Untersuchungen über den Origin Recognition Complex (ORC)
und über den Replikationsinitiator Cdc6p
Dissertation
Zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
an der Universität Konstanz
vorgelegt von Esther Biermann
Konstanz, Januar 2004
Die vorliegende Dissertation wurde in der Zeit von Januar 2000 bis Dezember 2003 am Lehrstuhl für Molekulare Genetik unter der Leitung von Professor Dr. R. Knippers an der Universität Konstanz angefertigt.
Herrn Professor Dr. R. Knippers möchte ich für seine Förderung und wissenschaftliche Unterstützung, sowie sein stetes Interesse am Fortgang der Arbeit, die ich eigenverantwortlich gestalten durfte, danken.
Meinen Eltern gilt ein besonderer Dank, ohne die es überhaupt nicht möglich gewesen wäre dieses interessante Studium durchzuführen.
Für das freundliche Arbeitsklima und die gegenseitige Unterstützung möchte ich mich bei Martina Baack, Jens Baltin, Ekkehard Hiller, Hong-Gang Hu, Thomas Kapitza, Ferdinand Kappes, Sandra Kreitz, Monika Kulartz, Monika Petersen, Daniel Schaarschmidt, Ingo Scholten und Tanja Waldmann bedanken. Ein ganz besonderer Dank gilt Ekkehard Hiller, der mir bei der Bewältigung der Formatierung dieser Arbeit geholfen hat, sowie Martina und Moni, für die kritische Dursicht des Manuskriptes. An Martina geht noch mal ein extra Dankeschön, da sie mich in diesen Jahren ganz besonders mit nie ausgehenden Ideen und geistreichen Diskussionen unterstützt hat.
Nicht zu vergessen Gilles, der mittlerweile auch weiß was es mit Cdc6 und den ORC- Proteinen auf sich hat.
Last but not least einen Dank an meine Freundin Corinna, für die fachlich unterhaltsamen Mittags- und Kaffeepausengesprächen.
Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht in (Biermann, Baack et al. 2002):
Biermann, E., M. Baack, et al. (2002). "Synthesis and turn-over of the replicative Cdc6 protein during the HeLa cell cycle." Eur J Biochem 269(3): 1040-6.
Präsentation auf Konferenzen:
Esther Biermann, Martina Baack, Sandra Kreitz and Rolf Knippers (2002).
Synthesis and Turn-Over of the Replicative Cdc6 Protein during the HeLa Cell Cycle.
Weimar Conference of Genetics, Genetic Variation in Man and its Functional Implications, Conference Book, pp. 23
I
Verwendete Abkürzungen
aa Aminosäure(n)
Abb. Abbildung
ACE ARS-Konsensus-Element
α anti, alpha
mA Milliampere
amp Ampicillin
ARS Autonom replizierende Sequenz ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaar(e)
BSA Rinderserumalbumin
°C Grad Celsius
cDNA Komplementär-DNA
Cdc Cyclin-Division-Cell cycle Cdk Cyclin-dependent-Kinase cE Endkonzentration
CHIP Chromatin-Immunpräzipitation
chl Chloramphenicol
cpm counts per minute CTP Cytidintriphosphat DHFR Dehydrofolat-Reduktase Dm Drosophila melanogaster
DMEM Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium DMSO Dimethylulaminopurine
DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleotidtriphosphat DTT Dithiothreitol
DUE DNA Unwinding Element
ECL Enhanced Chemiluminescence EDTA Ethylendiamintetraacetat
EMSA Electromobility Shift Assay
FACS Flourescence Activated Cell Sorting FCS Fetal Calf Serum
g Gramm oder Erdbeschleunigung
gal Galaktose
µg Mikrogramm
GTP Guanosintriphosphat h Stunde(n)
Hepes N-2-Hydroxyethylpiperazin-N`-Ethansulfonsäure
IgG Immunglobulin
IP Immunpräzipitation IPTG Isopropyl-thiogalactosid
kb Kilobasenpaar(e)
kD Kilodalton
KCl Kaliumchlorid
LB Luria-Bertani Medium µl Mikroliter
II
µM Mikromolar
M Molar
MCM Minichromosome Maintenance MCS Multiple Cloning Site
min Minute
mg Milligramm
MgCl2 Magnesiumchlorid
ml Milliliter
mm Millimeter
mM millimolar
mRNA messenger RNA NaCl Natriumchlorid NaF Natriumflourid
ng nanogramm
NiNTA Nickel-NTA NP40 Nonident-P40 OD optische Dichte ODP Origin Decision Point
ORC Origin Recognition Complex p Protein
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung
PCR Polymerase-Ketten-reaktion (polymerase chain reaction) PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
pfu Plaque Forming Unit
pmol Pikomol
Rb Retinoblastom
RT Raumtemperatur
sec Sekunde
Sc Saccharomyces cerevisiae SDS Natriumdodecylsulfat s.o. siehe oben
sp Saccharomyces pombe
SDS Sodium Dodecyl Sulfat PAGE SDS-Polyacrylamid-Gel
siRNA silencing interferance Ribonuleinsäure S/MAR Scaffold/Matrix Attachment Region
SV Säulenvolumen
SV40 Simian Virus 40
Tab. Tabelle
TAE Tris-acetat-EDTA TBE Tris-borat-EDTA TDP Timing Decision Point
TE Tris-EDTA
Tris Tris-(hydroxymethyl)-Aminomethan TTP Thymidintriphosphat
u unit; enzymeinheit
üN über Nacht
UPR Upstream Promotor Region V Volt
vgl vergleiche
Xl Xenopus laevis
III
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1 Darstellungder CDK/Cyclin Komplexe während des Zellzyklus 4 Abbildung 1.2 Vektorkarte von pUPR 8 Abbildung 1.3Vorgänge während der Initiation der DNA-Replikation an
Säugerchromatin 10
Abbildung 1.4 Potentielle Mechanismen steuern ORC zu spezifischen
chromosomalen Bindestellen 14
Abbildung 1.5 Schematische Repräsentation des HsCdc6 Proteins 16 Abbildung 3.1 Übersicht des pAcGHLT-A Vektors der Firma BD Pharmingen 23 Abbildung 4.1Expression und Aufreinigung des ORC2-5-Komplexes in Hi-5-Zellen
38 Abbildung 4.2 Expression und Aufreinigung des ORC1-5-Komplexes und des
ORC1-5/Cdc6-Komplexes in Hi-5-Zellen 40
Abbildung 4.3 Charakterisierung der ORC2-5-, ORC1-5- und ORC1-5/Cdc6-
Komplexe durch Immunpräzipitation 42
Abbildung 4.4 Genomische Organisation der Gene PRKDC und MCM4 43 Abbildung 4.5 Aufreinigung von PCR-Produkten des UPR-Fragmentes und des Ex9- Kontrollfragmentes für Gelshift-Experimente 44
Abbildung 4.6 Die DNA-Bindung des ORC2-5-Komplexes erfolgt unabhängig von einer ATP-Hydrolyse 45
Abbildung 4.7 Die Bindung des ORC2-5-Komplexes an DNA erfolgt nicht spezifisch 46
Abbildung 4.8 Vektorkarte des pUPR-Derivates 48 Abbildung 4.9 Bindung von T-Antigen (T-Ag) an den SV40 Origin des pUPR im Target-Bound-Assay 50
Abbildung 4.10 Unspezifische Bindung von verschiedenen ORC-Komplexen an Fragmente des pUPR im Target-Bound-Assay 51
Abbildung 4.11 Unspezifische Bindung des ORC2-5-Komplexes an pUPR im
Target-Bound-Assay 53
Abbildung 4.12 Bindungsvergleich der ORC1-5- und Orc1-5/Cdc6-Komplexe an pUPR im Target-Bound-Assay 54
IV
Abbildung 4.13 Bindungsvergleich der ORC1-5- und Orc1-5/Cdc6-Komplexe an
pUPR im Target-Bound-Assay 55
Abbildung 4.14 Charakterisierung der unterschiedlichen Zusammensetzung von Komplexen durch Immunpräzipitationen 56
Abbildung 4.15 Vergleich der Bindungsaktivität von ORC1-5 und ORC1-5/Cdc6 mit dem ORC2-5-Komplex im Target-Bound-Assay 58
Abbildung 4.16 ORC1-5- und ORC1-5/Cdc6-Komplexe binden bevorzugt an lange und AT-reiche Sequenzen 69
Abbildung 4.17 Elektronenmikroskopische Aufnahmen der Bindung verschiedener ORC-Komplexe an Sma 1-geschnittener pUPR-DNA 60
Abbildung 4.18 Modell der ATP-Regulierung des ORC-Komplexes. „Clamp-Loader“- Modell 63
Abbildung 4.19Charakterisierung des Cdc6-Antikörpers 67
Abbildung 4.20 Intrazelluläre Lokalisierung von humanem Cdc6 68
Abbildung 4.21 Chromatin Fraktionierung 69
Abbildung 4.22 Lösliches und Chromatin-gebundenes Cdc6 70
Abbildung 4.23 Synthese von Cdc6 72
Abbildung 4.24 Phosphoryliertes Cdc6 in der S-Phase 73
Abbildung 4.25 Das Schicksal von neu synthetisiertem Cdc6 75
Abbildung 4.26 Halbwertszeit des Chromatin-gebundenen Cdc6 in der S-Phase 76
Abbildung 4.27 Analyse der Funktion von Cdc6 durch Cdc6-RNAi 78
Abbildung 4.28 Analyse des Status von MCM-Proteinen, ORC-Proteinen und Geminin in Cdc6-siRNA behandelten Kernen 79
Abbildung 4.29 Initiation der DNA-Synthese in G1-und S-Phase-Kernen mit cytosolischem Extrakt aus asynchron wachsenden Zellen 85
Abbildung 4.30 Initiation der DNA-Synthese in Kernen aus Mimosin-arretierten Zellen mit verschiedenen Extrakten und Zugabe von exogenem Cdc6 86
Abbildung 4.31 Initiation der DNA-Synthese in Kernen aus Mimosin-arretierten Zellen in cytosolischem Extrakt aus der S-Phase und Zugabe von exogenem Geminin 87
V
