et al. 2000). Dabei wird jedoch deutlich, dass die IVF beim Pferd problematischer zu sein scheint, als bei anderen Tierarten oder beim Menschen. Die beiden Hauptgründe sind laut SCHMID et al. (2000) Probleme bei der Maturation der Eizelle und der Kapazitation des Spermas. Allerdings gelang sowohl DEL CAMPO et al. (1990), als auch ZHANG et al. (1990), eine erfolgreiche In-vitro-Maturation von Oozyten. Zudem berichten VARNER et al. (1987) und SAMPER et al. (1989) über eine erfolgreiche In-vitro-Kapazitation bei equinen Spermatozyten.
2.8.3 Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)
Die Technik der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion erleichtert die künstliche Befruchtung beim Pferd deutlich, da man die natürliche Kapazitation der Spermatozyten, die zum Erlangen einer Befruchtung von Nöten ist, umgehen kann (SCHMID et al. 2000). Mehrere Autoren berichten über Trächtigkeiten nach ICSI mit in vitro gereiften Eizellen (SQUIRES et al. 1996; COCHRAN et al. 2000; McKINNON
et al. 2000). COCHRAN et al. (2000) verglichen dabei ICSI mit subzonaler Spermieninjektion (SUZI) (s. Kap. 2.8.4), wobei sie mit ICSI eine signifikant höhere Furchungsrate der Eizellen gegenüber SUZI beobachteten (39 % vs. 6 %).
McKINNON et al. (2000) untersuchten den Einfluß von TG-Sperma von unfruchtbaren und fruchtbaren Hengsten bei der ICSI und fanden keine Unterschiede. SCHMID et al. (2000) sehen ICSI als eine Möglichkeit, X/Y-selektiertes Sperma einzusetzen. Trotzdem sei die Methode nicht für die routinemäßige Erzeugung equiner Embryonen geeignet.
XIHE et al. (2001) berichten über einen positiven Einfluß auf die Gewinnungsrate von Blastozysten, wenn die Oozyten zuvor mit Epithelzellen des Eileiters oder fetalen Fibroblasten maturiert wurden.
CHOI et al. (2002) berichten über ähnlich gute Ergebnisse von ICSI, welche mit frischem oder mit TG-Sperma durchgeführt wurde. Sie fanden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Furchungsraten der beiden Gruppen.
2.8.4 Subzonale Spermieninjektion (SUZI)
COCHRAN et al. (2000) dokumentieren eine neue Technik der künstlichen Befruchtung in Form der subzonalen Spermieninjektion beim Pferd, erzielten aber signifikant geringere Furchungsraten.
3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material und Methoden
3.1.1 Versuchstiere
3.1.1.1 Stuten
Bei der von Februar bis August 2001 durchgeführten Untersuchung kamen insgesamt 196 Stuten in der endoskopischen Besamung auf zwei unterschiedlichen Besamungsstationen zum Einsatz. Hierbei handelte es sich um Warmblutstuten im Alter von 2-22 Jahren (ø 7,7 ± 4,1 Jahre), welche einen mäßigen bis sehr guten Pflege- und Ernährungszustand aufwiesen. Sie hatten ein Gewicht von ungefähr 500-650 KG und zeigten keine klinischen Anzeichen einer Erkrankung. Sämtliche Stuten standen zum Zeitpunkt der Untersuchung in privatem Besitz.
Nach dem Reproduktionsstatus handelte es sich um 57 (29,1 %) Stuten mit Fohlen bei Fuß, 63 (32,1 %) Maidenstuten und 76 (38,8 %) güste Stuten. Die Stuten unterlagen keinerlei Selektion, so dass alle für die jeweiligen Hengste bestimmten Stuten eingesetzt wurden.
Zum Vergleich der Resultate der endoskopischen Besamung wurden die Trächtigkeitsraten von Stuten herangezogen, die in den Jahren 2000 (n=614) (Hengst A u. B) und 2001 (n=469) (Hengst A, B, u. C) konventionell besamt wurden.
Die Ergebnisse der Gruppe aus dem Jahr 2000 wurde lediglich retrospektiv ausgewertet, die Stuten aus dem Jahr 2001 wurden parallel zu den endoskopisch
besamten Stuten auf konventionelle Weise inseminiert. Die Festlegung der Vergleichsgruppen fand ebenfalls ohne vorherige Auswahl der Stuten statt.
