Aus der Klinik für Kardiologie und Pneumologie (Prof. Dr. med. G. Hasenfuss)
im Zentrum Innere Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Göttingen
Die Genregulation des myokardialen Na + /Ca 2+ -Austauschers
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Georg-August-Universität zu Göttingen
vorgelegt von
Claus Christians
aus Xanten
Göttingen 2013
Dekan: Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer
1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. W. Schillinger 2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. A. El-Armouche 3. Berichterstatter/in: -
Tag der mündlichen Prüfung: 23.10.2013
Die Ergebnisse dieser Arbeit sind publiziert worden:
Schillinger W, Christians C, Sossalla S, Teucher N, Nguyen Van P, Kögler H, Zeitz O, Hasenfuss G (2007): Alpha1-adrenergic stress induces downregulation of Na+/Ca2+ exchanger in myocardial preparations from rabbits at physiological preload. Eur J Heart Fail 9(4), 329-35.
Inhalt
1. Einleitung---5
1.1. Grundlagen---5
1.2. Die elektromechanische Kopplung---5
1.3. Der Natrium-Kalzium-Austauscher (NCX)---6
1.4. Die sarkoendoplasmatische Retikulum-Kalzium-ATPase (SERCA)---7
1.5. Das natriuretische Peptid vom B-Typ (BNP)---7
1.6. Die Glyceraldehyd-3-Phosphat- Dehydrogenase (GaPDH)---8
1.7. Die Myofilamentaktivierung---8
1.8. Die molekulare Pathophysiologie der Herzinsuffizienz und die Rolle des NCX---10
1.9. Regulationen durch das sympathische Nervensystem bei Herzinsuffizienz---10
1.10. Fragestellung der Arbeit---11
2. Material und Methoden---12
2.1. Material---12
2.2. Experimentierlösungen---12
2.3. Versuchsaufbau der Myozytenisolation---14
2.4. Versuchsaufbau der Muskelstreifenanlage---16
2.5. Der Light-cycler---18
2.6. Isolation und Kultivierung von Kardiomyozyten aus Kaninchen- und Rattenherzen---19
2.7. Präparation, Kultivierung und Registrierung von mechanischen Parametern der Herzmuskelstreifen von Kaninchen---20
2.8. Quantifizierung spezifischer messenger RNA mit der real-time Polymerasekettenreaktion---22
2.9. Datenverarbeitung und Statistik---24
3. Ergebnisse---27
3.1. Dosis-Wirkungs-Beziehung von Phenylephrin und isometrischer Kraft---27
3.2. Elektrisch stimulierte rechtsventrikuläre Trabekel des Kaninchens---27
3.3. Isolierte, ungedehnte Kardiomyozyten des Kaninchens und der Ratte in Kultur---30
4. Diskussion---33
4.1. Klinische Bezüge---36
4.2. Schlussfolgerungen---37
5. Zusammenfassung---37
6. Anhang---39
6.1 Abkürzungsverzeichnis---39
6.2 Abbildungsverzeichnis---40
6.3 Tabellenverzeichnis---41
7. Literaturverzeichnis:---42
1. Einleitung
1.1. Grundlagen
Die Pumpwirkung des menschlichen Herzens beruht auf der rhythmischen Aufeinanderfolge von Erschlaffung und Kontraktion, Diastole und Systole, der beiden Herzkammern. Ein wesentliches Funktionselement dieses Vorgangs sind die Herzmuskelfasern. Als Herzmuskelfasern bezeichnet man Ketten von hintereinander geschalteten Herzmuskelzellen, die gemeinsam eine funktionelle Einheit bilden. Morphologisch und funktionell werden zwei Typen von Herzmuskelfasern unterschieden.
Erstens Fasern des Arbeitsmyokards von Vorhöfen und Ventrikeln, welche die Hauptmasse des Herzens ausmachen und die mechanische Pumparbeit verrichten, und zweitens die Fasern des Erregungsbildungs- und leitungssystems, deren Aufgabe die Generierung und Weiterleitung erregender Aktionspotentiale an das Arbeitsmyokard ist. Gelangt solch ein Aktionspotential zu den Kardiomyozyten des Arbeitsmyokards, so kommt es zu einer Kontraktion dieser Zellen. Treten strukturelle und funktionelle Veränderungen in diesem Ablauf auf, so kann dies zur Herzinsuffizienz führen. Sie kann als Folge chronischer Arbeitsüberlastung des Herzens, durch vermehrte Druck- bzw.
Volumenarbeit auftreten. Auch Sauerstoff- und Substratmangel, wie bei der koronaren Arteriosklerose oder dem akuten Myokardinfarkt, eine Myokarditis oder bestimmte Toxine und Pharmaka können diesen komplexen Mechanismus stören und zur myokardialen Insuffizienz führen. Die Angriffspunkte solcher Einflüsse an den zellulären Grundprozessen von Erregung, elektromechanischer Kopplung und Kontraktion sind sehr vielfältig. Im Wesentlichen werden hier auf zellulärer Ebene zwei Typen der myokardialen Insuffizienz unterschieden. Erstens die Mangelinsuffizienz, bei der die Resynthese des myozytären Energiespeichers Phosphokreatin infolge mangelnder Energiezufuhr und so die Versorgung der kontraktilen Fasern mit Adenosintriphosphat gestört ist. Dies geschieht z.B. bei der Koronarsklerose oder dem akuten Myokardinfarkt. Der zweite Typ ist die Utilisationsinsuffizienz, bei der der Vorrat an energiereichen Phosphaten bei ungenügender elektromechanischer Kopplung nicht ausgenutzt werden kann. Im klinischen Bild der myokardialen Herzinsuffizienz dominieren, gerade im zeitlichen Verlauf, Mischformen dieser beiden Phänomene. Die vorliegende Arbeit untersucht Vorgänge in den Zellen des Arbeitsmyokards, die als Folge eine veränderte Regulation von Genen und folgend Expression der Proteine hat, deren Funktion von eminenter Bedeutung für eine physiologische Funktion des Arbeitsmyokards ist. Diese Proteine, Natrium-Kalzium-Exchanger (NCX 1= kardiale Isoform) und sarkoendoplasmatische-Retikulum-Kalzium-ATPase (SERCA 2a= kardiale Isoform) haben eine wichtige Funktion bei der elektromechanischen Kopplung, die eine Kontraktion und deren Koordinierung erst ermöglicht.
1.2. Die elektromechanische Kopplung
Die Kontraktionsfähigkeit des menschlichen Herzens hängt im wesentlichen Maß von der oszillierenden Veränderung der zytosolischen Kalziumionenkonzentration ab.
Während des Aktionspotentials des Kardiomyozyten fungieren kleine Mengen von Ca2+-Ionen, die nach Depolarisation der Zelle über spannungsgesteuerte L-Typ-Ca2+-Kanäle in die Zelle gelangen, als Trigger für weitere Ca2+-Ionen Ausschüttung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, indem sie an den Ryanodin-Rezeptor binden. Die diastolische Relaxierung des Kardiomyozyten wird durch die Wiederaufnahme des zytosolischen Kalziums in das SR über die SR-Ca2+-ATPase ermöglicht.
(Fabiato A. und Fabiato F. 1978, Bers 2001). Das Ruhepotential der Zelle wird dabei durch den
Auswärtstransport von Natriumionen bei Aufnahme von Kaliumionen durch die Na+/K+-ATPase wiederhergestellt. Während dieses Vorganges wird der Anteil des Kalziums, welcher von extrazellulär über die L-Typ-Kalziumkanäle ins Zytosol gelangt ist, über einen Austausch gegen Natrium aus dem Zytosol eliminiert und so ein konstanter intrazellulärer Nettokalziumgehalt erst ermöglicht. Diesen Vorgang erlaubt ein sarkolemmales Protein, der Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) (Bers 2001, Bridge et al. 1990). Der relative Anteil der genannten Proteine an der Kalziumhomöostase des Kardiomyozyten ist dabei speziesabhängig. Das Verhältnis des Anteils an der Ca²+ - Elimination von SERCA2a : NCX1 beträgt bei Mensch und Kaninchen ca. 23:1, bei Maus und Ratte dagegen >10:1 (Bers 2001)
Abb. 1: Schema der elektromechanischen Kopplung
1.3. Der Natrium-Kalzium-Austauscher (NCX).
Der sarkolemmale NCX ist neben der SERCA das wichtigste Transportprotein für Kalziumionen und ist unter anderem hauptverantwortlich für das intrazelluläre Ca2+-Gleichgewicht im Kardiomyozyten.