Abbildung 4.32 Initiation der DNA-Synthese in Kernen aus Mimosin-arretierten Zellen in verschiedenen Cdc6-depletierten Extrakten 89
Abbildung 4.33 Doppel-Markierung von S-Phase-Kernen während der Initiation der
DNA-Replikation 90
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 Die DNA-Replikation und der Zellzyklus 1
1.2 Origins – Startstellen der DNA-Replikation 5
1.2.1 Origins in niederen Eukaryonten 5
1.2.2 Origins und deren Nutzung in höheren Eukaryonten 6
1.3 Initiationsproteine der DNA-Replikation 9
1.3.1 Der Origin Recognition Complex (ORC) 11
1.3.1.1 Eine spezielle Rolle von Orc1 im ORC-Zyklus 11
1.3.1.2 Regulierung der ORC-Aktivität 12
1.3.1.3 ORC und DNA-Bindung 12
1.3.1.4 ORC: nicht nur für die Replikation 15
1.3.2 Das Cdc6 Protein 15
1.3.2.1 Lokalisierung und Regulierung des Cdc6-Proteins 17
1.3.3 Die MCM-Proteine 18
2 ZIELSETZUNG 20
3 MATERIAL UND METHODEN 21
3.1 Material 21
3.2 Methoden 25
3.2.1 Nachweise 25
3.2.2 Zellkultur 27
3.2.2.1 RNAi 28
3.2.2.2 Phosphatase-Verdau 28
3.2.2.3 Herstellung rekombinanter Baculoviren 28
3.2.2.4 Plaque-Assay 29
3.2.3 Proteinbiochemische Methoden 29
3.2.3.1 Zellfraktionierung 29
3.2.3.2 Chromatin-Fraktionierung 30
3.2.3.3 Immunfällungen 30
3.2.3.4 In-vitro-Replikationsassay 31
3.2.3.5 Affinitätsreinigung von Antikörpern 32
3.2.3.6 Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen 32
3.2.3.7 Aufreinigung von „Inclusion Bodies“ über NiNTA-Agarose 33
3.2.4 DNA-Methoden 34
3.2.4.1 „Polymerase Chain Reaction“ 34
3.2.4.2 Radioaktive Markierung von DNA 34
3.2.4.3 Biotin Markierung von DNA 35
3.2.4.4 FACS-Analyse 35
3.2.5 Protein-DNA Wechselwirkungen 35
3.2.5.1 EMSA (Electromobility Shift assay) 35
3.2.5.2 Target-Bound-Assay 36
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 37
4.1 Der humane ORC-Komplex und seine Eigenschaften in der DNA-Bindung 37 4.1.1 Herstellung des ORC-Komplexes mit dem Baculovirus- Expressionsystem 37
4.1.2 Charakterisierung des ORC-Komplexes 41
4.1.3 Die Wechselwirkung von ORC und DNA 43
4.1.3.1 Nachweis von ORC-DNA Interaktionen im Electromobility Shift Assay 44 4.1.4 In vitro DNA-Bindeaktivität von ORC an einem autonom replizierenden pUPR-Plasmid 47
4.1.4.1 pUPR 47
4.1.4.2 Prinzip und Bedingungen des Target-Bound-Assays 49 4.1.4.3 ORC-Bindung an unterschiedliche Regionen von pUPR 50
4.1.5 Diskussion 61
4.1.5.1 ORC-Bindung an DNA in Eukaryoten 61
4.1.5.2 Einfluss von Cdc6 auf die ORC-DNA-Interaktion 64
4.2 Charakterisierung des humanen Replikationsproteins Cdc6-Protein im HeLa-Zellzyklus 66
4.2.1 Herstellung von Antikörpern gegen hCdc6 66
4.2.2 Intrazelluläre Lokalisierung von hCdc6 67
4.2.3 Synthese von Cdc6 70
4.2.4 Modifizierung des Cdc6-Proteins während des Zellzyklus 72
4.2.5 Abbaurate von neu synthetisiertem Cdc6-Protein 74
4.2.6 Funktion von Cdc6 im Zellzyklus? Charakterisierung mittels RNAi-Experimente 77
4.2.7 Diskussion 80
4.2.7.1 Lokalisierung von Cdc6 80
4.2.7.2 Der Synthese-Zyklus von Cdc6 in HeLa-Zellen 80
4.2.7.3 Regulierte subzelluläre Verteilung von Cdc6 in HeLa-Zellen 81
4.2.7.4 Funktionen von Cdc6 81
4.3 Spezifische Initiation der DNA-Replikation in einem zellfreien System 83
4.3.1 Die Initiation der DNA-Replikation in vitro 83
4.3.2 Die Rolle der Initiationsproteine im zellfreien System 83
4.3.3 Diskussion 91
5 ZUSAMMENFASSUNG 95
6 LITERATURVERZEICHNIS 97
1 Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Die DNA-Replikation und der Zellzyklus
Die DNA-Replikation ist ein Vorgang, der zu einer Verdopplung der Erbsubstanz DNA in der Zelle führt. Sie ist die Voraussetzung dafür, dass jede Zelle nach der Teilung eine identische Kopie des Genoms erhält. Die Verdopplung der Zelle erfolgt innerhalb eines Zellzyklus. In normalen Zellen ist dieser Zellzyklus ein hoch regulierter Prozess und besteht aus 4 unterscheidbaren Phasen: G1-Phase (Vorbereitung der DNA-Replikation), S-Phase (Synthese-Phase; DNA-Replikation), G2-Phase (Vorbereitung für die Mitose) und M-Phase (Mitose). Vor der Mitose muss jede Zelle entscheiden, ob sie in die G1-Phase läuft, was eine Zellteilung mit sich führt, oder ob sie in einen Ruhezustand geht (G0-Phase).
Von zentraler Bedeutung sind jene Mechanismen, die den Beginn (Initiation) der DNA-Replikation in mehrzelligen Organismen kontrollieren, denn dieser ist für den weiteren ungestörten Verlauf des Zellzyklus entscheidend. Kontrollmechanismen sorgen dafür, dass alle Abschnitte des Genoms exakt einmal repliziert werden;
sowohl Über- als auch Unterreplikation einzelner DNA-Abschnitte hätte für die Zelle fatale Folgen.
Ein DNA-Abschnitt, der von einem Replikationsstartpunkt aus repliziert wird, heißt Replikon. Ein eukaryotisches Chromosom wird von mehreren Stellen aus repliziert, hat also mehrere Replikons. Die Replikation beginnt am „Origin“ (Ursprung) und läuft, wenn sie einmal begonnen hat, solange weiter bis das gesamte Replikon verdoppelt ist. Damit das gesamte Genom, beim Menschen bestehend aus 3 Milliarden Basenpaaren, einer eukaryotischen Zelle beim Zellzyklus verdoppelt wird, muss die Replikation an vielen Origins gleichzeitig oder kurz nacheinander initiiert werden.
Man schätzt, dass beim Menschen etwa 3000 dieser Origins über das Genom verteilt vorliegt. Die Entscheidung für eine anstehende Replikation des Genoms in der S- Phase wird bereits zu einem frühen Zeitpunkt in der G1-Phase getroffen (TDP, Timing Decision Point) (Dimitrova and Gilbert 1999). In der späten G1-Phase gibt es einen weiteren Punkt, der beim Passieren die Spezifität der Initiation der DNA- Replikation festlegt (ODP, Origin Decision Point) (Wu and Gilbert 1996; Li, Chen et al. 2001).
1 Einleitung 2 Am Ende der G1-Phase werden an den Origins Prä-Replikationskomplexe aufgebaut, die aus Initiationsfaktoren bestehen. Zu Beginn der S-Phase kommt es zur Aktivierung von „frühen“ Origins in euchromatischen Bereichen. Origins, welche in dem dichter gepackten Heterochromatin lokalisiert sind, werden erst im Verlauf der S-Phase aktiviert („späte“ Origins).
Die Replikation kann uni- oder bidirektional erfolgen, je nachdem ob sich eine oder zwei Replikationsgabeln vom Origin wegbewegen. In der Replikationsgabel synthetisiert ein Multienzymkomplex die beiden Tochterstränge. Dieser Enzymkomplex enthält neben anderen Proteinen die DNA-Polymerasen, welche Desoxynukleotide zu langen Polynukleotidketten verknüpfen. Am Ende der S-Phase ist die Replikation des Genoms beendet.
Die vier Phasen des eukaryontischen Zellzyklus laufen in einer streng regulierten Reihenfolge ab und werden zum großen Teil von speziellen Proteinkinasen reguliert (u.a. Cyclin-abhängige Kinasen, CDK) (Fantes and Brooks).
Alle CDKs ähneln sich strukturell untereinander und benötigen für ihre Aktivität so genannte Cycline. Das bedeutet, dass eine aktive CDK ein Heterodimer ist bestehend aus einer regulatorischen Einheit, dem Cyclin, und einer katalytischen Einheit, der Kinase (cdk). Diese Faktoren werden Zellzyklus-abhängig synthetisiert und abgebaut (Peeper, Parker et al. 1993; Amon, Irniger et al. 1994; Nurse 1994).
Welche möglichen Komplexe sich bilden können und welche Funktionen sie haben, ist in Tabelle 1 zusammengefasst:
Katalytische Untereinheit
Regulatorische Untereinheit
Funktion
Cdc2 (=Cdk1) Cyclin A, B1, B2, B3 G2/M Übergang
Cdk2 Cyclin A, E, D1, (D2, D3) G1/S Übergang, S-Phase
Cdk3 ? G1/S Übergang
Cdk4 Cyclin D1, (D2 ?), D3 G0/G1 (G1/S ?) Übergang Cdk5 Cyclin D1, (D2, D3 ?) Phosphoryliert Neurofilamente Cdk6 Cyclin D1, (D2, D3) G0/G1 (G1/S ?) Übergang
Cdk7 Cyclin H Aktiviert Cdk1-6
Tabelle 1.1 CDK/Cyclin-Komplexe und ihre Funktionen (nach Nigg EA., 1995, Bioessays)
1 Einleitung 3 Zusätzlich wird die Aktivität der CDK/Cyclin-Komplexe durch Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsvorgänge gesteuert. Demnach können CDKs zu bestimmten Phasen des Zellzyklus gebildet und aktiviert werden, dies wiederum ist wichtig für die Regulierung der S- und M-Phase.