Um den Einfluß der Stuten auf die erzielten Trächtigkeitsergebnisse retrospektiv bewerten zu können, wurden sie nach dem „Score“-System von MERKT et al. (1987) (Tab. 4) in fünf verschiedene Fruchtbarkeitsklassen eingeteilt. Diese Gruppen definieren sich jeweils nach der Wahrscheinlichkeit, nach der eine Stute in der bevorstehenden Besamungssaison tragend wird. Hierbei werden sowohl die Reproduktionsanamnese als auch sämtliche klinischen Daten jeder einzelnen Stute berücksichtigt, die Aufschluß über ihre Konzeptionschance geben. Bei der Anamnese wird die Anzahl der Jahre herangezogen, in der es zu keiner Trächtigkeit gekommen ist (Güstzeit). Bei der Erhebung weiterer klinischer Daten spielen die Befunde der inneren und äußeren Geschlechtsorgane eine entscheidende Rolle.
Hinzu kommt das Ergebnis der mikrobiologischen Untersuchung eines auf den jeweiligen Besamungsstationen entnommenen Zervix- oder Uterustupfers. Hierzu wurde bei den Stuten zunächst eine Vaginoskopie mit einem Polansky- Spreizspekulum (Eikemeyer, Tuttlingen) durchgeführt und anschließend ein Abstrich der Zervix und des Uterus mit einem Einmaltupfer (Vibac, Albrecht, Aulendorf) entnommen. Dieser wurde dann auf pathogene Keime untersucht und das Ergebnis bei der Zuordnung der Stute zu einem bestimmten „Score“ berücksichtigt (s. Tab. 4).
Tabelle 4:
Definition der Fruchtbarkeitsgruppen nach Merkmalen und Fruchtbarkeitsaussichten (MERKT et al. 1987)*
Fruchtbar- keitsgruppe
Merkmale Fruchtbarkeitsaussicht
Gruppe I Tragende Stuten und Maidenstuten ohne klinische oder bakteriologische Bedenken
70–100 %
Gruppe II Stuten ohne klinische oder bakteriologische Bedenken, die 1 Jahr güst geblieben sind
50–70 %
Gruppe III Stuten ohne klinische oder bakteriologische Bedenken, die länger als 1 Jahr güst sind sowie Stuten der Gruppe IV beziehungsweise V nach Abheilung
25–50 %
Gruppe IV Stuten, die klinische Krankheitserscheinungen zeigen oder bakteriologisch bedenklich sind
0–25 %
Gruppe V Stuten, die wegen erheblicher klinischer Krankheitserscheinungen oder aus anderen Gründen keine Aussicht auf Wiederherstellung mehr bieten
fast 0 %
* Die Einteilung der Stuten in die verschiedenen Fruchtbarkeitsgruppen erfolgte retrospektiv zur Zeit der Besamung. Dadurch waren aus den tragenden oder Maidenstuten mittlerweile laktierende oder Maidenstuten geworden. Die Fruchtbarkeitsprognose bleibt jedoch naturgemäß identisch.
Von den 196 in der eigenen Untersuchung eingesetzten Stuten, die endoskopisch besamt wurden, waren 118 (60,2 %) der Gruppe I, 44 (22,4 %) Gruppe II, 26 (13,3
%) Gruppe III und 8 (4,1 %) Gruppe IV zuzuordnen. Keine Stute fiel in Gruppe V.
3.1.1.2 Hengste
Bei den zum Einsatz gelangten Hengsten handelt es sich um drei Oldenburger Warmbluthengste (A, B, C). Sie waren zum Zeitpunkt der Untersuchung auf den jeweiligen Besamungsstationen eingestellt, zeigten keine klinischen Anzeichen einer Erkrankung und wurden alle parallel zur Besamung auch sportlich genutzt.
Bei zwei von ihnen (A, B) lagen die Befruchtungsergebnisse der letzten zwei Jahre (2000 u. 2001) vor, welche zur Kontrolle der Ergebnisse der endoskopischen Besamung aus 2001 herangezogen wurden. Der dritte Hengst (C) kam dagegen erstmals in den Besamungseinsatz. Zusätzlich wurden die spermatologischen Daten (Volumen, Dichte, Gesamtspermienzahl und Vorwärtsbeweglichkeit) der für die endoskopischen und gleichzeitig durchgeführten konventionellen Besamungen genutzten Ejakulate protokolliert und ausgewertet.