Der NCX ermöglicht den Transport von Kalzium durch die Zellmembran im Austausch gegen Natriumionen. Seine Aktivität wird als „vorwärts“ bezeichnet, wenn Natriumionen in die Zelle und Kalziumionen aus ihr heraus befördert werden, und dementsprechend als „rückwärts“, wenn die Ionen
Ca
2+Na
+Ca
2+Na
+K
+Ca2+
Ca2+
ADP
sarkoplasmatisches Retikulum
Myofilamente
Zytosol
NCX Na
+/K
+-
ATPase L-Typ
Ca
2+- Kanal
ATP ADP
Ryanodin-
Rezeptor SERCA 2a
ATP
in gegensätzliche Richtung transportiert werden. Die treibende Kraft dieses Transportes wird durch die Konzentration der beiden Ionen an der Innen- und Außenseite der Zellmembran und durch das Membranpotential der Zelle bestimmt. Der Transport ist dabei elektrogen, da bei dem Transport von drei Natriumionen gegen ein Kalziumion, drei positive Ladungen gegen zwei positive Ladungen ausgetauscht werden.
Die im Myokard vorherrschende Isoform wird NCX 1 genannt. Der NCX 1 besteht aus neun Transmembranhelices und einer großen zytoplasmatischen Schleife. In dieser Schleife befinden sich Bindungsstellen für Natrium- und Kalziumionen, die den Transportmodus regulieren. So sind die beiden Ionen sowohl Substrat als auch Regulator des Transportprozesses (Shigekawa et al. 2001).
1.4. Die sarkoendoplasmatische Retikulum-Kalzium-ATPase (SERCA).
Die sarkoendoplasmatische Retikulum-Kalzium-ATPase (SERCA), für die drei verschiedene Gene codieren und von denen bisher 5 verschiedene Isoformen beschrieben wurden, ist für die Sequestrierung des Kalziums in die intrazellulären Speicher verantwortlich. Dies geschieht unter ATP- Verbrauch und ist spannungsabhängig, so dass vom Membranpotential getriggert ein Transport erfolgt, was koordinierte Kalziumverschiebungen im Myozyten ermöglicht. Die im Myokard vorherrschende Isoform ist SERCA 2a, ein 997 Aminosäuren umfassendes Protein, das unter ATP- Verbrauch zyklisch Ca2+ in das sarkoendoplasmatische Retikulum pumpt, wo es für den nächsten Kontraktionsablauf zur Verfügung steht. Da wie unten beschrieben, die Myofilamentaktivierung maßgeblich von der aus dem SR (sarkoplasmatischen Retikulum) ausgeschütteten Menge an Kalziumionen abhängt, kommen der Funktion und der Expression der SERCA eine entscheidende Rolle in der molekularen Genese der Herzinsuffizienz zu (Hasenfuss et al. 1994). Des Weiteren ist für die Herzinsuffizienz des Menschen typischerweise eine erhöhte NCX/SERCA-Ratio beschrieben.
Bisher noch nicht grundlegend geklärte Mechanismen führen hier zu einer verminderten SERCA- Expression bei erhöhter NCX-Expression, welches funktionell zu einem Verlust von Kalziumionen aus dem SR und dem Zytosol führt, welches wiederum eine verminderte elektromechanische Kopplung zur Folge hat, die in der Herzinsuffizienz mündet.
Neben der Kalziumhomöostase hängt die korrekte posttranslationale Proteinmodifikation eminent von der endoplasmatischen Kalziumkonzentration ab, so dass auch hier der SERCA eine wichtige Rolle zukommt (Højmann Larsen et al. 2001).
Deshalb ist es für die vorliegende Arbeit auch von großem Interesse, neben der NCX- Transkriptionsrate auch die SERCA-Transkription unter den folgenden Bedingungen zu untersuchen, da die beiden Proteine in engem funktionellem Zusammenhang stehen
1.5. Das natriuretische Peptid vom B-Typ (BNP)
Die drei Peptide ANP (atriales natriuretisches Peptid), BNP (Brain natriuretic oder auch b-type natriuretic peptide) und CNP (C-type natriuretic peptide) bilden die Familie der natriuretischen Hormone. BNP wurde primär in Homogenaten von Gehirnen entdeckt, wird aber auch im Plasma nachgewiesen. Die höchsten Konzentrationen kommen jedoch im Myokard vor. BNP besteht aus 17 Aminosäuren und bildet einen Ring durch eine Disulfidbrücke zwischen zwei Cysteinmolekülen.
Außerhalb des Rings sind N-terminal neun und C-terminal 6 Aminosäuren. Es gibt insgesamt 3 natriuretische Peptidrezeptoren (NPR). Der NPR-Rezeptor ist eine wandständige Guanylatcyclase, die aus einer extrazellulären Andockungsstelle, einer transmembranösen Region sowie einem intrazellulären Anteil besteht, der die Umwandlung von GTP in cGMP, einem second messenger, katalysiert. Ebenso wie das atriale natriuretische Peptid (ANP) hat das BNP natriuretische und diuretische Wirkungen. Es erhöht durch Steigerung der glomerulären Filtration und eine Verminderung der tubulären Rückresorption von Natrium die Diurese. BNP und ANP vermindern zudem die Aldosteron/ Renin- Sekretion und setzen damit den Blutdruck herab. Es besteht also ein wesentlicher Zusammenhang zum Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) (Brockhoff et al. 2000).
Die Plasmaspiegel von ANP und BNP steigen bei Volumenexpansion sowie Drucksteigerungen in Vorhof und Ventrikel an. Eine Erhöhung der Myokard- und Plasmakonzentration von BNP kann schon im frühen Verlauf der Herzinsuffizienz nachgewiesen werden und korreliert sehr gut mit dem Ausmaß der Ischämie, der Ausdehnung des akuten Myokardinfarkts und der klinischen Ausprägung der Herzinsuffizienz (Davis et al. 1994). BNP ist ein Neurohormon welches ganz überwiegend im ventrikulären Myokard gebildet und sezerniert wird. Bei akuten transmuralen Myokardinfarkten zeigen hohe zirkulierende Spiegel (über 80 pg/ml) als unabhängiger prognostischer Faktor eine ungünstige Prognose für das erste Postinfarktjahr an (De Lemos et al. 2001). Aus dem Gesagten ist ersichtlich, dass BNP als ein sehr sensitiver Marker für kardiale Dysfunktion gilt, so dass im Rahmen der vorliegenden Arbeit es als sinnvoll erachtet wurde, auch die Transkriptionsmenge dieses Proteins zu bestimmen, um den durch die α-adrenerge Stimulation entstehenden kardiomyozytären Stress auf molekularer Ebene zu dokumentieren.
1.6. Die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GaPDH)
Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GaPDH) ist ein zytosolisches, weit verbreitetes Enzym, und spielt eine Schlüsselrolle bei der Glykolyse. Es katalysiert die Umwandlung von Glyceraldehyd-3- Phosphat zu 1,3-Biphosphoglycerat.
GaPDH existiert als Tetramer aus vier gleichen Untereinheiten, die aus jeweils 335 AS bestehen. Der N-Terminus ist für die Bindung von NAD+ wichtig, der C-Terminus spielt bei der Bindung des Substrats eine wichtige Rolle. GaPDH wird schon sehr lange als sogenanntes Housekeeping-Gene betrachtet, dessen Expression als wenig reguliert gilt, daher wird es sehr oft als interner Standard bei der Quantifizierung von mRNA verwendet. So wurde auch in der vorliegenden Arbeit die mRNA zu diesem Zweck bestimmt.
1.7. Die Myofilamentaktivierung
Die Kontraktion des Herzmuskels, d.h. eigentlich die Verkürzung der unzähligen Muskelfasern läuft über ein Ineinandergleiten der Aktin- und Myosinfilamente, kleineren Untereinheiten in den Muskelfasern ab. „Motor“ dieser Bewegung ist eine ruderartige Bewegung von Myosinquerbrücken unter Adenosintriphosphat (ATP)-Verbrauch. Diese kann natürlich nur unter immer wiederkehrender periodischer Verbindung dieser Querbrücken mit den Aktinfasern geschehen, dem sogenannten Querbrückenzyklus.
Die oben beschriebenen oszillierenden Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration ermöglichen erst eine Kontraktion und deren Koordination, da die Ca2+ -Ionen während des Kontraktionszyklus an das Troponin des kontraktilen Apparats binden und so die Bindungsstelle für die Myosinköpfchen am Aktin freigeben, wodurch eine Kontraktion der Myofibrillen erst möglich wird.
Troponin besteht aus drei Untereinheiten: TnC (kalziumbindend), TnI (inhibitorisch) und TnT (tropomyosinbindend). Diese Untereinheiten interagieren Kalzium-abhängig miteinander.
Abb.2a: Wirkungsweise der Kalziumionen bei der Myofilamentaktivierung. Aktin- und Myosinfilament im Längsschnitt.
Abb.2b: Im Querschnitt: Ca2+ Ionen werden von Troponin gebunden, worauf Tropomyosin in die Rinne zwischen den beiden Actinsträngen des Filaments gleitet und die Bindung des Myosinköpfchens an das Actinfilament ermöglicht.