Ebenfalls eine große Rolle bei der Regulation von Cyclin-abhängigen Kinasen spielen die CDK-Inhibitoren (Elledge and Harper 1994). p21 ist der erste Inhibitor, der in Säugerzellen identifiziert wurde (el-Deiry, Tokino et al. 1993; Gu, Turck et al.
1993). p21 wurde als CDK-Bindeprotein entdeckt. Seine Expression ist in alternden Zellen verstärkt und kann durch das Tumor Suppressorprotein p53 induziert werden.
p21 kann verschiedene CDK/Cyclin Komplexe inhibieren, sehr wahrscheinlich durch die Blockierung der Interaktion mit Substraten. Einerseits hemmt p21 die CDKs und bewirkt so einen Stopp im Zellzyklus (Gu, Turck et al. 1993; Harper, Adami et al.
1993; Xiong, Hannon et al. 1993), andererseits wirkt p21 als Inhibitor für PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen, Untereinheit der DNA-Polymerase δ) (Flores- Rozas and Hurwitz 1993; Li, Waga et al. 1994), was einen unmittelbaren Stopp der DNA-Replikation zur Folge hat.
Substrate der CDK/Cyclin-Komplexe kann man in zwei Gruppen einteilen: zum einen Proteine, die in die Transkription involviert sind (z.B. Transkriptionsfaktoren wie p53, Regulatoren der Transkriptionsfaktoren) und die Expression von S-Phase Genen kontrollieren, und zum anderen Komponenten der DNA-Synthese Maschinerie (DNA Polymerasen, RPA). Das am besten untersuchte Substrat am Übergang der G1/S- Phase ist das Retinoblastom Gen Produkt pRb. Nach der Zellteilung liegt pRb mit bestimmten Transkriptionsfaktoren (E2F/DP) komplexiert vor. Früh im Zellzyklus löst sich pRb von diesen Transkriptionsfaktoren ab. Während der G1-Phase wird pRb über CDK/Cyclin Komplexe phosphoryliert, was zu einer Ablösung und Aktivierung der E2F/DP Transkriptionsfaktoren führt. Das ist notwendig für eine folgende DNA- Synthese.
1 Einleitung 4
Abbildung 1.1 Darstellung der CDK/Cyclin Komplexe während des Zellzyklus
1 Einleitung 5 1.2 Origins – Startstellen der DNA-Replikation
Innerhalb von größeren Replikationszonen findet man mehrere Origins (Startstellen der bidirektionalen DNA-Replikation). Sie werden dann als „Replikons“ bezeichnet (Berezney, Dubey et al. 2000). Schon vor über 40 Jahren wurde von Jacob et al. ein sogenanntes „Replikon-Modell“ vorgeschlagen (Jacob and Brenner 1963).
Dieses Modell postuliert, dass die DNA-Replikation von spezifischen chromosomalen Sequenz-Elementen (Replikatoren) aus initiiert wird und diese wiederum von positiven regulatorischen Elementen (Initiatoren) erkannt werden.
In Studien an E.coli, anderen Bakterien, Bakteriophagen und eukaryotischen Viren wurden solche Initiatoren ebenfalls entdeckt und somit das Modell bestätigt.
1.2.1 Origins in niederen Eukaryonten
Viele bakterielle und virale Origins funktionieren weiterhin normal und korrekt, wenn sie in Plasmide kloniert sind. Dies hat die Studien um einiges vereinfacht, da Replikatoren normalerweise in großen und langen Chromosomen vorliegen, die schlecht zu manipuliert werden können. Die Strukturen mehrerer prokaryotischer und viraler Replikatoren sind mittlerweile im Detail untersucht und es wurde gefunden, dass es sich hierbei um hoch konservierte Sequenzen handelt.
Die am besten charakterisierten Origins in Eukaryoten sind die ARS-Sequenzen (autonomously replicating sequences) in der Hefe Saccharomyces cerevisiae, diese bewirken autonome (episomale) Replikation in Plasmiden (Brewer and Fangman 1987; Heinzel, Krysan et al. 1991). Mutationsanalysen der ARS-Elemente identifizierten zum einen ein essenzielles, konserviertes AT-reiches 11 Basen langes Element, das so genannte ACS- (ARS consensus sequence) (Newlon et al, 1996) oder A-Element und zum anderen drei 10-15 Basen lange B-Elemente (B1-3), die ebenso zur Origin Funktion gehören (Marahrens and Stillman 1992). Das ACS- und B1-Element ist als Bindestelle für den Origin Recognition Complex (ORC) identifiziert worden (Diffley and Stillman 1988; Rowley, Cocker et al. 1995). Punktmutationen in der ACS-Region verhindern eine ORC-Bindung, was zu einem Verlust der Replikator-Aktivität führt. Dies beweist, dass die ORC Proteine eine wichtige Rolle in der Aktivierung der Origins spielen. Die B2-Sequenz dient möglicherweise als Entwindungselement der DNA (DUE, DNA Unwinding Element) (Umek and Kowalski 1988; Kowalski and Eddy 1989). Das B3-Element hingegen ist eine Protein-
1 Einleitung 6 Bindestelle für den ARS Bindefaktor 1 (ABF1), der als Transkriptionsfaktor agiert (Diffley and Stillman 1988).
Die Bindung an die ACS-Sequenz wird in einer ATP-abhängigen Reaktion über die Untereinheiten ORC1-5 vermittelt (Lee and Bell 1997). Im Vergleich hierzu ist in Saccharomyces pombe nur ScOrc4 für die Bindung an spezifische, asymmetrische AT-reiche Sequenzen verantwortlich. Dies erfolgt in einer ATP-unabhängigen Weise.
In verschiedenen Organismen sind Anzahl und Lage der Origins über die Stadien der Entwicklung reguliert. Beispiele für solche Änderungen in Origins wurden während der Entwicklung von Drosophila melanogaster und Xenopus laevis gefunden. Die schnelle DNA-Replikation in den frühen Embryonen dieser Spezies wird durch Tausende von Origins vermittelt, die weniger als 4-7 kB voneinander entfernt liegen (Blumenthal, Kriegstein et al. 1974). Später in der Entwicklung verringern sich die Distanzen der Inter-Origins, indem die Anzahl der Replikatoren um das zehnfache reduziert werden (Hyrien, Maric et al. 1995; Sasaki, Sawado et al. 1999).
Interessanterweise zeigen in vitro Experimente mit Extrakten aus Froscheiern, dass keine Sequenz Spezifität für die Initiation der DNA-Replikation benötigt wird (Coverley and Laskey 1994). In mehreren Studien hat man versucht, Replikatoren zu finden, die den ARS-Elementen in S.cerevisiae ähneln. In eukaryotischen Organismen wurden jedoch keine Elemente gefunden.
1.2.2 Origins und deren Nutzung in höheren Eukaryonten
Die Versuche in höheren Eukaryoten Origins zu identifizieren, hat sich als einiges schwieriger erwiesen.
Trotzdem konnten bis heute um die 20 Origins bidirektionaler Replikation (OBR) identifiziert werden, indem man mehrere Arten von Untersuchungen durchgeführt hat, wie die DNA-2D-Gelelektrophorese oder Nascent Strand Assays. Mit der DNA- 2D-Gelelektrophorese lassen sich Replikationszwischenprodukte wie Replikationsgabeln und –blasen identifizieren. Dadurch entdeckte man Initiationszonen von 4-55 kB, in denen keine spezifischen Origins lokalisiert werden können (Dijkwel, Vaughn et al. 1991; DePamphilis 1993; Gencheva, Anachkova et al.
1996). Untersuchungen an neu synthetisierter oder naszierender DNA mittels Nascent Strand Assays haben gezeigt, dass es Initiationsereignisse an spezifischen Startstellen von 0,5-2 kB gibt (DePamphilis 1999). Zwei bekannte Arten von Origins sind mittlerweile beschrieben (Gilbert 2001). In der ersten Gruppe findet die Initiation
1 Einleitung 7 an relativ diskreten chromosomalen Stellen statt. Zu dieser Klasse gehört zum einen der Lamin B2 Genlocus und zum anderen der humane β-Globin Genlocus, an dem Replikation an einer ca. 4 kB großen Region zwischen den δ-Globin und β-Globin Genen initiiert wird (Abdurashidova, Deganuto et al. 2000). Die zweite Klasse von Origins hat größere Zonen der Initiation, 10-50 kB Regionen, an denen die Replikation von mehreren verstreuten Stellen aus beginnt. Typisch für diese Gruppe ist der DHFR Locus aus Hamsterzellen, der eine 55 kB große intergenische Region mit mindestens 20 Initiationsstellen enthält, die mit unterschiedlichen Effizienzen initiieren (Dijkwel, Wang et al. 2002). Untersuchungen an neu synthetisierter DNA identifizierten im DHFR-Locus 3 bevorzugte primäre Initiationsstellen: ori-β, der 17 kB stromabwärts vom 3`-Ende des DHFR-Gens liegt (Burhans, Selegue et al. 1986;
Burhans, Vassilev et al. 1990; Pelizon, Diviacco et al. 1996), ori-β`, der 5 kB stromabwärts vom ori-β lokalisiert ist (Kobayashi, Rein et al. 1998) und der ori-γ, der 23 kB weiter stromabwärts vom ori-β liegt (Anachkova and Hamlin 1989; Leu, Anachkova et al. 1990). Die Wahl der Initiationsstellen wird während der Entwicklung immer mehr eingeschränkt, als eine Konsequenz von Änderungen des Chromatins oder Kernstrukturen und Genexpression (Hyrien, Maric et al. 1995). So selektiert die Kernstruktur, welche der möglichen Initiationsstellen benutzt werden (Jesuiten- Modell) (DePamphilis 1993; DePamphilis 1993). Trotz der Entdeckung dieser Origins wurden keine Konsensus Sequenzen identifiziert. Nur drei beschriebene humane Origins, nämlich der Lamin B2 Origin, die PRKDC/MCM4 intergenische Region und eine Region aufwärts vom humanen TOP1 Gen, haben gezeigt, dass sie mit ORC in vivo interagieren (Abdurashidova, Deganuto et al. 2000; Keller, Ladenburger et al.