Die Hengste standen während der Versuchsdurchführung auf zwei verschiedenen EU-Deckstationen, wobei die Hengste B und C auf der selben Station eingestellt waren.
Hengst A:
Bei Hengst A handelt es sich um einen 1990 geborenen Warmbluthengst mit bekannter Fertilität. Im Jahr 2000 erreichten die von ihm besamten Stuten (n=223, Tab. 5) eine Trächtigkeitsrate von 61,4 % (d 16) pro Saison. Der Hengst steht seit seinem dritten Lebensjahr in der Zucht und wird parallel im Sport eingesetzt. Der züchterisch hoch angesehene und daher stark frequentierte Hengst mußte im Jahr
2000 aufgrund einer Torsion des linken Hodens einer Hemikastration unterzogen werden. Dieser Faktor führte dazu, dass der Hengst die wachsende Nachfrage nach Besamungsportionen nicht mehr erfüllen konnte. Die Kompensationsmöglichkeiten nach unilateraler Orchidektomie wurde auch von MERKT (1985) untersucht.
Es wurden die spermatologischen Befunde von 116 Protokollen aus dem Zeitraum der vorliegenden Untersuchung ausgewertet und in Kapitel 3.2.3 dargelegt.
Hengst B:
Bei Hengst B handelt es sich um einen 1992 geborenen Warmbluthengst, mit ebenfalls bekannten Fertilitätswerten. Im Jahr 2000 wurde bei den mit seinem Sperma belegten Stuten (n=391, Tab. 5) eine Trächtigkeitsrate von 81,8 % (d 16) pro Saison diagnostiziert.
Insgesamt wurden 16 Spermaprotokolle der Monate April und Mai 2001 ausgewertet (Kap. 3.2.3). Der Hengst befindet sich seit 1995 in der Zucht und wird wie Hengst A im Sport eingesetzt.
Hengst C:
Hengst C ist ein 1997 geborener Warmbluthengst, der im Versuchsjahr 2001 das erste Mal zur Besamung eingesetzt wurde, deshalb lagen keine anamnestischen Informationen über seine Fertilität vor.
Zur Beurteilung seines Spermas wurden die Spermaprotokolle von 42 Ejakulaten der Monate März bis Mai 2001 herangezogen (Kap. 3.2.3).
Von allen drei Hengsten wurden in der Zuchtsaison 2001 unterschiedlich große Gruppen von Stuten sowohl endoskopisch (Hengst A: n=108; Hengst B: n=20;
Hengst C: n=68) als auch konventionell (Hengst A: n=86; Hengst B: n=305; Hengst C: n=78) besamt (Tab. 5). Für die Zeit der Untersuchung wurde sowohl für die endoskopische wie auch für die konventionelle Besamung das Sperma der gleichen Ejakulate verwendet. Die Aufbereitung war ebenfalls identisch (s. Kap. 3.1.3), so dass die konventionell besamte Gruppe aus 2001 als direkte Kontrollgruppe für die endoskopisch besamte heranzuziehen ist.
Die konventionell besamten Stuten aus 2000 (n=614) sind als weitere Kontrolle vor allem für die konventionell besamten Stuten aus 2001 (n=469) einzuordnen (Kap.
3.1.7). Diese Werte wurden retrospektiv erhoben, weshalb keine weiteren Daten über die biologischen Daten der Stuten verfügbar sind. Die Größe der Stutengruppen folgte den Zwängen der Praxis und ist daher uneinheitlich.
Tabelle 5
Anzahl der endoskopisch und konventionell besamten Stuten unterteilt nach Jahrgängen und Hengsten.