Aktinuntereinheit Troponin
Tropomyosin
Myosinfilament Myosinköpfchen
Ca 2+
Myosin- köpfchen
Actinuntereinheit
Tropomyosin
Bewegungs-
richtung nach
Bindung
1.8. Die molekulare Pathophysiologie der Herzinsuffizienz und die Rolle des NCX
Es gibt zahlreiche Anhalte dafür, dass die Regulationsmechanismen der Kalziumhomöostase in der menschlichen Herzinsuffizienz nicht mehr adäquat agieren und somit Hypertrophie, Arrhythmie und Pumpleistungsverlust bedingen. Es ist bereits deutlich geworden, dass als Ursache einer gestörten elektromechanischen Kopplung eine veränderte Kalziumakkumulation des sarkoplasmatischen Retikulums einen signifikanten Anteil an der Pathophysiologie der Herzinsuffizienz hat (Schillinger et al. 2003). Drei wesentliche Faktoren scheinen ursächlich für den verringerte Kalziumgehalt des SR: 1.
Ein erhöhter Verlust von Ca2+ durch ein molekulares Leck im Ryanodinerezeptor. 2. Eine reduzierte Aktivität der SERCA. 3. Eine erhöhte transsarkolemmale Elimination von Ca2+ durch den NCX. Die Kalziumakkumulation im SR hängt von der Aktivität der SERCA, relativ zur transsarkolemmalen Kalziumelimination durch den NCX ab. Studien die Proteinexpression von NCX und SERCA im Endstadium der Herzinsuffizienz untersuchten, kamen zu einem dreifach höheren NCX/SERCA Quotienten als bei gesunden Herzen, was eine relative Dominanz der NCX Transportleistung gegenüber der der SERCA nahe legt (Hasenfuss et al. 1999). Die funktionellen Konsequenzen dieser Beobachtungen werden kontrovers diskutiert und hängen auch von weiteren Faktoren wie Aktionspotentialdauer, Sensitivität der Myofilamente, pH-Wert, Metabolismus und dem transmembranen Gradienten für Na+, K+ und Ca2+ ab (Bers 2001). Als mögliche Folge einer veränderten NCX-Expression wird ein erhöhter Verlust intrazellulären Ca2+ nach extrazellulär über den NCX und in Folge eine verbesserte diastolische, bei Verschlechterung der systolischen Funktion angenommen. Andere Autoren wiederum berichten über eine erhöhte Ca2+-Aufnahme von extrazellulär über den NCX, als Kompensationsmechanismus für eine verminderte diastolische Ca2+- Aufnahme in das SR über die SERCA. Nicht zuletzt wurde auch eine nicht unerhebliche Mitverantwortung dieser Phänomene an der Entstehung von Arrhythmien postuliert (Schillinger et al.
2003). Interessanterweise konnten hier zwei Phänotypen unterschieden werden. Einerseits Herzen im Endstadium der Insuffizienz mit dominierendem Anstieg der NCX-Expression, und andererseits Herzen mit dominierender Verminderung der SERCA-Expression. In der ersten Gruppe ist die diastolische Funktion erhalten, da die zelluläre Gesamtkapazität zur zytosolischen Kalziumelimination relativ hoch ist, wobei die systolische Funktion gestört ist, da Kalzium Zell auswärts eliminiert wird und der SR Kalziumgehalt sinkt. In der zweiten Gruppe ist die Kalziumaufnahme in das SR als auch die Kalziumelimination Zell auswärts vermindert, so dass sowohl systolische als auch die diastolische Funktion stark beeinträchtigt sind. Der in diesem Zusammenhang zu beobachtende vermehrte Transport im Vorwärtsmodus des NCX ist dabei arrhythmogen, da durch den vermehrten Einwärtstransport von Natriumionen eine Frühdepolarisation der Zelle begünstigt wird. Außerdem wurde im Rahmen der Überexpression von NCX eine höhere Sensibilität gegenüber Digitalispräparaten und den schädigenden Einflüssen von freien Sauerstoffradikalen beobachtet, die gerade im Rahmen der Koronarenherzkrankheit entstehen (Schillinger et al. 2003).
1.9. Regulationen durch das sympathische Nervensystem bei Herzinsuffizienz
Die Aktivierung des sympathischen Nervensystems ist eine charakteristische Beobachtung im Krankheitsverlauf einer Herzinsuffizienz und kann vermutlich teilweise die veränderte Aktivität von
Proteinen des Metabolismus und des Ca2+-Haushaltes kompensieren, so dass die Kontraktilität in gewissen Maßen aufrechterhalten werden kann. Allerdings vermindert sich im Endstadium der Herzinsuffizienz die zelluläre Antwort auf β-Rezeptoragonisten, da die Rezeptoranzahl an der Zelloberfläche vermindert ist, was eine chronische Erhöhung der endogenen Katecholaminausschüttung zur Folge hat (Bristow et al. 1982). Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Stimulation myokardialer α1-Rezeptoren, eine Hypertrophie der Kardiomyozyten zur Folge hat wie sie üblicherweise bei der menschlichen Herzinsuffizienz zu beobachten ist. Dieser Effekt wird über die Induktion von Wachstumshormonen und Veränderungen in der Proteinexpression vermittelt und führt im schlimmsten Fall zur letalen Herzinsuffizienz (Morgan und Baker 1991, Molkentin und Dorn 2001).
Abb. 3: Der pathophysiologische Circulus vitiosus
Es wird daher vermutet, dass die Aktivierung des sympathischen Nervensystems eine überschießende und schädigende Reaktion ist, die mit einer verhängnisvollen Prognose assoziiert ist (Cohn et al. 1984). Nicht zuletzt wurde bereits eine signifikante Korrelation zwischen Noradrenalin- Plasma-Spiegeln und der myokardialen Proteinmenge des NCX im Endstadium der Herzinsuffizienz (NYHA IV) beschrieben (Schillinger et al. 2002). Zusätzlich haben diverse in vitro und in vivo Studien an der Ratte eine Erhöhung von NCX mRNA- und Proteinmengen, nach kontinuierlicher Stimulation mit Katecholaminen gezeigt (Reinecke et al. 1997, Golden et al. 2000, Golden et al. 2001).
1.10. Fragestellung der Arbeit
Die Regulationsmechanismen der Expression Ca2+-regulierender Proteine der Herzmuskelzelle sind noch weitgehend unklar. Von Lastabhängigkeit über humorale Faktoren bis zu metabolischen Phänomenen werden viele Ansätze verfolgt. Da ein besseres Verständnis der Regulationsmechanismen neue pathophysiologische Einblicke gewähren würde und die Entwicklung neuer präventiver und therapeutischer Strategien ermöglichen könnte, wurde in dieser Arbeit die Regulation der NCX-Expression untersucht. Gleichzeitig wurde die mRNA der Gene SERCA und BNP bestimmt, da sie wie oben bereits angesprochen in eminenten Zusammenhang mit der Pathophysiologie der Herzinsuffizienz und NCX-Dysregulation stehen. Es wurde in der vorliegenden Arbeit der Effekt von kontinuierlicher α1-Rezeptorstimulation mit Phenylephrin auf kultivierte
Herzinsuffizienz Sympathikotonus
Verstärkung über Hypertonie, Hypertrophie, Gendysregulation, Rhyth- musstörungen
Verstärkung über Hypox- ämie, Hypoperfusion, Hypo- tonie, psychosomatische Effekte
Kardiomyozyten des Kaninchens und der Ratte untersucht. Während bei Kardiomyozyten vom Kaninchen keine Regulation der NCX-mRNA zu beobachten war, wurde in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten, eine Zunahme der NCX-mRNA bei den Rattenkardiomyozyten beobachtet. Es wurde die Hypothese erstellt, dass für die Induktion der NCX mRNA-Expression im Kaninchen, Vorlast ein entscheidender Faktor sein könnte. Deshalb wurden auch rechtsventrikuläre Trabekelpräperationen aus dem Kaninchen unter elektrischer Stimulation und mit optimaler Vorlast, auf eine α1-adrenerg vermittelte Expressionsänderung des NCX untersucht. In diesen Experimenten wurde eine signifikante Verminderung der NCX-mRNA-Expression beobachtet, die in weiteren Experimenten unter Präsenz des α1-selektiven Rezeptorblockers Prazosin beziehungsweise unter Präsenz des PKC-Inhibitors Bisindolomaleimeide (GF 109203 X) oder ohne Vorlast nicht zu ermitteln war. Dies zeigt, dass die adrenerg vermittelte Veränderung der NCX-mRNA im Kaninchen über den α1-Rezeptor unter Mitbeteiligung von Vorlast und unter Aktivierung der PKC vermittelt wird.
2. Material und Methoden
2.1. Material
M 199 Zellkulturmedium, Protease XIV, Taurin, D+L-Carnitin, Kreatin, Laminin, 2,3-Butanedione Monoxime, Phenylephrin (Pe), Prazosin (Praz) und GF 109203X wurde bei Sigma erworben.