2002; Ladenburger, Keller et al. 2002).
Man findet jedoch häufig AT-reiche Elemente, die vermutlich als Entwindungszone dienen und von CpG-reichen Abschnitten umgeben sind. Diese liegen oft stark methyliert vor (Araujo et al, 1998). Sequenzanalysen zeigten, dass CpG-Inseln bei neu synthetisierter DNA um das zehnfache angereichert sind. Sie liegen häufig mit Promotoren von Haushaltsgenen vor. Interessanterweise wurden die meisten der untersuchten humanen Origins in Promotorbereichen von aktiv transkribierten Genen identifiziert (Keller, Hyrien et al. 2002; Keller, Ladenburger et al. 2002; Ladenburger, Keller et al. 2002).
Auch Komponenten der Kernmatrix haben eine wichtige Funktion bei der DNA- Replikation, denn es wurde gezeigt, dass diese oft mit neu synthetisierter DNA
1 Einleitung 8 assoziiert sind (Laskey, Gorlich et al. 1996). Analysen zeigten, dass die innere Kernmatrix Enzyme für die Transkription und DNA-Replikation enthält (Hassan and Cook 1993; Hozak, Hassan et al. 1993; Jackson, Hassan et al. 1993). Auch die S/MAR (scaffold/matrix attachment region) Region scheint eine Rolle bei der Replikation zu haben. An dieser Stelle wird die DNA mit der Kernmatrix verankert.
Die Bindung der superhelikalen DNA an die Kernmatrix, wo es dann zur Initiation der Replikation kommt, wird von der S/MAR initiiert (Cook 1999).
Der pUPR-Vektor: Ein Modell mit einigen Kombinationen von genetischen Elementen und einem Promotor ist der pEPI 1-Vektor. Er entstand aus dem pGFP- C1 Plasmid (Clontech), in dessen Polylinker die S/MAR aus der 5’-Region des humanen Interferon β-Gens (Bode, Kohwi et al. 1992) einkloniert wurde.
Abbildung 1.2 Vektorkarte von pUPR. Der pUPR-Vektor (7184 bp) enthält verschiedene funktionelle Elemente. MCS: multiple cloning site; SV40 ori: SV40 origin of replication; Neo/Kan:
Resistenzgen aus Tn5 für Kanamycin bei Prokaryoten bzw. G418 bei Eukaryoten; HSV TK polyA:
Herpes-Simplex-Virus Thymidinkinase-Polyadenylierungssignal; pUC ori: pUC-Origin; pCMV:
Immidiate Early Promotor des humanen Cytomegalievirus; GFP: Green Fluorescent Protein-Gen
Diese zirkuläre DNA repliziert extrachromosomal über hundert Generationen in CHO (chinese hamster ovary) (Piechaczek, Fetzer et al. 1999) und HeLa Zellen (Schaarschmidt, Baltin et al. 2004). Es konnte gezeigt werden, dass pEPI mit Metaphase-Chromosomen assoziiert stabil im Kern vorliegt (Baiker, Maercker et al.
1 Einleitung 9 2000), wobei der Vektor spezifisch mit dem Matrixprotein SAF-A (Scaffold Attachment Factor A) interagiert (Jenke, Fetzer et al. 2002). In dieser Arbeitsgruppe wurde die UPR-Region aus dem MCM4-Promotorbereich stromaufwärts über eine BglII-Schnittstelle vor das S/MAR-Element kloniert (Jens Baltin, Diplomarbeit 2003, Konstanz).
Neueste Untersuchungen ergaben zudem, dass Orc1, Orc2 und Mcm3 in vivo mit pUPR assoziiert vorliegen (Schaarschmidt, Baltin et al. 2004). Eine spezifische Bindestelle konnte nicht gefunden werden, die Formation des Prä- Replikationskomplexes scheint demnach sequenzunabhängig an pEPI-1 zu erfolgen.
1.3 Initiationsproteine der DNA-Replikation
Jeder Abschnitt des Genoms wird während der S-Phase nur einmal repliziert. Dieser Prozeß wird durch so genannte Initiatoren kontrolliert. Da in allen untersuchten Eukaryoten homologe Replikationsfaktoren identifiziert wurden, liegt die Vermutung nahe, dass die Initiation der DNA-Replikation in der Natur ein konservierter Prozess ist (Bogan, Natale et al. 2000; Bell and Dutta 2002). Eukaryotische DNA-Replikation beginnt in der G1-Phase mit der Bildung des Prä-Replikationskomplexes (Abbildung 1.3). Der erste Schritt ist die Bindung des hexameren ORC-Komplexes an die DNA (Bell and Dutta 2002). In Xenopus Eiextrakten liegt der gesamte XlORC-Komplex stabil vor und bindet auch so an die DNA. HsORC existiert nur als stabiler HsORC2-5 Komplex, an den zum Teil HsOrc1 und HsOrc6 assoziiert sind. Mit der Bindung der ORC-Proteine ist eine Art Plattform entstanden, die es ermöglicht, weitere Proteine wie Cdc6 und Cdt1 auf die DNA zu laden. Dabei kommt es zu einer Bindung zwischen Cdc6 und Orc1. Sie werden benötigt, um eine weitere Protein-Gruppe, nämlich MCM2-7 an das Chromatin zu rekrutieren. Der MCM2-7-Komplex scheint eine Helikase-Aktivität zu besitzen, die notwendig ist für die Entwindung der parentalen DNA Stränge. Der Prä-Replikationskomplex wird nach der Bindung von Mcm10 aktiviert (Wohlschlegel, Dhar et al. 2002). Ebenso wie das Orc1-Protein wird Cdc6 in Eiextrakten durch Cdc45 ersetzt. Dies passiert durch die Hilfe von Cdc7/Dbf4 und Cdk2/Cyclin E.Cdc45 assoziiert dann mit der DNA-Polymerase α. Dieser Schritt leitet den Beginn der S-Phase ein.
Während des Übergangs in die S-Phase wird Cdc6 phosphoryliert und von der DNA abgelöst, in höheren Eukaryonten bleibt jedoch ein großer Teil am Chromatin gebunden. Man vermutet, dass die Phosphorylierung von Cdc6 ein
1 Einleitung 10 Kontrollmechanismus ist, der eine Re-Initiation verhindern soll. Allerdings wurde bei Mutationsanalysen mit einer nicht-phosphorylierbaren Cdc6-Variante gefunden, dass die Re-Initiation nicht stattfindet, was auf die Existenz weiterer regulatorischer Faktoren hinweist (Pelizon, Madine et al. 2000; Petersen, Wagener et al. 2000).
Einer dieser Mechanismen ist die Inhibierung von Cdt1 durch Geminin, ein Protein, das während der S- und G2-Phase gebildet und in der Mitose abgebaut wird (Wohlschlegel, Dwyer et al. 2000; Tada, Li et al. 2001). Geminin konnte bisher nicht in Hefe identifiziert werden, aber in Hefe wie auch in Säugerzellen wird Cdt1 während der S-Phase degradiert (McGarry and Kirschner 1998; Li, Zhao et al. 2003).
Die kombinierte Inaktivierung von Cdc6 und Cdt1 verhindert die erneute Bindung von MCM2-7 an den ORC-Komplex. Aber auch die MCM-Proteine selber werden in der S-Phase phosphoryliert und vom Chromatin abgelöst.
Abbildung 1.3 Vorgänge während der Initiation der DNA-Replikation an Säugerchromatin (nach DePamphilis, 2003). Oberes Bild: Metaphase-Chromatin von kultivierten, somatischen Säugerzellen, inkubiert in Xenopus Eiextrakt. Unteres Bild: DNA-Replikation in kultivierten, somatischen Säugerzellen (nach DePhamphilis, 2003)
1 Einleitung 11
1.3.1 Der Origin Recognition Complex (ORC)
Der Origin Recognition Complex wurde erstmals aus S. cerevisiae isoliert und besteht aus sechs heterogenen Untereinheiten, ScORC1-ScORC6 (Bell and Stillman 1992). In Hefe bindet dieser Komplex an ARS-Elemente, um so weitere Initiationsfaktoren an das Chromatin zu rekrutieren. Mittlerweile wurden homologe Proteine auch in anderen Spezies gefunden und folgendermaßen bezeichnet (hOrc1:
118 kD, hOrc2: 69 kD, hOrc3: 72 kD, hOrc4: 45 kD, hOrc5: 50 kD, hOrc6: 33 kD).
1.3.1.1 Eine spezielle Rolle von Orc1 im ORC-Zyklus
Der ORC-Zyklus wurde erstmals in Säugerzellen entdeckt (Natale, Li et al. 2000;
Kreitz, Ritzi et al. 2001). In diesen Zellen löst sich die Orc1-Untereinheit während der S-Phase selektiv vom restlichen Komplex ab, wird ubiquitiniert und abgebaut.
Die zellulären Konzentrationen, wie auch die Mengen an chromatin-gebunden ORC2-6 scheinen über den Zellzyklus konstant zu sein. Trotz allem gibt es hier Veränderungen in der Verteilung der ORC-Untereinheiten, was bedeuten könnte, dass es neben der Regulation in der DNA-Replikation noch andere Funktionen gibt.
Lösliches und gebundenes Orc6 verbleibt konstant im Zellzyklus (Dhar and Dutta 2000; Mendez and Stillman 2000). Es wurden zum Beispiel bestimmte Mengen Orc6 an nicht-chromosomalen Stellen in mitotischen Zellen gefunden (Prasanth, Prasanth et al. 2002). Dieses Orc6 stammt vermutlich aus einer Fraktion, die nicht mit den restlichen ORC-Proteinen assoziiert ist.