Hengst Jahr endoskopisch
besamte Stuten (n)
konventionell besamte Stuten (n)
2000 0 223
Hengst A
2001 108 86
2000 0 391
Hengst B
2001 20 305
Hengst C 2001 68 78
3.1.2 Samenentnahme
Das verwendete Sperma wurde von allen drei Hengsten durch stationseigene Besamungstechniker mittels künstlicher Vagina (Modell „Hannover“, Minitüb, Tiefenbach b. Landshut) am Phantom gewonnen. Es stand jeweils ein höhenverstellbares Phantom (Modell „Celle“, Minitüb, Tiefenbach b. Landshut) zur Verfügung. Die Scheide wurde dabei mit einer sterilen Einmalfolie (TK Pharmatrade, Hasbergen) ausgekleidet und anschließend mit circa 55° C heißem Wasser befüllt, um bei der Samenentnahme eine Scheideninnentemperatur von ungefähr 42°-44° C zu gewährleisten. Das Sperma wurde mit Hilfe eines zuvor auf 40° C vorgewärmten Auffanglases gesammelt und anschließend sofort in das jeweilige stationseigene Samenlabor zur weiteren Aufbereitung gebracht.
3.1.3 Samenaufbereitung
Im Labor wurde das zuvor gewonnene Sperma makroskopisch und mikroskopisch untersucht. Dazu wurde es zunächst durch Gaze in einen Standzylinder filtriert und das gelfreie Volumen bestimmt. Anschließend wurden die Farbe und die Konsistenz des Ejakulates optisch ermittelt. Die Spermienkonzentrationsbestimmung erfolgte photometrisch (SpermaCue, Minitüb, Tiefenbach b. Landshut). Danach wurde das Sperma mit einem Magermilch-Glucose-Verdünner (KENNEY et al. 1975) im Verhältnis 1: 1 verdünnt und für 10 Minuten bei 870 x g (Hengst A) bzw. 1100 x g (Hengst B und C) zentrifugiert (Rotofix 32, Hettich, Tuttlingen).
Nach Teilresuspension und erneuter Dichtebestimmung mittels Zählkammer, wurde das Sperma bei Hengst A auf eine Dichte von 30 x 106, bei Hengst B von 20 x 106 progressiv motile Spermien pro ml Suspension eingestellt.
Bei Hengst C wurde bei einem Teil der Stuten unverdünntes Nativsperma benutzt;
bei einem anderen Teil wurde das Sperma auf eine Dichte von 5-20 x 106 vorwärtsbewegliche Spermien pro ml suspendiert. Für die Besamung der Stuten mit unverdünntem Sperma wurde zum jeweiligen Zeitpunkt die für die erwünschte Spermienzahl (100-200 x 106) notwendige Menge des Spermas entnommen.
In den Fällen, in denen unverdünntes Nativsperma (100-200 x 106 PMS) zur Besamung genutzt wurde, fand die Besamung innerhalb einer Stunde nach der Samenentnahme statt.
Aufbereitetes Sperma wurde zunächst gekühlt und anschließend in einem Zeitrahmen von 10 Minuten bis zu 9 Stunden nach der Samenentnahme verwandt.
3.1.4 Endoskopisch kontrollierte Insemination
3.1.4.1 Vorbereitende Maßnahmen
Die zur Besamung vorgesehenen Stuten wurden mit Hilfe eines Probierhengstes auf beiden Stationen täglich auf das Auftreten von Rosseanzeichen (Dulden des Hengstes, Schweifheben, Blitzen und Schleimabsetzen) kontrolliert. Desweiteren unterlagen sie mit Rossebeginn einer systematischen gynäkologischen Untersuchung. Dabei wurden zunächst alle 48 Stunden transrektal palpatorische und
ultrasonographische (100 Falco Vet, Pie Medical, Dorsten, 6 MHz) Befunde erhoben.
Hierbei wurden mit der Ultraschallsonde zunächst der Uteruskörper, die Bifurkation und die beiden Uterushörner dargestellt. Anschließend wurden beide Ovarien auf eventuell vorhandene Funktionskörper (Follikel, Gelbkörper) untersucht. Falls dabei ein oder mehrere Follikel mit einer Größe von > 3,5 cm vorgefunden wurden, verkürzte sich das Untersuchungsintervall auf 24 Stunden. Ein weiterer, zur Entscheidungsfindung herangezogener Parameter war die Follikelkonsistenz. Wies einer der Follikel eine deutliche, aber noch gespannte Fluktuation auf, wurde das Untersuchungsintervall ebenfalls auf 24 Stunden verkürzt. Zusätzlich diente die sonographisch ermittelte Ödematisierung (+,++,+++) der Gebärmutterschleimhaut der Rossebestimmung.