Kollagenase Typ II wurde bei Biochrom erworben. Alle anderen benutzten Substanzen wurden bei kommerziellen Anbietern mit höchstem Reinheitsgrad bezogen. Die Substanzen wurden so weit möglich alle in Aqua bidestillata gelöst, mit Ausnahme des PKC-Inhibitor GF 109203 X der nur in Dimethylsulfonoxid in ausreichender Konzentration lösbar war. PE, PRAZ und GF109203 wurden in den entsprechenden Lösungsmitteln gelöst, in kleine Mengen steril aliquotiert und bei -8°C bzw. +7°C für GF 109203 X gelagert.
2.2. Experimentierlösungen
Aus den unverderblichen Substanzen wurden zehnfach höher konzentrierte Stammlösungen hergestellt, die in sterilen Gefäßen bei 4 C° gelagert wurden und am Tag des Experiments mit den inkonstanten Substanzen wie Natriumhydrogencarbonat, 2,3-Butane-Dione-Monoxime (BDM), Glukose und Kalziumchlorid ergänzt wurden und auf die benötigte Konzentration mit Aqua bidest.
verdünnt wurden. Für die Myozytenisolation wurde aus 10-fach konzentrierter Tyrode-Stocklösung am Versuchstag Tyrodelösungen mit verschieden Modifikationen, für die verschiedenen Isolationsstufen vorbereitet und steril filtriert.
Tabelle1: Tyrode-Grundlösung Tabelle 2: Kalziumhaltige Tyrode-Lsg. I
Tabelle 3: Kalziumfreie Tyrode-Lsg. II
Tabelle 5: Enzym-Stop-Lösung
Für die Zellkulturexperimente, beziehungsweise für die Muskelstreifenexperimente nach der Stabilisierungsphase, wurde zu 500 ml des gebrauchsfertigen M 199 Kulturmedium, Taurin, D+L- Carnitine, Kreatin, D+L-Glutamat, Penicillin und Streptomycin hinzugegeben, steril filtriert und bei 4°C gelagert. Stammlösungen bzw. modifiziertes M199 Medium, wurden innerhalb einer Woche verbraucht oder andernfalls verworfen. Als Dissektionslösung, mit der das Herz direkt nach Entnahme perfundiert wurde, diente sowohl bei den Myozytenkulturen als auch bei den Muskelstreifenexperimenten, eine mit BDM ergänzte Krebs-Henseleit Lösung die kein Kalzium enthielt, da ja primär Kardioplegie für die Präparation erreicht werden musste.
Bezeichnung Konzentration
NaCl 137 mmol/l
KCl 5,4 mmol/l
MgSO4 1,2 mmol/l Na2HPO4 1,2 mmol/l
HEPES 20mmol/l
Bezeichnung Mengen
Tyrode Grundlösung 500 ml CaCl2 1 mmol/l 55 ul
Bezeichnung Mengen
Tyrode Grundlösung 200 ml
Glucose 5,4 g
Penicillin 2000 i.U.
Streptomycin 2 mg
Bezeichnung Mengen
Tyrode Grundlösung 80 ml
Taurine 600 mg
D-L-Glutamat 94 mg
D-L-Carnitine 31 mg
Collagenase II 80 mg
Protease XIV 3,2 mg
CaCl2 1 mmol/l 2 ul
Bezeichnung Mengen
Tyrode Grundlösung 300 ml CaCl2 1 mmol/l 15 ul Albumin Fraktion V 6 g
BDM 607 mg
Tabelle 4: Enzym-Lösung
Tabelle 6: Dissektionslösung
Bezeichnung Summenformel Konzentration
Natriumchlorid NaCl2 116,0 mmol/l
Natriumhydrogencarbonat NaHCO3 20,0 mmol/l
*2,3-Butane-Dione-Monoxime (BDM) C4H7NO2 20,0 mmol/l
Glukose C6H12O6 10,0 mmol/l
Kaliumchlorid KCl 5,0 mmol/l
Natrium-di-Hydrogenphosphat NaH2PO4 2,0 mmol/l
Magnesiumchlorid MgCl2 1,2 mmol/l
Natriumsulfat Na2SO4 1,2 mmol/l
Als Standard-Lösung für die Muskelstreifenexperimente diente die Krebs-Henseleit Lösung. In ihr wurden die Muskelstreifen unter Begasung mit Carbogen (95% O², 5% CO²) zunächst zur Kontraktion gebracht und stabilisiert.
Tabelle 7: Krebs-Henseleit Lösung
Bezeichnung Summenformel Konzentration
Natriumchlorid NaCl2 116,0 mmol/l
Natriumhydrogencarbonat NaHCO3 20,0 mmol/l
Glukose C6H12O6 10,0 mmol/l
Kaliumchlorid KCl 5,0 mmol/l
Kalziumchlorid CaCl2 1,75 mmol/l
Natrium-di-Hydrogenphosphat NaH2PO4 2,0 mmol/l
Magnesiumchlorid MgCl2 1,2 mmol/l
Natriumsulfat Na2SO4 1,2 mmol/l
Gebrauchsfertigem M 199 Medium, wurde einige Substanzen hinzugegeben und danach steril filtriert, so das ein modifiziertes M 199 Medium entstand, dass für die Langzeitkultur von Herzmuskelzellen und Muskelstreifen genutzt wurde.
Tabelle 8: Modifiziertes M 199 Medium
2.3. Versuchsaufbau der Myozytenisolation
Die Myozytenisolationsanlage wurde aus sterilen Einmalartikeln bzw. wo möglich aus dampfsterilisierten Glasartikeln aufgebaut. Nach jeder Isolation wurde die Anlage mit 35%iger
Bezeichnung Konzentration
D,L-Carnitin 4,0 mmol/l
Creatin 5,0 mmol/l
Taurin 5,0 mmol/l
D,L-Glutamin 2,0 mmol/l
Penicillin 100 iU/ml
Streptomycin 0,1 mg/ml
Essigsäure gespült und danach mit mehreren Litern sterilem Aqua bidest. gespült. Nach dreimaliger Myozytenisolation oder aber einer Standzeit von einer Woche wurde die Anlage bis auf das Wasserbad komplett neu aufgebaut, um einen möglichst hohen Reinheitsgrad aufrechtzuerhalten. Der Aufbau der Anlage entspricht bis auf einige Modifikationen dem Versuchsaufbau den Langendorf (Langendorff 1895) bereits bei seinen Experimenten zur Herzmuskelphysiologie entwickelte.
Heizspirale
Gefäß für zu verwerfende Lsg.
Abb.4: Skizze der modifizierten Langendorfperfusion
Pumpe Dreiwege-
hahn Glasfritten zur Begasung
Vorratsbe- hälter
Tyrode Vorratsbehälter
Enzymlösung
Wärmebad Luftfalle
Doppelwandglas mit Wärmekreislauf
Carbogen
Vorwärmung der Experimentier- lösung
2.4. Versuchsaufbau der Muskelstreifenanlage
Vor der Beschreibung des Versuchsaufbaus sollte darauf hingewiesen werden, dass alle Versuche auf zwei teilweise zusammenhängenden Anlagen parallel durchgeführt wurden. Gemeinsam genutzte Komponenten beider Anlagen waren die Pumpe für die Experimentierlösungen, der Perfusor, der Stimulator und der Computer zur Datenerfassung, wobei der Kreislauf der Experimentierlösung zwischen Kontrolle und Verum immer getrennt war. Im Aufbau waren beide Anlagen identisch, weshalb die folgende Beschreibung von nur einer Versuchsanordnung ausgeht.
Im Zentrum der Anlage stand das so genannte Organbad, in dem sich das Muskelpräparat umspült von Experimentierlösung befand. Der detaillierte Aufbau des Bades ist der Querschnittszeichnung in Abbildung 6.) zu entnehmen. Das Bad besteht aus einer kleinen Wanne, die in eine etwa 5 mm dicke Acrylscheibe gefräst wurde. Die Acrylscheibe war in einen über das Heizungssystem erwärmten Aluminiumblock eingelassen. In die Wanne tauchten zwei Vorrichtungen zur Befestigung des Präparats ein. Auf der einen Seite ist dies ein kleines Körbchen, welches aus Platindraht gebogen wurde. Ihm gegenüber befand sich ein Haken aus Platindraht. Der Haken ist mit einer Mikrometerschraube so verbunden, so dass man ihn langsam längs des Bades bewegen kann um den Muskel vorzudehnen. Das Körbchen auf der anderen Seite ist höhenverstellbar mit einem piezoelektronischen Kraftaufnehmer „KG4“ der Firma Scientific Instruments (Heidelberg) verbunden.
Des Weiteren befinden sich im Organbad zwei parallel eingeklebte Silberdrahtelektroden, die die Feldstimulation des Muskels ermöglichen. Die Verbindung zwischen Kraftaufnehmer und Körbchen und zwischen Haken und Mikrometerschraube wurde aus einer kliniküblichen Stahlkanüle hergestellt.