Orc1 ist einzigartig darin die ORC-Aktivität in einer Zellzyklus-abhängigen Art zu regulieren. Im Verlauf der G1-Phase bindet Orc1 zusammen mit den anderen ORC- Proteinen an das Chromatin und bildet so eine Plattform für die Assoziierung weiterer Initiationsfaktoren. Im Gegensatz zu den anderen ORC-Proteinen ist Orc1 während der S- und M-Phase vom Chromatin abgelöst. Diese Beobachtungen wurden gestützt durch „footprint“-Experimente am humanen Lamin B2 Origin, an dem man Zellzyklus- abhängige Veränderungen festgestellt hat (Abdurashidova, Riva et al. 1998). Ein großer G1-Phase footprint ändert sich in einen kleiner werdenden während der S- und G2-Phase, der dann in der M-Phase völlig verschwindet. Diese Veränderungen sind auf das Orc1-Protein zurückzuführen.
Das in der S-Phase abgelöste Orc1 wird polyubiquitiniert und über das 26S Proteasom abgebaut (Fujita, Ishimi et al. 2002; Mendez, Zou-Yang et al. 2002).
1 Einleitung 12 Mehrere Beobachtungen weisen daraufhin, dass Orc1 verantwortlich für einige regulatorische Schritte bei der Bildung des Prä-Replikationskomplexes ist. Erstens wird die HsOrc1- wie auch DmOrc1-Expression (nicht aber HsOrc2) über E2F reguliert (Ohtani, DeGregori et al. 1996), einem Transkriptionsfaktor, der bei dem Übergang der G1- zur S-Phase eine wichtige Rolle spielt. E2F reguliert ebenfalls die Expression von Cdc6 und den MCM Genen (Ohtani, Tsujimoto et al. 1998; Yan, DeGregori et al. 1998). Somit hängt die Bildung des Prä-Replikationskomplexes vom E2F/Rb Weg ab.
Zweitens ist das Orc1-Gen das einzige ORC-Gen, welches nur in proliferierenden Zellen exprimiert wird und drittens leitet die stabile Bindung von Orc1 mit dem Chromatin die Bildung des Prä-Replikationskomplexes ein.
1.3.1.2 Regulierung der ORC-Aktivität
Zwei wichtige Mechanismen dieser Regulierung wurden oben schon erwähnt: Die Ubiquitinierung von Orc1, die eine Re-Assoziierung von den Orc1 an das Chromatin während der S-Phase verhindern soll. Und die Phosphorylierung von Orc1 (Tatsumi, Tsurimoto et al. 2000). Somit scheint die Cyclin-abhängige Phosphorylierung ein Mechanismus zu sein, der Orc1 beim Übergang in die S-Phase vom Chromatin ablöst.
Eine weitere wichtige Rolle spielen auch noch andere Protein-Interaktionen. Zum Beispiel bindet HsOrc1 Cdc6-Protein (Saha, Chen et al. 1998). Der Orc1/Cdc6- Komplex bindet spezifisch den ORC2-6-Komplex, der über mehrere Stellen im Genom verteilt vorliegt (Jesuiten-Modell) (DePamphilis 1993; DePamphilis 1999).
Des Weiteren bindet Orc1 eine Komponente des Ubiquitinierungs-Weges, Skp2, der in der S-Phase benötigt wird (Mendez, Zou-Yang et al. 2002). Eine andere Regulierung der ORC-Proteine geht zum Beispiel über Sic1, einem spezifischen Inhibitor von Cdk´s, der verhindert, dass die S-Phase spezifische Cdk1/Clb5-Kinase in S.cerevisiae mit ORC interagiert.
1.3.1.3 ORC und DNA-Bindung
Am besten untersucht ist die Bindung von ORC in S.cerevisiae. Dort bindet ScORC an die ACS- und B1-Elemente. Protein-DNA Crosslink Studien zeigen, dass 4 von 6 ScORC-Untereinheiten (ScOrc1, ScOrc2, ScOrc4 und ScOrc5) Kontakt zur DNA haben (Lee and Bell 1997). Im Vergleich dazu werden alle ORC-Untereinheiten in Drosophila für eine effiziente DNA-Bindung benötigt (Chesnokov, Remus et al. 2001).
1 Einleitung 13 Weitere Experimente zeigten, dass ORC in mehreren anderen Organismen DNA- Sequenzen mit bekannten Replikatoren in vivo erkennt. Chip-Analysen fanden eine Bindung von DmORC mit Elementen des ACE3-Origins (Austin, Orr-Weaver et al.
1999). DmORC interagiert mit multiplen Sequenzen dicht an ACE3. Eine Spezifität konnte nicht gezeigt werden. Bisher konnten keine weiteren Konsensus ORC- Bindestellen identifiziert werden. Studien zeigten, dass HsORC zwar eine starke DNA-Bindeaktivität hat, welche durch ATP stimuliert wird, aber sequenzunabhängig an AT-reiche Nukleotide bindet. Somit unterscheidet HsORC nicht zwischen DNA- Fragmenten mit Origins und Kontroll-DNA (Vashee, Cvetic et al. 2003).
Im Vergleich zu anderen ORC Analogen enthält SpORC ein klares DNA-Bindemotiv:
SpOrc4 enthält neun Folgen von „AT-hook“ -Motiven (Chuang and Kelly 1999), welche erstmals als DNA-Bindedomäne in HMG-Proteinen identifiziert wurden und AT-reiche Stellen im Chromatin erkennen (Reeves and Beckerbauer 2001). Somit liegt es nahe, dass SpOrc4 zu einem großen Teil für die Sequenzspezifität von SpORC verantwortlich ist.
Es gibt noch weitere Mechanismen, die für die Selektion von spezifischen Origins verantwortlich sind.
Eine Assoziierung von anderen Faktoren könnte die ORC-Bindung beeinflussen. Ein guter Kandidat für die Erhöhung der DNA-Spezifität von ORC wäre Cdc6. Die Interaktion zwischen ORC und Cdc6 reduziert die „Ablöserate“ von ORC von Origins, jedoch nicht von unspezifischen Fragmenten. Dieser Mechanismus benötigt ein intaktes ATP-Bindemotiv von Cdc6. Zusätzlich kann die Interaktion die Konformation von einer oder mehreren ORC-Untereinheiten ändern, was zu einer verstärkten Interaktion mit den Origins führt (Mizushima, Takahashi et al. 2000; Harvey and Newport 2003). (Abbildung 1.4)
Auch andere Faktoren sind in der Lage mit der DNA interagieren und leiten dann ORC zu spezifischen Stellen an das Genom. Ebenso können Eigenschaften von Chromatinstrukturen an bestimmten Stellen dem ORC-Komplex Funktionsregionen zu weisen. Zum Beispiel sind offene Chromatinstrukturen leichter zugänglich für Replikations- oder Regulationsfaktoren. Darüber hinaus haben in vivo Studien gezeigt, dass Nukleosomen, die über einen Origin Bereich verteilt sind, die Origin Funktion inhibieren können (Simpson 1990).
Modifikationen wie Methylierungen limitieren ebenfalls Stellen am Chromatin, an denen sich Prä-Replikationskomplexe formieren können. Methylierte DNA kann nicht
1 Einleitung 14 initiieren (gezeigt in Xenopus Eiextrakten), da die Bindung von ORC an diese modifizierte DNA inhibiert ist (Harvey and Newport 2003).
Abbildung 1.4 Potentielle Mechanismen steuern ORC zu spezifischen chromosomalen Bindestellen. (A) Stabilisierte Bindung durch weitere Replikationsfaktoren wie Cdc6. (B) Sequenzspezifische DNA Bindefaktoren leiten ORC durch Protein-Protein-Interaktionen an das Chromatin. (C) Lokale Chromatin Struktur und/oder negative Regulierung durch Transkriptionsfaktoren erschweren oder vereinfachen die Lokalisierung von ORC (nach Bell, 2002)
ORC wurde auch als ATPase identifiziert, was die Hypothese stärkt, dass seine Funktion durch die Bindung von Nukleotiden reguliert wird. Generell benötigt ORC für die spezifische Bindung mit Origins ATP (Ausnahme: SpORC). In allen untersuchten Organismen fand man potentielle ATP-Bindestellen in Orc1, Orc4 und Orc5. Im Vergleich zu ScOrc5 waren Mutationen der ATP-Bindestelle in ScOrc1 lethal, was bedeutet, dass die Orc1-Untereinheit die DNA-Bindung vermittelt (Klemm, Austin et al. 1997).
Die ATP-Abhängigkeit der ORC-Interaktion mit Cdc6 und anderen Replikationsfaktoren lässt vermuten, dass auch die Hydrolyse von ATP durch ORC
1 Einleitung 15 signifikante Konsequenzen für die Bildung, Aktivierung oder Auflösung des Prä- Replikationskomplexes hat. Es bestehen gewisse Ähnlichkeiten zwischen einigen ORC-Untereinheiten (Orc1, Orc4 und Orc5) mit Cdc6 und Untereinheiten von eukaryotischen und prokaryotischen „clamp-loaders“, die ringförmige Faktoren auf die DNA laden, um die Prozessivität von DNA-Polymerasen zu stimulieren (z.B. RF- C, replication factor C) (Perkins and Diffley 1998). Wenn diese Faktoren mit der DNA assoziieren, ist die ATP-Hydrolyse stimuliert, die clamp-loaders werden abgelöst und die DNA-Stränge öffnen sich (Ellison and Stillman 2001).
Ähnliche Mechanismen werden vermutlich von ORC und Cdc6 benutzt, um den ringförmigen MCM-Komplex an die DNA zu laden (Adachi, Usukura et al. 1997).