Der Inseminationstermin orientierte sich ebenfalls an den oben genannten Parametern. Als Auslöser wurden dabei sowohl die Follikelgröße (> 4 cm), die Follikelkonsistenz als auch ein sich zurückbildendes endometriales Mukosaödem der Gebärmutter (Radspeichenstrukturen) gewertet. Individuelle, auf vorher dokumentierten Untersuchungen beruhende Vorkenntnisse über Zyklusbesonderheiten einzelner Stuten wurden ebenfalls mit einbezogen, wobei versucht wurde, die Insemination möglichst kurz vor der erwarteten Ovulation durchzuführen.
Die endoskopisch durchgeführten Besamungen wurden bis zur sonographischen Feststellung der Ovulation in einem 24-stündigem Intervall wiederholt. Hierbei war die Darstellbarkeit eines Corpus hämorrhagicums oder eines Corpus luteums an der Position eines zuvor diagnostizierten Follikels ausschlaggebend.
Die Untersuchung der konventionell besamten Stuten wurde parallel zu den Versuchsstuten in gleicher Weise durchgeführt. Das verwendete Sperma war identisch zu dem, welches für die endoskopische Besamung genutzt wurde.
3.1.4.2 Inseminationstechnik
Die zur endoskopischen Besamung bestimmten Stuten wurden für die Insemination in einen Zwangsstand gestellt. Nach dem Einwickeln des Schweifes folgte eine gründliche Reinigung und Desinfektion des äußeren Genitales mit Dibromol® (TK Pharmatrade, Hasbergen). Für die hysteroskopische Kontrolle der Besamung wurde ein handelsübliches Koloskop (GIF-XQ 10, Olympus, Hamburg, Arbeitslänge 1600 mm, äußerer Durchmesser 9,4 mm, Arbeitskanaldurchmesser 2,8 mm, Abb. 1) verwendet, welches vor jeder Besamung mit Helipur N® (TK Pharmatrade, Hasbergen) desinfiziert wurde. Dieses wurde zunächst mit einer durch einen sterilen Einmalhandschuh (TK Pharmatrade, Hasbergen) geschützten Hand vaginal eingeführt und nach Auffinden der Portio vaginalis cervicis mit dem Ostium uteri externum, transzervikal in den Uterus vorgeschoben. Anschließend wurde der Uterus mit Hilfe eines CO2-Insufflators (AR-10-901, Dr. Fritz, Tuttlingen), der an eine mobile Gasflasche mit medizinischem CO2 angeschlossen wurde, bei einem Druck von 50 mm Hg distensiert, bis eine gute Übersicht über das Corpus uteri gegeben war. Die Verbindung vom Insufflator zum Endoskop wurde mit Hilfe eines Silikonschlauches, der an einer Seite mit einem Luerlock-Verschluß versehen ist, hergestellt. Dazu wurde der Luerlock-Verschluß an den Insufflator angeschlossen und das offene Ende an den Arbeitskanal des Endoskopes gekoppelt. Als Lichtquelle für das Endoskop diente ein tragbares Kaltlichtgerät (Typ B, Dr. Fritz, Tuttlingen, Abb. 1).
Anschließend wurde das Endoskop unter Sichtkontrolle in das ipsilaterale Uterushorn
zum präovulatorischen Follikel so weit vorgeschoben, bis die Eileiterpapille darstellbar war. Nun folgend wurde der CO2-Zufluß über den Arbeitskanal des Endoskopes unterbrochen und der sterile, zuvor mit dem Sperma befüllte Bronchoskopiekatheter aus Teflon (Länge 2200 mm, Durchmesser 2 mm, Dr. Fritz, Tuttlingen) über den Arbeitskanal bis zur Eileiterpapille vorgeführt. Dort wurde die Besamungsdosis (6-200 x 106 PMS, 0,2-20 ml) direkt auf oder in unmittelbarer Nähe der Papille abgesetzt und das Endoskop mitsamt Katheter wieder entfernt.
Abbildung 1: Koloskop (GIF-XQ 10, Olympus, Hamburg, Arbeitslänge 1600 mm, äußerer Durchmesser 9,4 mm, Arbeitskanaldurchmesser 2,8 mm) und tragbares Kaltlichtgerät (Typ B, Dr. Fritz, Tuttlingen)