Diese Art der Muskelaufhängung wurde gewählt, da beschrieben wurde, dass sie besonders schonend für das Präparat ist (de Tombe und ter Keurs 1991, Janssen und de Tombe 1997).
Mit einer Kreiswalzenpumpe wird die Experimentierlösung aus dem Vorratsbehälter in das Organbad befördert. Auf der dem Zulauf des Organbades gegenüberliegenden Seite befindet sich ein Ablauf, über den die Experimentierlösung abgesaugt wird. Von dort gelangt die Experimentierlösung über eine Pumpe wieder zurück in den Vorratsbehälter oder direkt in ein Abfallgefäß. Die Geschwindigkeit der Pumpe wurde so gewählt, dass in einer Sekunde der halbe Flüssigkeitsinhalt des Organbades ausgetauscht wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich ein Perfusor verwendet, der die kontinuierliche Zugabe kleinster Mengen von PE- und Praz-Lösungen in die Vorratsbehälter ermöglichte. Alle Teile des Leitungssystems für die Experimentierlösung waren aus Kunststoff. Es wurden weitgehend klinikübliche Standardartikel mit Luer-Lock-System wie Infusionsleitungen, Perfusorschläuche und Dreiwegehähne der Firmen B. Braun und Fresenius verwendet. Sowohl Zu- als auch Ablauf beider parallel betriebener Anlagen wurden von derselben Pumpe angetrieben. Es handelte sich dabei um eine Peristaltikrollenpumpe mit acht Kanälen der Firma Masterflex. Die Pumpenschläuche der Firma Ismatec waren aus Tygon und hatten einen Innendurchmesser von 2,79 mm.
Als Vorratsbehälter für die Experimentierlösung diente ein doppelwandiger, oben geöffneter, zylindrischer Glasbehälter. Das Fassungsvolumen des Behälters betrug ungefähr 300 ml. Für ein Experiment wurde er mit 100 ml Experimentierlösung befüllt. Während der gesamten Dauer des
Versuchs wurde die Experimentierlösung über einen Mikrofilter aus Glas (Firma Schott, Porosität 1) mit Carbogen (95 % O2, 5 % CO2) begast. Dies diente zum einen der Einstellung des pH-Wert, als auch zum anderen der Anreicherung der Experimentierlösung mit Sauerstoff. Der Zwischenraum zwischen den Wänden wurde von Heizmittel durchströmt. So konnte die Temperatur auf ca. 37°C stabil gehalten werden.
Aus verschiedenen Gründen war es sinnvoll, die Temperatur der Experimentierlösung auf einen Wert im Bereich der Körpertemperatur zu erhöhen. Erstens kommt man so näher an physiologische Bedingungen heran, zweitens löst sich Carbogen besser bei höheren Temperaturen und drittens reduziert sich dabei die Dauer einer Muskelkontraktion deutlich. Dies wiederum ist Voraussetzung dafür, dass die diastolische Kraft auch bei Stimulation mit für das Kaninchen physiologischen hohen Frequenzen konstant bleiben kann. Kernstück der Heizung war das Wasserbad „M3“ der Firma Lauda.
Das gewärmte Wasser durchströmte neben dem doppelwandigen Vorratsbehälter, einen den Lösungsschlauch umgebenden dickeren Schlauch auf der gesamten Strecke bis zum Organbad. Die Heizleistung wurde so eingestellt, dass die Temperatur im Organbad zwischen 36,0 °C und 36,5 °C lag. Die erforderliche Heiztemperatur des Wasserbades dafür betrug 39,0 °C.
Abb.5: Versuchsaufbau der Muskelstreifenanlage
Das Muskelpräparat wurde durch einen elektrischen Spannungsimpuls zwischen den Silberelektroden im Organbad zur Kontraktion angeregt. Als Reizquelle diente ein Mehrkanal-Stimulator der Firma Scientific Instruments (Heidelberg). Die Stimulationsspannung und die Frequenz waren für beide Kanäle gleich. Vor Gebrauch wurde der Stimulator mit Hilfe eines Speicher-Oszilloskops geeicht. Die Stimulationsspannung lag dabei 10% über der individuellen Reizschwelle zwischen 3-5 V.
Organbad
Wärme - tausch er
Dreiwegehahn
Beheiztes Vorratsgefäß mit Experimentierlösung
Heizung
Perfusor
Zur Messung der Kraft wurde ein Kraftaufnehmer (KG4) und ein Brückenverstärker (DUBAM) aus dem Angebot der Firma Scientific Instruments (Heidelberg) verwendet. Vor Gebrauch wurde der Kraftaufnehmer mit fünf unterschiedlichen Gewichten geeicht.
Vor und nach jedem Experiment wurde die Anlage mit 35%iger Essigsäure und folgend mit 400 ml sterilem Aqua dest. durchgespült, um Kontamination durch diverse Keime vorzubeugen. Das Vorratsgefäß wurde mit einer Flaschenbürste gereinigt. Die Mikrofilter zur Begasung wurden abgebürstet und mit sterilem Aqua dest. durchspült.
Mindestens alle vier Wochen wurde das Schlauchsystem komplett ausgewechselt und danach die beiden Kraftaufnehmer mit definierten Gewichten in Vertikalposition geeicht. Glasteile und das Organbad wurden über Nacht in phosphatfreiem RBS Laborreiniger eingelegt. Auch alle Teile der Muskelaufhängung mit Kontakt zur Experimentierlösung wurden im Zuge dieser Überholung der Anlage ausgewechselt. Bei verdächtigen Verunreinigungen wurden Teile auch schon vor Ablauf ihrer vierwöchigen Einsatzzeit ausgetauscht.
2.5. Der Light-cycler
Das LightCycler Diagnostics ® PCR-Analysesystem der Firma Roche wird schon seit einigen Jahren sehr erfolgreich für die Analytik klinischer Fragestellungen vor allem in der Hämato-Onkologie aber auch bei medizinischen Forschungsfragestellungen eingesetzt und wird als allgemein gut etabliert angesehen. Es handelt sich dabei um einen Thermocycler, in dem die Proben auf einem
motorgetriebenen Revolver geführt werden, um neben der normalen PCR- auch in eine Fotokammer verbracht werden zu können, damit Fluoreszenzanalysen nach Anregung mit Licht spezifischer Wellenlängen durchgeführt werden können. So wird eine Verfolgung der Zunahme an Doppelstrang DNA in Echtzeit, sowie je nach Zugabe spezifischer Primer, eine sehr genaue qualitative und quantitative Analyse in relativ kurzer Zeit ermöglicht.
Zulauf
Experimentierlsg.
Mikrometerschraube Kraftaufnehmer
Ablauf
15 mmm mm mm
Glasplatte
+
Elektroden der
-
Feldstimulation Abb. 6: Aufhängung der Muskelpräparate im Detail
mm
Abb. 7 Schematischer Aufbau des Roche Lightcyclers®
2.6. Isolation und Kultivierung von Kardiomyozyten aus Kaninchen- und Rattenherzen
Weibliche Chinchylla Bastard Kaninchen (Gewicht zwischen 1,5-2,0 kg) wurden mit 1000 i.E. Heparin i.V. antikoaguliert um Thrombembolien während der Präparation vorzubeugen. Darauf folgend wurden die Tiere mit Natrium-Thiopental (50 mg/kg) in eine der Ohrvenen narkotisiert. Die weiblichen Wistar Ratten (200-250g) wurden mit Halothan per inhalationem narkotisiert und durch Heparininjektion in den linken Vorhof bei bereits eröffnetem Thorax antikoaguliert. Nach einem quer verlaufenden Bauchschnitt wurde der Thorax transdiaphragmal eröffnet, dass Herz nach beidseitiger Rippendurchtrennung schnellst möglich frei präpariert und mit mindestens 5 mm der ascendierenden Aorta entnommen, kurz in 4°C temperierter Tyrode gewaschen und an eine modifizierte Langendorfperfusionsanlage angeschlossen in dem die Aorta über eine 20 G Kanüle gestülpt und mit einem Vicrylfaden befestigt wurde und das Herz so retrograd perfundiert werden konnte. Unmittelbar nach Befestigung wurde das Herz für 5-8 min. mit auf 36,0°C temperierter Tyrode I Lösung (siehe Tab. 1) perfundiert, die mit 100% O2 begast wurde. Nach dem die Kontraktionen wieder eingesetzt und sich stabilisiert hatten, wurde die Perfusionslösung für 12-15 min. auf die Ca2+ -freie Tyrode II Lösung gewechselt. Der Ca2+-Entzug hat den Schluss der Gap-junctions der Herzmuskelzelle zur Folge, so dass die Separation der Zellen initialisiert wurde. Im weiteren Verlauf wurde der Verdau der extrazellulären Matrix eingeleitet, in dem die Perfusionslösung für 12-15 min. auf die Tyrode- Enzymlösung gewechselt wurde. Bei der Isolation von Kaninchenkardiomyozyten wurde der Verdau mit der Tyrode-Stop-Lösung beendet, die beiden Vorhöfe sowie die großen Gefäße entfernt und das verbleibende ventrikuläre Gewebe in Tyrode III-Lösung überführt. In dieser Lösung wurde das Gewebe vorsichtig mit einer Schere zerkleinert und die Zellen durch langsames Schwenken separiert.