1.3.1.4 ORC: nicht nur für die Replikation
Eine alternative Funktion für ORC findet man bei der Stilllegung von Genen („transcriptional silencing“), den „mating type“ Genen. Die mating type Elemente enthalten ähnliche Sequenzen wie die ACS-Regionen und agieren als Origins in Plasmiden (Dubey, Davis et al. 1991). Daher ist hier eine Rolle der ORC-Proteine nicht verwunderlich. Studien identifizierten Mutationen in den ORC-Genen, die zwischen ORC-Funktionen in der DNA-Replikation und dem transcriptional silencing unterscheiden können (Bell, Mitchell et al. 1995). Die Sequenzen des Orc1-Gens zeigt eine Homologie zu Sir3, einem essenziellen Faktor für das mating type silencing. Diese Ähnlichkeit ist besonders am N-Terminus hoch und Mutationen an dieser Stelle zeigten, dass es zu einem Verlust im „transkriptional silencing“ führt, aber keinen Effekt auf die DNA-Replikation ausübt (Bell, Mitchell et al. 1995).
1.3.2 Das Cdc6 Protein
Cdc6 wurde zuerst in S.cerevisiae entdeckt (Zhou, Huang et al. 1989), aber Homologe wurden auch in höheren Eukaryonten gefunden, wie in Xenopus (Coleman, Carpenter et al. 1996) und in Menschen (Saha, Chen et al. 1998).
Verschiedene Studien weisen daraufhin, dass Cdc6 eine Schlüsselrolle in der Initiation der DNA-Replikation spielt (Cocker, Piatti et al. 1996; Coleman, Carpenter et al. 1996). Zuerst nimmt Cdc6 Kontakt mit dem schon Chromatin-gebundenen ORC-Komplex auf, um dann die MCM-Proteine an Origins zu rekrutieren. Mutationen in ScCdc6 und Immundepletionen von XlCdc6 führen zu einem Verlust der Assoziierung der MCMs an DNA.
1 Einleitung 16 Cdc6 zeigt Ähnlichkeiten zu „clamp-loaders“, Prozessivitätsfaktoren von DNA- Polymerasen. Diese Ähnlichkeiten lassen vermuten, dass Cdc6 als Ladefaktor für die MCM-Proteine dient. Die in vivo Untersuchungen unterstützten dies (Perkins and Diffley 1998; Weinreich, Liang et al. 1999).
Das eukaryotische Replikationsprotein Cdc6 gehört zur Familie der ATPasen (Neuwald, Aravind et al. 1999). Wie viele Mitglieder dieser Familie enthält Cdc6 eine Nukleotidbindestelle mit den konservierten Walker A-und B-Motiven. Zusätzlich besitzt es noch mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen in der N-terminalen Region (Abbildung 1.5), die die subzelluläre Lokalisierung regulieren.
Abbildung 1.5 Schematische Repräsentation des HsCdc6 Proteins: sechs potentielle Phosphorylierungsstellen für CDK (SP oder TP), das Cyclin Bindemotiv (Cy-motif), ein Kernlokalisierungssignal (NLS, nuclear localisation signal), das Walker A-und B-Motiv, eine leucinreiche Region und Aminosäuresequenzen, die HsOrc1, HsCdc6 und CyclinA binden (nach Herbig 2000)
In Hefe wird Cdc6 während der G1-Phase exprimiert (Piatti, Lengauer et al. 1995;
Drury, Perkins et al. 1997). Wenn die Replikation beginnt, wird ScCdc6 phosphoryliert und dann über den Weg der Ubiquitinierung abgebaut, das heißt, die Mengen von Cdc6 fluktuieren während des Hefe-Zellzyklus.
Die regulierte Zerstörung verhindert die erneute Bindung der MCM Proteine und somit die Re-Replikation von schon replizierten DNA Bereichen (Piatti, Lengauer et al. 1995).
Im Vergleich zu der schnellen, S-Phase vermittelten Zerstörung von Cdc6 in Hefe bleiben die Mengen an humanem Cdc6 ziemlich stabil über den Zellzyklus. Weniger Cdc6 findet man in der frühen G1-Phase, dort wird Cdc6 über den Abbauweg
1 Einleitung 17 degradiert (Mendez and Stillman 2000; Petersen, Wagener et al. 2000).
Untersuchungen des Promotors zeigten, dass die Zellzyklus-regulierte Transkription E2F-abhängig ist. In vivo footprints bewiesen, dass E2F-Stellen in ruhenden und asynchron wachsenden Zellen besetzt sind, das heißt E2F ist verantwortlich für die Ruhigstellung des Promotors in frühen Phasen und das Ausschalten beim Eintritt in die S-Phase (Hateboer, Wobst et al. 1998; Ohtani, Tsujimoto et al. 1998).
1.3.2.1 Lokalisierung und Regulierung des Cdc6-Proteins
Die Regulierung des Zellzyklus in Eukaryoten wird durch CDKs reguliert. Bisher wurden neun verschiedene CDKs beschrieben, die mit einer Reihe von Cyclinen interagieren (Morgan 1997). Cyclin/CDK Komplexe phosphorylieren Proteine, deren Aktivitäten wichtig sind um Zellgrenzen zu überschreiten.
Cdc6 wird in vitro an den N-terminalen Konsensus CDK-Phosphorylierungsstellen von Cyclin E/CDK2 und Cyclin A/CDK2 phosphoryliert und in vivo beim Übergang von der G1- zur S-Phase (Jiang, Wells et al. 1999; Petersen, Wagener et al. 2000).
Ein Teil von Cdc6 wird während der frühen S-Phase ins Cytoplasma transportiert.
Deletionen in der Cyclin-Bindestelle in HsCdc6 verhindert die CDK vermittelte Phosphorylierung und somit den Export von Cdc6 ins Cytoplasma (Petersen, Wagener et al. 2000). Ektopische Expression von Cyclin A/CDK2 während der G1- Phase verursacht eine Re-Lokalisierung von Cdc6 vom Kern ins Cytoplasma (Petersen, Wagener et al. 2000). Damit ist bewiesen, dass die CDK-vermittelte Phosphorylierung von HsCdc6 den Kernexport reguliert und eine Re-Initiation der DNA-Replikation in der S-Phase verhindert. Aminosäure-Deletionen an potentiellen CDK-Phosphorylierungsstellen zeigten keinen Einfluß auf die Bindung mit HsOrc1 und die ATP-Hydrolyse. Werden diese Mutanten jedoch in der G1-Phase über Mikroinjektion in die Zellen gebracht, kommt es zu einer Blockade der Replikation.
Phosphorylierung ist also ein wichtiger Mechanismus für die Initiation der DNA- Replikation in humanen Zellen (Herbig, Griffith et al. 2000). Dagegen wurde im Xenopus zellfreiem System gezeigt, dass die CDK-abhängige Phosphorylierung zwar für den Kernexport, nicht aber für die Initiation der DNA-Replikation wichtig ist (Coverley, Pelizon et al. 2000).
Cdc6, wie auch alle bisher identifizierten verwandten Proteine, enthalten eine Nukleotid-Bindestelle, die aus 2 Elementen, dem Walker A-und B-Motiv, besteht (Walker, Saraste et al. 1982; Koonin 1993). Das Walker A-Motiv, oder auch „P-loop“, enthält die Konsensus Sequenz GxxGxGKT. Strukturelle Analysen zeigten, dass
1 Einleitung 18 dieses Motiv in einer Vielzahl von Nukleotid-Bindeproteinen mit dem Triphosphat interagiert (Story and Steitz 1992). Die konservierten Lysin-Reste dieser Sequenz binden das γ-Phosphat vom Nukleotid. Das Walker B Motiv enthält die Konsensus Sequenz DExD, vergleichbar mit der DEAD Box, die in Helikasen gefunden wurde (Linder, Lasko et al. 1989). Mutationen in diesen Motiven von ScCdc6 führen zu nicht lebensfähigen Zellen (Elsasser, Lou et al. 1996), ATP scheint daher eine kritische Rolle in der Regulierung von Cdc6 zu haben. Mutationen im Walker A-Motiv verhindern die Bindung von Nukleotiden, die Hydrolyse und somit eine produktive Origin-Interaktion. Mutationen im B-Motiv zeigten zwar keinen Verlust in der Bindungsaktivität (Herbig, Marlar et al. 1999), setzten aber die ATPase-Aktivität stark herab und verursachten eine Blockade in der Beladung von MCM-Proteinen an das Chromatin. Beide Mutationsvarianten waren in der Lage, Protein-Protein-Komplexe mit Cdc6 und Orc1 zu formen. Mikroinjektionen in G1-Phase-Zellen führten zum Stopp der DNA-Replikation, bei Injektionen in G1-/S-Phase-Zellen blieben diese unbeeinflusst. Die Resultate zeigen, dass die ATP-Bindung und Hydrolyse essenziell für die Initiation der humanen chromosomalen DNA-Replikation und das Fortschreiten durch die S-Phase ist.
Im Weiteren spielt Cdc6 eine wichtige Rolle in der Interaktion von DNA und ORC.
Cdc6 moduliert die Aktivität der DNA-Bindung von ORC, indem es diese auf funktionelle Origins einschränkt. Die erhöhte Spezifität der Bindung an Chromatin korreliert mit den Beobachtungen, dass Cdc6 gleichzeitig die Bindung von ORC an unspezifische DNA herabsetzt. Für das Abblocken der Bindung an unspezifische DNA-Stellen wird die Aktivität der ATPase von Cdc6 benötigt, da gezeigt wurde, dass ATP wie auch ein funktionierendes Nukleotid-Bindemotiv essenziell sind (Mendez and Stillman 2000; Harvey and Newport 2003).
1.3.3 Die MCM-Proteine
Der eukaryotische MCM-Komplex besteht aus einer Familie von sechs Proteinen (Mcm2-7) mit hoch konservierten Aminosäuresequenzen.
Entdeckt wurden die Mcm-Proteine bei Untersuchungen von Mutanten in S.cerevisiae, die nicht in der Lage waren, extrachromosomale DNA, so genannte
„Minichromosomen“, konstant an die Tochterzellen weiterzugeben (Maine, Sinha et al. 1984). So erhielten sie die Bezeichnung MCM für „Minichromosome
1 Einleitung 19 Maintenance“. Mcm2, Mcm4, Mcm6 und Mcm7 besitzen ein Zink-Finger-Motiv, das vermutlich für Protein-Protein-Interaktion verantwortlich ist.