Bei der Isolation von Rattenkardiomyozyten entfiel der Enzymstop. Zerkleinern und Separieren der Zellen wurde nach entfernen von Vorhöfen und der großen Gefäßen in Tyrode-Enzym-Lösung
Thermoblock
Probenrevolver mit Glas- kapillaren
Fotoeinheit für Anregungslicht- quelle und Fluoreszenz- messung
durchgeführt. Die bei beiden Spezies erhaltene Einzelzellsuspension wurde dann durch Nylongaze (Maschenweite 200 m) gefiltert um nicht verdaute Anteile oder tote, konglomerierte Zellen zurückzuhalten. Die Zellsuspension wurde dann schrittweise höheren Ca2+-Konzentrationen in Tyrodelösung ausgesetzt. Die erhaltene Suspension wurde anschließend in eine Sedimentationslösung überführt die ein Absinken der toten Zellen verhindert, so dass nach Entfernen des Überstandes fast ausschließlich lebende Zellen im Medium zu finden sind. Ein Teil der sedimentierten Zellen (Suspension von 50l) wurde mit Methylenblau angefärbt (färbt nur Zellen mit nicht intakter Zellmembran) und in einer Zählkammer nach Neubauer ausgezählt. Die somit in ihrem Anteil bestimmten überlebenden Zellen wurden für die folgenden Experimente auf Kulturschalen ausplattiert.
Die Myozyten wurden in einer Dichte von 1,4x 103 / cm² sogenannter rod-shaped cells (d.h. auf Grund Ihrer Rutenform als definitiv lebend zu identifizierende Zellen) auf zuvor mit Laminin (10ug/ml) beschichteten Kulturschalen aufgebracht, nach zwei Stunden dreimal mit Medium gewaschen um die nicht anhaftenden und damit toten Zellen zu entfernen und dann für 24h im Brutschrank (CO2 – Auto- Zero, Heraeus Instruments, Hanau) kultiviert. Zu dem in den Kontrollgruppen eingesetzten M 199 (1,75 mmol/L Ca2+ und kein PE) wurde in den anderen Gruppen PE (10umol/L) bzw. CaCl2 (3,0 mmol/L) zugesetzt. Nach 24h Kultur wurden die Zellen mit 5 mL PBS-Lösung gewaschen, mit einem Zellschaber aus Latex in 5mL PBS überführt, bei 1500 U/min für 5 min bei 4°C zentrifugiert und die Zellpellets nach pipettieren des Überstandes in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C bis zu weiteren Analyse aufbewahrt.
2.7. Präparation, Kultivierung und Registrierung von mechanischen Parametern der Herzmuskelstreifen von Kaninchen
Weibliche Chinchilla Bastard Kaninchen (Gewicht:1,5-2,0 Kg) wurden mit Natrium-Thiopental (50 mg/kg KG) i.V. narkotisiert und erhielten ebenfalls 1000 i.U. Heparin zur Antikoagulation in die Ohrvene. Das Herz wurde schnellst möglich frei präpariert und per retrograder Perfusion über die kanülierte Aorta mit Dissektionslösung (Tabelle 6) gewaschen. Die Dissektionslösung enthielt im Gegensatz zur Experimentierlösung BDM, welches durch reversible Interaktion mit den Myosinquerbrücken der Myofilamente die Kontraktion des Herzmuskels unterbindet. Es wurde der Dissektionslösung zugesetzt, um die Kontraktion der isolierten Trabekel zu unterdrücken aber auch um einen ungestörten Ablauf und minimalen Energieverbrauch des Herzens während der Präparation sicherzustellen. Während des ganzen Vorgangs wurden die Lösungen bei einer Temperatur von 36,5°C mit einem Carbogen Gasgemisch (95% O2/ 5% CO2) über eine Glasfritte (Schott) begast, um einen pH-Wert von 7,4 aufrechtzuerhalten. Unter sauberen Bedingungen wurde unter einem Stereomikroskop (Olympus) mit Hilfe von Instrumenten aus der Augenchirurgie, durch einen Schnitt durch den Truncus pulmonalis der Septum nah fortgeführt wurde, der rechte Ventrikel eröffnet. Von der nun frei liegenden Wand des rechten Ventrikels wurden pro Herz jeweils mindestens zwei freie Trabekelstreifen präpariert, von denen immer ein Präparat pro Herz als Kontrollpräparat diente. Des Weiteren wurde aus Gründen der Qualitätskontrolle immer auch eine Frischprobe genommen, die sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren wurde. Unter 40-facher Vergrößerung des Stereomikroskop
wurden die Dimensionen der Präparate bestimmt. Diese lagen im Durchschnitt bei einer Breite von 0,45 ± 0,03 mm, einer Dicke von 0,39 ± 0,03mm und einer Länge von 4,29 ±0,20 mm. Die Trabekel wurden mit Hilfe einer zum Muskelsauger modifizierten Insulinspritze zur Versuchsanlage transferiert und horizontal im Organbad platziert, in dem das Präparat an einem Ende in dem körbchenförmig gestalteten Stück Platindraht, welches mit einem Piezokraftaufnehmer verbunden war, zu liegen kam und am anderen Ende an dem spießförmigen Stück Platindraht, welches mit einer Mikrometerschraube verbunden war, einfach aufgespießt wurde. Schon während der Trabekelpräparation wurde an den beiden Enden Würfel aus Ventrikelwandgewebe geformt, die das genannte Aufhängungsverfahren ermöglichen, ohne den später kontrahierenden Anteil des Präparats zu beschädigen. Wurden Präparationsfehler bemerkt, also z.B. eine Überdehnung des Präparates, eine Berührung des Muskelstreifens oder eine insuffiziente Heparinisierung des Kaninchens mit resultierender Myokardinfarzierung, so wurde das Präparat verworfen.
Die Präparate wurden über eine Feldstimulation, die durch zwei Silberelektroden im Organbad erzeugt wurde, mit einer Frequenz von 1 Hz bei einer Spannung von 3-5 V stimuliert und so zur Kontraktion gebracht. Die Signale des Piezokraftaufnehmers wurden elektrisch verstärkt, mit Hilfe einer auf LabView basierenden Software aufgenommen und ausgewertet, wobei die Kraft der jeweiligen Präparate auf ihre Querschnittsfläche normalisiert wurde und so in der Einheit mN/mm2 angegeben wurde. Die initiale Ca2+-Konzentration der KH-Lösung von 0,25 mmol/l, wurde schrittweise (um 0,25 mmol/l) auf 1mmol/l erhöht und dann die elektrische Stimulation begonnen. Wenn die Präparate anfingen zu kontrahieren, wurde die Ca2+-Konzentration auf 1,75 mmol/l erhöht und nach einer Stabilisierungsphase mit der Vordehnung der Präparate begonnen, bis eine diastolische Ruhespannung von 2-4 mN/mm2 erreicht wurde. Dieser Wert reflektiert eine physiologische Sarkomerlänge unterhalb Lmax -Sarkomerlänge, bei der die maximal entwickelte Kraft des Trabekels erreicht wird- und liefert die besten Kraftwerte bei Langzeitarbeit des Präparates (Kentisch et al.
1986).
Eines der relativ seltenen Probleme der Methode, welches erst unter Stimulation zutage trat, waren anhaltende autonome Rhythmen des Präparats. Drei Lösungsstrategien wurden hierfür gewählt:
1. Die Stimulation wurde vorübergehend abgeschaltet, bis keine Kontraktionen mehr nachweisbar waren.
2. Die Spannung wurde kurzfristig bis auf 5 V erhöht, um den Muskel auf die Frequenz der Stimulation zu zwingen.
3. Die Stimulationsfrequenz wurde kurzzeitig auf 2 Hz erhöht.
Die drei Strategien konnten die Arrhythmien in der Mehrzahl der Fälle beseitigen. Führte auch mehrfache Wiederholung aller Ansätze nicht zu einer Beruhigung des Muskels, so mussten die Präparate verworfen werden. Nach einer weiteren Stabilisierungsphase wurde die Perfusionslösung auf modifiziertes M 199 Medium gewechselt, welches durch verschiedene Zusätze, u. a. Fettsäuren und Antibiotika, die relativ langen Kulturzeiten erlaubt. Wenn hier nach die Kontraktionsparameter stabil waren, wurde die Inkubation mit den verschiedenen Substanzen für 3, 6 bzw. 10h begonnen. In den sogenannten slack- Experimenten, bei denen die Trabekel ohne diastolische Vorspannung
kontrahierten, wurden die Präparate zu keinem Zeitpunkt gedehnt, aber gleichwertige Stabilisierungsphasen und Inkubationsbedingungen eingehalten. Die permanente Kontraktion der Präparate wurde optisch überwacht, da ja kein Kraftsignal messbar war. Eines der beiden Präparate wurde mit Medium perfundiert, welches mit PE (10umol/l), PE+ Praz (13umol/l), PE + GF109203X (1umol/l) oder PE + Praz + Ca2+ (3 mmol/l) ergänzt wurde. Das Kontrollpräparat wurde mit normalem M 199 Medium, unter ansonsten identischen Bedingungen, bei Zugabe der in der Verumgruppe verwendeten Menge an Lösemitteln perfundiert. Bis auf GF 109203 X, welches nur in DMSO (Dimethylsulfoxid) zu lösen ist, war dies ausschließlich Aqua bidestillata. Nach den o.g.
Inkubationszeiten wurde die elektrische Stimulation abgeschaltet, die zuvor erwähnten Gewebewürfel von den kontrahierenden Anteilen der Trabekel abgeschnitten, da sie durch Irritationen durch die Aufhängung das Ergebnis verfälschen könnten, dass verbleibende Präparat sofort in einem Eppendorf Cup mit RNA-Later Reagenz (Quiagen) durch flüssigen Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Analyse bei –80°C aufbewahrt. In dem RNA-Stabilisierungsreagenz bleibt die RNA bis zu 1 Tag bei 37
°C, 7 Tage bei 18–25 °C oder 4 Wochen bei 2–8 °C intakt, sodass die Lagerung der Proben ohne Eis oder Trockeneis möglich wäre. Die Proben konnten in diesem Reagenz auch bei –20 °C oder –80 °C längerfristig archiviert werden.
2.8. Quantifizierung spezifischer messenger-RNA mit der real-time Polymerasekettenreaktion.
Die DNA freie gesamt RNA, wurde aus den Zellpellets bzw. den Trabekeln mit Hilfe einer Säulenpräparation nach einem Standardprotokoll des Quiagen RNeasy Kit ® und dem RNase-Free DNase Set extrahiert. Der RNeasy Mini Kit ® verwendet zur Isolierung von RNA spezielle Säulen mit einer Silicagel-Membran, an die die RNA bei hoher Salzkonzentration binden kann. Andere Zellbestandteile können durch mehrere Waschschritte effizient entfernt und die gereinigte RNA anschließend eluiert werden. Die cDNA-Synthese wurde mit der reversen Transkriptase superscript II und Random Primern (beide von Invitrogen) nach einem Invitrogen Standardprotokoll durchgeführt.
Die real-time PCR ist eine Methode zur genauen Quantifizierung von DNA- bzw. nach cDNA-Synthese in diesem Fall auch mRNA-Mengen (Ginzinger 2002, Bustin 2002, Guilietti et al. 2001). Vom Grundprinzip her läuft sie genauso ab wie eine herkömmliche PCR: Aus einer einzelsträngigen cDNA wird ausgehend von einem Startermolekül durch eine DNA-Polymerase ein neuer DNA-Strang synthetisiert. Als Startermoleküle werden synthetische DNA-Oligonukleotide (Primer) verwendet, die an die Matrizen-DNA hybridisieren. Von deren 3´-Ende aus synthetisiert die DNA-Polymerase den neuen DNA-Doppelstrang. Durch die Wahl eines gegenläufig orientierten Primerpaares kann gezielt die DNA-Sequenz zwischen den beiden Primern vervielfältigt werden. Das entscheidende Prinzip der PCR ist die zyklische Wiederholung der einzelnen Reaktionsschritte, wobei die DNA exponentiell amplifiziert wird. Bei der normalen PCR werden nach Abschluss der Reaktion die entstandenen Produkte auf einem Agarosegel aufgetrennt, identifiziert und semiquantitativ bestimmt. Man bezeichnet dies auch als Endpunktsbestimmung, da die Menge an entstandenem Produkt erst nach abgeschlossener PCR-Reaktion bestimmt wird. Das Besondere der real-time PCR ist, dass während der PCR-Reaktion permanent die Menge des entstandenen Produktes gemessen und aufgezeichnet
wird. Bei einer späteren Auswertung können Expressionsunterschiede der zu untersuchenden Gene zwischen zwei Proben im exponentiellen Bereich der PCR-Reaktion bestimmt werden.
Die folgende PCR-Reaktion wurde in einem real-time Lightcycler (Roche®) durchgeführt.
Wesentliches Prinzip der real-time PCR ist, dass ein durch Licht zur Fluoreszenz anregbares Reagenz an die Zyklus um Zyklus amplifizierte Doppelstrang DNA bindet. So können nach jedem Zyklus in Echtzeit die Amplifikationsrate ermittelt werden und Quantifizierungsanalysen durchgeführt werden.
Spezifität für ein bestimmtes Gen kann im Wesentlichen durch zwei Methoden erreicht werden. Man kann Randomprimer zusammen mit einer sequenzspezifischen, fluoreszenzfähigen Sonde zum Reaktionsansatz zugeben, z.B. TaqMan® oder aber SYBRGreen®, ein Reagenz dass nach Anregung mit Licht der Wellenlänge von 530 nm fluoreszenzfähig ist und spezifisch nur an Doppelstrang DNA bindet, zusammen mit sequenzspezifischen Primern in den Reaktionsansatz geben, so das von dem sequenzunspezifischem SYBRGreen®, nur die spezifisch amplifizierte Sequenz detektiert wird. Beim vorliegenden Protokoll wurde sich für den Ansatz mit SYBRGreen® entschieden, da diese die momentan kostengünstigste Methode darstellt, wobei ein Nachteil darin besteht, dass jegliche Art von doppelsträngiger DNA erfasst wird, also auch unspezifische Produkte wie z.B. Primer-Dimere. Deren Entstehung kann aber unter optimierten Bedingungen bezüglich Salzkonzentration und Temperatur erfolgreich minimiert werden.
Der Reaktionsansatz enthielt hierbei in einem Volumen von 20 ul, 2 ul cDNA, 0,5 umol/l der jeweiligen Primer, 1 U der Taq DNA Polymerase (Invitrogen), 2 ul von 10fach konzentrierten PCR-Puffer (Invitrogen), 0,2 mmol/l jedes dNTP (BioLine), 2,5 mmol/l MgCl2 , 500 mg/l BSA (New England BioLabs), 50 ml/l DMSO (Sigma) und 1ul von 1/1000 SYBRGreen stock (Roche). Nach einer initialen Denaturierungsstufe von 30 s bei 95°C, folgte das Zyklusprogramm mit 94°C für 0 s, 60°C für 5 s und 72°C für 10 s je Zyklus bei insgesamt 45 Zyklen. Die Emission bei 530 nm wurde nach jedem Zyklus bei 82°C für SERCA 2a und BNP, bei 85°C für GaPDH, und bei 81°C für NCX gemessen. Die jeweiligen Primerpaare sind in Tab. 9a/9b angegeben. RNA-Lösungen mit bekannten Konzentrationen der jeweiligen Gene, wurden für die Quantifizierungsstandardkurven bei jedem realtime PCR-Ansatz mitgeführt.
Tabelle 9a: Primersequenzen Ratte
Gen Primersequenz Temperatur
SERCA 2a Sense: 5´-CGA GTT GAA CCT TCC CAC AA-3´
Antisense: 3´-AGG AGA TGA GGT AGC CGA TGA A-3´
87°C NCX Sense: 5´-CCG TAA TCA GCA TTT CAG AG-3´
Antisense: 5´-GCC AGG TTC GTC TTC TTA AT-3´
80°C BNP Sense: 5´-TCC AAG ATG GCA CAT AGT TC-3´
Antisense: 5´-AGG ATC ACT TGA GAG GTG GT-3´
83°C GaPDH Sense: 5´-AAG GTC ATC CCA GAG CTG AA-3´
Antisense: 5´-AGG AAT GGG AGT TGC TGT TG-3´
84°C
Tabelle 9b: Primersequenzen Kaninchen
2.9. Datenverarbeitung und Statistik
Nach beendeter PCR-Reaktion setzt man einen Schwellenwert für die Fluoreszenz fest und bestimmt für jede Probe die Anzahl der Zyklen, bei der dieser Schwellenwert erreicht ist. Diese Werte bezeichnet man auch als ct-Werte (cycle threshold). Eine Probe mit einem höheren ct-Wert hatte eine niedrigere Ausgangskonzentration an zu amplifizierender cDNA, da mehr Zyklen benötigt wurden um den Fluoreszenzschwellenwert zu erreichen. Eine Probe mit einem niedrigeren ct-Wert dem entsprechend eine höhere. Zur quantitativen Auswertung und zum Vergleich zweier Proben wird die Differenz der ct-Werte gebildet.