Die Mcm´s werden über Cdc6 als Ladefaktor an den ORC-Komplex gebunden, wie oben beschrieben (Coleman, Carpenter et al. 1996).
In vivo und in vitro Studien haben gezeigt, dass die Mcm´s zum einen eine heterohexamere Form bilden können, wie auch mehrere Komplexe mit verschiedenen Kombinationen der einzelnen Untereinheiten (Tye and Sawyer 2000).
Biochemische Analysen zeigten, dass ein dimerer Komplex aus dem Heterotrimer MCM 4,6,7 eine 3´-5´-DNA Helikase-, sowie eine DNA-abhängige ATPase-Aktivität besitzt und an einzelsträngige DNA binden kann. Diese Helikase-Aktivität ist inhibiert, wenn es zu Interaktionen mit Mcm2 oder MCM2, 3 kommt (Ishimi 1997; Tye and Sawyer 2000).
Während der G1-Phase sind die Mcm Proteine fast vollständig an das Chromatin gebunden (Todorov, Pepperkok et al. 1994; Romanowski, Madine et al. 1996).
Während der S-Phase lösen sie sich von der DNA ab (Fujita, Kiyono et al. 1996;
Kimura, Ohtomo et al. 1996), bleiben auch während der Mitose vom kondensierten Chromatin ausgeschlossen und binden erst wieder in der Telophase, bevor sich die Kernmembran bildet (Tsuruga, Yabuta et al. 1997).
2 Zielsetzung 20
2 Zielsetzung
Die DNA-Replikation ist in allen lebenden Organismen über eine kontrollierte Aktivierung von Origins reguliert. Zu dieser Regulierung gehört in humanen Zellen die Bindung eines Multiprotein-Komplexes, dem so genannten Prä-Replikationskomplex, bestehend aus den Orc-Proteinen, Cdc6, Cdt1, Geminin und den Mcm-Proteinen.
Der erste Schritt der Aktivierung wird über die Bindung von Orc-Proteinen an die DNA vermittelt. In unizellulären Eukaryoten wird die Verteilung dieser Proteine über spezifische genetische Elemente dirigiert, die Ähnlichkeiten mit den bakteriellen Replikatoren haben. In höheren Eukaryoten hingegen hat man bisher noch keine vergleichbaren Spezifitäten bei der Interaktion von ORC mit Chromatin gefunden.
Das liegt an der Komplexität und an der geringen Anzahl gut charakterisierter Origins in höheren Organismen. Im Folgenden sollte deswegen versucht werden, mehr Klarheit über die Aktivierung und Inaktivierung der Origins und damit über die Initiation der DNA-Replikation zu gewinnen.
In dieser Arbeit sollen drei wesentliche Teilbereiche der Initiation der DNA- Replikation bearbeitet werden: Im ersten Teil sollen die Eigenschaften der DNA- Bindung des ORC-Komplexes untersucht werden. Dazu sollen unterschiedliche ORC-Komplexe rekombinant mit Hilfe des Baculovirus-Systems hergestellt und dann aufgereinigt und charakterisiert werden. Die Komplexe wurden mit DNA inkubiert und die Art der Bindung dann in Gelshift-Experimenten und Target-Bound-Assays analysiert.
Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung des Cdc6- Proteins in HeLa-Zellen während des Zellzyklus. Im Mittelpunkt dieser Untersuchung wird die Frage nach der Lokalisierung, Synthese, Modifikation und Abbaurate von Cdc6 sein.
Bislang sind die Funktionen von Cdc6, vor allem in der S-Phase, noch nicht ganz geklärt. Deswegen sollen im dritten Teil dieser Arbeit, aufbauend auf den zweiten Teil, mit Hilfe eines zellfreien in vitro-Systems an isolierten Zellkernen mögliche Funktionen und Auswirkungen von Cdc6 auf die DNA-Replikation analysiert werden.
3 Material und Methoden 21
3 Material und Methoden
3.1 Material
Chemikalien sofern nicht anders angegeben, stammten alle verwendeten Chemikalien (Reinheitsgrad p.A.) von den Firmen, Fluka, Roth, Sigma, Pierce und Pharmacia. Radiochemikalien wurden von ICN Biomedicals, Inc. und Amersham Pharmacia bezogen.
Enzyme Restriktionsenzyme und modifizierte Enzyme wurden von den Firmen New England Biolabs und MBI Fermentas bezogen. T4 DNA-Ligase wurde von Roche Diagnostics gestellt. RED TaqTM Polymerase lieferte Sigma.
Antikörper Die polyklonalen Antikörper gegen hMcm, hOrc, hCdc6, hGeminin und hCdt1 stammten aus eigener Herstellung. Sie wurden für die Experimente über entsprechende Antigensäulen aufgereinigt. Die Peroxidase-gekoppelten sekundären anti-Kaninchen-, anti-Maus- und anti-Ratte-Antikörper wurden von der Firma Jackson Immuno Research bezogen.
Zur Herstellung rekombinanter Baculoviren für die Expression rekombinanter Proteine in Insektenzellen (Sf-9 und Hi-5) wurde ein Baculovirus-Transfektionskit von der Firma Invitrogen verwendet.
Zellkultur Nährmedien für die Zellen wie DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s Medium) wurde von der Firma Gibco/Invitrogen bezogen. FCS (fötales Kälberserum) stammte von Boehringer Mannheim/Roche. Die Kulturschalen und Flaschen stammten von der Firma Greiner. Die menschlichen Cervixcarzinom-Zellen HeLa S3 wurden von der Firma Gibco BRL bezogen. Die Hi-5 und SF-9 Insektenzellen wurden von der Arbeitsgruppe Ellen Fanning, Nashville, USA, bezogen. Nährmedium für diese Zellen war das supplementierte Grace´s Insektenmedium von der Firma Gibco.
Bakterienstämme Der E. coli Stamm BL21 (DE3)-RIL stammte von Stratagene.
3 Material und Methoden 22 Die konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie wurde in Kooperation mit Torsten Krude, Cambridge, England und die Herstellung der Viruslysate für die Expression von Proteinen in Insektenzellen mit Thomas Kapitza, Konstanz, durchgeführt.
Nukleinsäuren Poly(dIdC):poly(dIdC) wurde von der Firma Pharmacia, Poly(dA- dT)-Poly(dA-dT) und Poly(dG-dC)-Poly(dG-dC) von Amersham Bioscience bezogen.
Herings-Sperm-DNA von der Firma Boehringer. HPLC-gereinigte Oligonukleotide für PCR wurden von der Firma MWG Biotech im Maßstab 0.01 µmol hergestellt und über HPSF aufgereinigt.
Verwendete Oligonukleotide und Expressionsvektoren Folgende
Expressionsvektoren wurden von Christian Keller gestellt (beschrieben in: „Die Initiation der DNA-Replikation im Humangenom“, Dissertation, 2002, Konstanz):
cDNA Vektor Insertion
hOrc1 pBlueBac B Bam HI/Hind III
hOrc2 pBlueBac B Bgl II/Nco I
hOrc4 pBlueBac A Xho I/Sac I
hOrc5 pBlueBac B Bam HI/Kpn I
Tabelle 3.1 Benutzte Restriktionsendonukleasen und Art der Expressionsvektoren für hOrc1, hOrc2, hOrc4 und hOrc5
3 Material und Methoden 23 Für die Herstellung von hOrc3 in einen Expressionsvektor mit einem Glutathion-Taq wurde folgende Umklonierung vorgenommen:
cDNA Herkunft Vektor Insertion
hOrc3 pAMP1 pAGHLT-A Pst I/Bam HI
ORC3-forward (Bam HI) 5´-
CGCGGATCCTATGGCTACGTCCTCGATGTCTA AG-3´
ORC3-rewind (Pst I) 5´-
CGACTGCAGCTAGCAGCCTCCCCATGTTAGT C-3´
Tabelle 3.2 Benutzte Restriktionsendonukleasen, Herkunft und Art der Expressionsvektoren für hOrc3
Abbildung 3.1 Übersicht des pAcGHLT-A Vektors der Firma BD Pharmingen
3 Material und Methoden 24 Für die Herstellung komplementärer Oligonukleotide für Gel-Retardierungs- Experimente (Bandshift) wurden Primer und DNA Template freundlicherweise von Eva-Maria Ladenburger zur Verfügung gestellt:
Primer Sequenz Position Länge Herkunft,
Plasmide EX9-F ATGTCTTCCGGAGACTCCTGAAGC 6342-
6365
387 bp pSK EX9-R GGCCTCCTATTCTCAGAATCATGC 6705-
6728 IV-2 GTCTGACCTGCGGAGGTAGTTTGG 13405-
13428
483 bp λ-Klon 10 N-3 AAACCAGAAGTAGGCCTCGCTCGG 12946-
12969
Tabelle 3.3 Charakterisierung der verwendeten Oligonukleotide für Gel-Retardierungs- Experimente
Die Target-Bound-Assays wurden mit dem pUPR-Vektor durchgeführt. Der ursprüngliche pEPI 1-Vektor wurde von der Arbeitsgruppe Lipps aus Witten- Herdecke zur Verfügung gestellt. Die Klonierung der UPR-Region aus dem MCM4- Promotorbereich wurde von Jens Baltin durchgeführt (Diplomarbeit 2003, Konstanz).
Die Silencing Interference RNA (siRNA) Sequenz wurde von der Firma MWG Biotech in einem Maßstab von 0.2 µmol hergestellt:
Cdc6-Primer 5-`AAGGAAGCUGUCUCGGGCAUU-3`
3 Material und Methoden 25 3.2 Methoden
3.2.1 Nachweise
- Elektrophorese von DNA in Agarosegelen (nach Sambrook) - Elektrophorese von nativen TBE-Polyacrylamidgelen
- Elektrophorese von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen (nach Lämmli) - Semi-Dry Immunoblot (nach Angaben des Herstellers)
- Naßblot (nach Angaben des Herstellers)
- Western-Blot Analyse mit monoklonalen Antikörpern (nachTowbin) mittels Peroxidase-gekoppelten sekundären Antikörpern (ECL Western Blotting protocols, Amersham Life science, 1994)
Nachweis von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen durch Coomassie-Brilliant- Blau-Färbung oder durch Silberfärbung (nach Wray)
- Fällung von Proteinen durch Methanol/Chloroformmethode (nach Wessel &
Flügge). Zum Einengen von Proteinproben aus Zellextrakten wird ein modifiziertes Protokoll nach Wessel & Flügge (1984) angewendet. Hierbei wird ein Volumen der Probe mit einem Volumen Methanol und 0.2 Volumen Chloroform gemischt. Das Gemisch wird für 5 min bei 14000 rpm in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird bis zur Interphase verworfen und mit dem ursprünglichem Volumen an Methanol gemischt. Schließlich werden die Proteine wieder wie oben beschrieben pelletiert. Das Pellet wird getrocknet und in entsprechendem Volumen mit 2% SDS gelöst.