Abb. 8: Graphische Darstellung des Quantifizierungsprinzips mittels Lightcycler real-time PCR.
Die Expressionsmenge der Gene NCX 1, SERCA 2a, und BNP wurden zu GaPDH normalisiert in dem Quotienten gebildet wurden. Es wurden grundsätzlich Doppelbestimmungen durchgeführt, aus denen dann Mittelwerte errechnet wurden, die in Microsoft-Excel-Formaten weiter ausgewertet wurden.
Die durch eine Wandlerkarte umgewandelten elektronischen Signale des Kraftaufnehmers, wurden mit der LabView® Software als mechanische Parameter akquiriert und als single twitches und chart files gespeichert (Abb.9). Die Auswertung erfolgte ebenfalls mit der LabView® Software, um sie dann in Microsoft-EXCEL-Formate zu überführen und statistische Analysen durchzuführen beziehungsweise Diagrammdarstellungen erstellen zu können.
Gen SERCA 2a NCX BNP GaPDH
Primersequenz Temperatur
Sense: 5´-CGA GTT GAA CCT TCC CAC AA-3´
Antisense: 5´-AGG AGA TGA GGT AGC GGA TGA A-3´
82°C Sense: 5´-CTG GAG CGC GAG GAA ATG TTA-3´
Antisense: 5´-GAC GGG GTT CTC CAA TCT CAA-3´
81°C Sense: 5´-TGC TCT TCT TGC ACC TGT-3´
Antisense: 5´-GCA GCT GCT GTA TCT CAG AAA-3´
82°C Sense: 5´-TGC CGA GTA CGT GGT GGA AT-3´
Antisense: 5´-GAT GGC GTG CAC CGT GGT CAT-3´
85°C
Abb. 9: Exemplarische Originalregistrierungen von single twitches, also einem einmaligen Kontraktionsablauf (links), und den sog. chart files, die kumulative Darstellung aller single twitches über die gesamte Versuchszeit (rechts).
0 5 10 15 20 25 30 35 40
0 100 200 300 400 500 600 700 800 time [ms]
F [mN]
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
stead pre PE
perf on 1h 2h 3h 4h 5h 6h 7h 8h 9h 10h
time [ h]
F [mN]
Die Daten der real-time PCR wurden mit der zum Roche Lightcycler gehörenden Software Real Quant 1.01 (Abb.10.) ausgewertet und dann ebenfalls zu weiteren Analysen in Microsoft-EXCEL- Formate überführt. Alle Daten sind als Mittelwerte ± standard error of the mean (SEM) aufgeführt. Sämtliche Unterschiede in den jeweiligen Datengruppen wurden mit dem gepaarten t-Test auf Signifikanz getestet. Hierbei wurde bei einem p< 0,05 von Signifikanz ausgegangen.
Abb. 10.: Exemplarische Originalregistrierung der Lightcycler Messung.
A= Temperaturverlauf in den einzelnen Zyklen. B= Fluoreszenzzunahme im Verlauf der Zyklen.
C= Fluoreszenzgrösse im aktuellen Zyklus D= Wahl der Zyklusanzahl E = verwendetes Messprotokoll
Die Präparate in den unterschiedlichen Versuchsgruppen wurden hinsichtlich Vergleichbarkeit in den Dimensionen, als auch in der Kraftentwicklung vor Versuchsbeginn untersucht. Hier waren folgende Ergebnisse zu ermitteln, und damit Vergleichbarkeit gegeben (Abb.11).
Abb. 11: Vergleichbarkeit der Gruppen.
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
mm
0 1 2 3 4 5 6
cm
0 5 10 15 20 25 30
Fdev [mN]
Vergleich der Präparatdicke:
(Doppelbalken li.): Kontrolle=0,44mm;
Verum=0,45mm: p-Wert= 0,75;
Präparatbreite (Doppelbalken re.):
Kontrolle=0,4mm; Verum=0,37mm;
p-Wert: 0,5
Vergleich der Präparatlänge:
Kontrolle (li.) Mittel=4,5cm gegen Verum (re.) Mittel=4,08cm;
p-Wert: 0,32
Vergleich der entwickelten Anfangskraft vor Versuchsbeginn:
Kontrolle (li.) Mittel 22,35 mN;
Verum (re.) Mittel 16,83 mN p-Wert: 0,144
3. Ergebnisse
3.1. Dosis-Wirkungs-Beziehung von Phenylephrin und isometrischer Kraft.
Um zu gewährleisten, dass die für die weiteren Untersuchungen gewählte PE-Konzentration im ausreichenden Maße die α1-adrenerge Kaskade stimuliert, wurden zu Beginn an isolierten, elektrisch stimulierten rechtsventrikulären Trabekeln vom Kaninchen, Kraftmessungen bei verschiedenen PE Konzentrationen durchgeführt und der positiv inotrope Effekt als Maß für den Grad der alpha- adrenergen Aktivierung gemessen. Hierzu wurden n=17 Versuche durchgeführt (Abb. 12). Bei einer Konzentration von 10 μmol/L, war die entwickelte isometrische Kraft ~2,4-fach höher als in der Ausgangssituation ohne Phenylephrin. Die Fdev (entwickelte Kraft= developed force) lag hier bei 37,4
± 5,6 mN. Diese Konzentration wurde in allen folgenden Experimenten erzeugt. Frühere Studien bevorzugten Konzentrationen von 10umol/L (Reinecke et al. 1997) und 20 umol/L PE (Golden et al.
2000), um Veränderungen in der NCX-Expression von adulten und neonatalen Kardiomyozyten der Ratte zu untersuchen.
3.2. Elektrisch stimulierte rechtsventrikuläre Trabekel des Kaninchens
Die mit einer Frequenz von 1 Hz kontinuierlich kontrahierenden Trabekel wurden nach 3, 6 und 10h aus der Versuchsanlage genommen und die mRNA-Menge der o. g. Gene mit der real-time PCR bestimmt. Als Kontrolle dienten in diesen Versuchsreihen Trabekelpräparate vom gleichen Tier, die äquivalente Zeiteinheiten in Medium ohne PE kontrahierten.
Nach 3h zeigte sich hierbei eine nicht signifikante, steigende Tendenz der NCX- mRNA- Transkription, die nach 6h in eine Verminderung umschlägt und nach 10h eine signifikante Verminderung der NCX 1-mRNA-Transkription darstellt: 76,6% von Kontrolle ± 3,2; p<0,005.
Des Weiteren ist eine signifikante Steigerung der BNP-Transkription nach 10h zu beobachten: 722,8%
±337,1; p<0,04, während die Transkription der SERCA 2a keine signifikante Veränderung zeigt.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
stead pre PE 0.03 umol/L 0.1 umol/L 0.3 umol/L 1 umol/L 3 umol/L 10 umol/L 30 umol/l 60 umol/L 100 umol/L
Fdev (mN/mm2 )
Abb. 12: Dosis-Wirkungs-Beziehung der entwickelten Kraft von PE in elektrisch stimulierten, isolierten, rechtsventrikulären Trabekeln des Kaninchens. Ein eindeutig dosisabhängiger Kraftanstieg ist sichtbar, welcher bei 10 µmol/L keine weitere signifikante Zunahme zeigt. Fdev= 37,4 ± 5,6 mN, n=17
In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Myozytenkulturen, waren diese transkriptionellen Effekte des PE bei Experimenten in denen die Präparate zu keinem Zeitpunkt irgendeine Form von Last erfuhren, die so genannten „slack“ Experimente, nicht zu beobachten. Abb. 13.
Des Weiteren wurde die These aufgestellt, dass die unter PE-Einfluss beobachteten Transkriptionsveränderungen in der Signalkaskade abwärts über den α1-Adrenorezeptor und die Proteinkinase C vermittelt werden. Dies scheint sich zu bestätigen, da der Effekt von PE bei gleichzeitiger Zugabe des α1-Adrenorezeptor selektiven Rezeptorblockers Prazosin nicht mehr zu beobachten ist. Gleiches zeigt sich bei Zugabe des PKC selektiven Inhibitors GF 109203 X. (Abb. 14).
Abb. 13: PE-Effekt bei RV-Trabekeln. Effekt von 10 umol/L PE auf mRNA-Expression von NCX 1, SERCA 2a und BNP normiert zu GaPDH in elektrisch stimulierten, isometrisch kontrahierenden, ventrikulären Kaninchentrabekeln nach 10h bei optimaler Vorlast (oben) und bei Trabekeln, die ohne jegliche Last, slack kontrahierten (unten).
* p<0.04; n=6 jeweils von 6 versch. Präparationen. Einfarbige Säule= Kontrolle, schraffierte Säule= +PE
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
NCX/GaPDH
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
SERCA/GAPDH
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
BNP/GaPDH
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08
NCX/GaPDH
0 0,025 0,05 0,075 0,1 0,125 0,15
SERCA 2a/GaPDH
0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03
BNP/GaPDH