- Quantifizierung von Proteinlösungen (Pierce-Kit)
- Mini-Plasmidpräparationenen durch alkalische Lyse (nach Birnboim). Hierzu werden E.coli XL-1 Zellen üN in 1 ml LB-Medium (mit 100 µg/ml Ampicillin) bei 37°C unter leichtem Schütteln in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen wachsen gelassen. Die Bakterien werden durch Zentrifugation bei 3000 rpm in einer Eppendorf Tischzentrifuge für 5 min pelletiert und in 100 µl GET Puffer (25 mM Tris-HCl, pH 8; 50 mM Glucose; 10 mM EDTA) resuspendiert. Anschließend werden 200 µl alkalisches SDS (0.2 N NaOH; 1% SDS) hinzugefügt und die Suspension sechsmal durch Invertieren gemischt. Dann werden 150 µl einer Salzlösung (3 M Kaliumacetat; 1.8 M Essigsäure) dazu gegeben, erneut gemischt
3 Material und Methoden 26 und der Ansatz bei 14000 rpm für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wird Alkohol gefällt und das entstehende Pellet in TE-Puffer aufgenommen.
- Transformation von Plasmiden in TSS-kompetente E. coli Bakterien. Für die TSS- Transformation werden die Bakterien in 10 ml LB-Medium angeimpft und üN bei 37°C wachsen gelassen. Von dieser Kultur werden 100 µl zum Animpfen von 10 ml frischem LB-Medium abgenommen und die Bakterien bis zu einer OD578 = 0.2 wachsen gelassen. Die Zellen werden für 5 min bei 3000 rpm in einer Eppendorf Tischzentrifuge pelletiert und auf Eis mit 0.5 ml LB-Medium resuspendiert. Die Suspension wird mit 0.45 ml 2x kaltem Tss (10% PEG, 50 mM Mg2+, 10% DMSO in LB-Medium) und 50 µl DMSO ergänzt. Etwa 100 µl der Zellsuspension werden zur Transformation mit ca. 1-100 ng DNA für 5-60 min auf Eis inkubiert. Wenn die Selektion der Klone auf Ampicillin-Resistenz beruht kann ohne vorherige Expression der Resistenz die Plattierung auf Ampicillin-LB-Platten erfolgen. Die Platten werden dann üN bei 37°C inkubiert.
Herstellung kompetenter Zellen. 5ml LB (für 1 Liter: 10 g Bacto-Tryptone, 5 g Bacto-Yeast-Extract, 10 g NaCl) werden mit E.coli-XL-1-Zellen angeimpft und 2h bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Mit 3 ml dieser Bakterienkultur werden wiederum 100 ml LB angeimpft und bei 37°C unter Schütteln inkubiert bis eine OD550 von 0.6 erreicht ist (2-4 h). Die Zellen werden 10 min bei 6000 rpm und 4°C abzentrifugiert und das Pellet in 50 ml Tfb-1 Medium (30 mM K-Acetat, 50 mM MnCl2, 10 mM CaCl2, 100mM KCl, 15% Glycerin, pH7) auf Eis resuspendiert.
Anschließend werden die Zellen für 5 min auf Eis inkubiert und 10 min bei 6000 rpm und 4°C zentrifugiert Das Pellet wird in 6.5 ml Tfb-2 Medium (10 mM Na- MOPS, 75 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15% Glycerin, pH7.2) aufgenommen und zu 100µl Aliquots in flüssigen Stickstoff weggefroren.
- Elektroporation von Plasmiden in kompetente E. coli Bakterien im „Gene Pulser“
(Biorad) nach Angaben des Herstellers
- Ethanol-bzw. Isopropanolfällung von DNA. Die wässrige Probe mit der DNA wird mit 0.1 Volumen 3 M Natriumacetat und 2.5 Volumen 100% EtOH (bzw. 0.6 Volumen Isopropanol) gemischt und für 5 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet mit der DNA getrocknet und in entsprechendem Volumen TE-Puffer aufgenommen.
3 Material und Methoden 27 3.2.2 Zellkultur
Kultivierung Adhärente Zellen werden als Monolayer auf beschichteten Zellkulturschalen (Greiner) bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 kultiviert.
HeLa S3- und HeLa-Zellen werden in DMEM mit 5% FCS gezogen. Zur Subkultivierung werden die Zellen mit Trypsin (8 g NaCl; 0.4 g KCl; 0.35 g NaHCO3; 1 g Trypsin; 1 g EDTA; 1 g Glucose/l) abgelöst, in Medium resuspendiert und entsprechend verdünnt auf neue Petrischalen verteilt. Hi-5 Zellen und SF-9 (Insektenzellen) werden als Monolayer auf beschichteten Zellkulturflaschen (Greiner) bei 28°C kultiviert und in supplementiertem Grace Medium mit 10% FCS gehalten.
Die Zellen werden abgeklopft, in Medium resuspendiert und verdünnt auf neue Flaschen verteilt.
Synchronisation in der S-Phase Zur Synchronisation von HeLa S3 Zellen am Übergang der G1/S-Phase werden die Zellen mit einem doppelten Thymidinblock behandelt. Für die Herstellung der Stammlösung werden 13.2 mM Thymidin in DMEM/5% FCS gelöst, steril filtriert und als 1:6 Verdünnungen den Platten hinzugefügt (2.2 mM Endkonzentration). Im ersten Block werden die Zellen für 12-14 h mit Thymidin behandelt und nach einem 9 stündigem Release folgt dann der zweite Block für 14-16 h.
Synchronisation in der Mitose Zum Akkumulieren der Zellen in der M-Phase werden sie mit einem einfachen Thymidinblock (16 h Thymidin) vorsynchronisiert, anschließend für 9 h aus dem Block entlassen und dann für 2-3 h mit Nocodazol (40 ng/ml) behandelt. Die mitotischen Zellen werden gesammelt und in die G1-Phase entlassen.
Synchronisation in der späten G1-Phase Zum Arrest in der späten G1-Phase werden die Zellen für 24 h mit 0.5 mM Mimosin (Sigma) behandelt und dann entsprechend geerntet. Für die Herstellung der Stammlösung werden 5 mM Mimosin in DMEM/5% FCS bei RT üN gelöst und den einzelnen Platten als 1:10 Verdünnung dazugegeben.
Für das metabolische radioaktive Markieren von neu gebildeten Proteinen werden HeLa S3 Zellen auf 94 mm Kulturschalen mit Methionin-freiem Medium (Gibco, Life Technologies) gewaschen und dann mit 200 µCi [35S] Methionin (ICN) für 2 h in 5 ml
3 Material und Methoden 28 Methionin-freiem Medium mit dialysiertem FCS markiert („Puls“). Für den „Chase“
wird das radioaktive Medium entfernt und die Zellen in normalem Medium mehrere Male gewaschen und dann unter Standard Konditionen weiter gezogen.
Für die Inhibierung von Proteasomen werden HeLa S3 Zellen mittels eines doppelten Thymidin-Blocks synchronisiert und dann in frisches Medium mit 5 µM MG-132 (Calbiochem) für 6 h entlassen.
3.2.2.1 RNAi
4x105 HeLa Zellen wurden auf 6-well-Platten ausgesät und zum Ausschalten des Cdc6 Proteins mit der Cdc6 RNAi-Sequenz nach Angaben des Herstellers (Invitrogen) transfiziert. Die Zellen wurden zu bestimmten Zeiten geerntet und ein Gesamtzellextrakt oder eine Zellfraktionierung wurde durchgeführt.
3.2.2.2 Phosphatase-Verdau
Immunkomplexe werden zuerst im Extraktionspuffer und danach im Phosphatasepuffer (100 mM NaCl; 0.1 mM MnCl2; 0.1 mM EGTA; 50 mM Tris pH 7.5) gewaschen. Inkubation mit lambda-Protein-Phosphatase erfolgt in einem Reaktionsvolumen von 50 µl für 30 min bei 30°C (schüttelnd) in Phosphatasepuffer.
Nach erneutem Waschen in Extraktionspuffer werden die Immunkomplexe elektrophoretisch aufgetrennt und mittels Autoradiographie und Western-Blot nachgewiesen.
3.2.2.3 Herstellung rekombinanter Baculoviren
Für die Transfektion wird der „Bac-N-Blue Transfection Kit“ von der Firma Invitrogen verwendet. Das Kit beeinhaltet linearisierte AcMNPV DNA für die Produktion von mehr als 90% rekombinanten Viren sowie „Insectin-Plus“, welches für eine effiziente, durch Liposomen vermittelte Transfektion von Insektenzellen notwendig ist.
Rekombinante Plaques lassen sich durch Blaufärbung auf X-Gal Platten detektieren.
Für die Transfektion werden 0.5 µg virale DNA (Bac-N-Blue) mit 4 µg des entsprechenden Vektors, sowie 1 ml Grace´s Insektenmedium (ohne FCS) und 20 µl der Insectin-Plus Liposomen für 10 sec auf dem Vortexer gemischt. Der Ansatz wird für 15 min bei RT inkubiert. In der Zwischenzeit wird von den 60 mm Platten mit den darauf wachsenden Sf-9 Insektenzellen das Medium entfernt und 2 ml eines frischen Grace´s Insektenzellmediums (ohne Zusätze) dazugegeben, um die Platten
