Quarz Einstufung, Dosis-Wirkungs-Beziehungen

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- Tagung -

Quarz Einstufung, Dosis-Wirkungs-Beziehungen

Workshop vom 07./08. März 2002 in Berlin

Dortmund/Berlin/Dresden 2002

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biologischen Arbeitsstoffen“

der Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin

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ISSN 1433-2132

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Inhaltsverzeichnis

Seite

Kurzreferat 5

Abstract 6

I. Einführung 7

W. D. Schneider

II. Quarz-Einstufung: 8

Einstufungsbegründung aus Sicht der Literatur (IARC, MAK) H. Muhle / U. Heinrich

III. Neue experimentelle Daten mit Einstufungsrelevanz: 16 Inflammatorische, fibrogene und genotoxische

Effekte unterschiedlicher Quarzspezies J. Bruch

IV. The variability of the quartz hazard: 40

studies with workplace, commcial and model quartzes P. Borm

V. Chemical reactivity of the quartz surface in relation 49 to its toxicity and genotoxicity

B. Fubini

VI. Metaanalyse der epidemiologischen Studien (II) 69 – Kausalität, Risiko und Prävention

F. Bochmann

VII. Epidemiologische Daten außerhalb des Steinkohlenbergbaus 82 zum Zusammenhang zwischen Quarzstaubexposition und

der Lungenkrebsmortalität P. Morfeld

VIII. Position des Beraterkreises Toxikologie des AGS zur Frage der 109 Einstufung von kristallinem Siliciumdioxid (Quarz [14808-60-7] und

Cristobalit [14464-46-1]) in Form von alveolengängigen Stäuben G. Schlüter

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IX. Schlussfolgerungen zur kanzerogenen Wirksamkeit 134 H. Greim

X. Epidemiologische Daten zu Dosis-Wirkungs-Beziehungen 136 bezüglich Krebs

G. Heuchert / M. Möhner

XI. Epidemiologische Daten zur Silikose 145

K. Rödelsperger

XII. Epidemiologische Daten außerhalb des Steinkohlenbergbaus 160 zum Zusammenhang von Quarzstaubexposition und dem

Vorkommen chronischer Bronchitis P. Morfeld

XIII. Risikobetrachtung bei der Übertragung tierexperimenteller 174 Daten zur Kanzerogenität und Fibrogenität durch Quarz

auf den Menschen M. Roller

XIV. Schlussfolgerungen zu Dosis-Wirkungs-Beziehungen 196 K. Straif

Referenten und Autoren 199

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Quarz – Einstufung, Dosis-Wirkungs-Beziehungen

Kurzreferat

Der Workshop führte Experten der Toxikologie, Epidemiologie und Arbeitsmedizin zusammen, um den aktuellen Stand des Wissens der jeweiligen Fachgebiete zur kanzerogenen Wirksamkeit von alveolengängigem Quarzstaub zu diskutieren. Dabei wurden sowohl die toxikologische als auch die epidemiologische Datenlage im Detail dargelegt. Trotz der Kenntnislücken zu Mechanismen der Kanzerogenese infolge Quarzbelastung und der Unsicherheiten epidemiologischer Studien zu Dosis- Wirkungs-Beziehungen bestand Konsens dafür, dass genügend Hinweise auf die Verursachung von Lungenkrebs in Zusammenhang mit Quarzexposition vorliegen, um Handlungsbedarf im Arbeitsschutz auszulösen. Wie solche Maßnahmen im Detail aussehen sollten, war nicht Gegenstand dieses Workshops, sondern wird im Gefahr- stoffausschuss und seinen Gremien weiter zu präzisieren sein.

Im Hinblick auf mögliche Maßnahmen wurde im zweiten Teil erörtert, inwieweit es die Datenlage zu den drei verschiedenen Endpunkten der Wirkungen von Quarz in der Lunge (Krebs, Silikose und chronische Bronchitis) gestattet, Empfehlungen für einen Luftgrenzwert abzuleiten. Im Ergebnis der Diskussion ist festzustellen, dass derzeit ein sicherer No-effect-level für keinen der Endpunkte gegeben ist. Andererseits finden sich bei höheren Konzentrationen Dosis-Wirkungs-Beziehungen, die Risikoab- schätzungen erlauben. Dies gelingt mit befriedigendem Resultat für Silikose und Krebs, weniger gut für die chronische Bronchitis, wenn man versucht, die Quarzwir- kung von der allgemeinen Partikelwirkung zu trennen. Die Quarzwirkung wird durch Begleitstäube anderer Zusammensetzung, durch Hitzeeinwirkung und anderes modifiziert. Die Studienergebnisse sind abhängig von den Eigenschaften der untersuchten Populationen, von der Qualität der Expositionsermittlung, von der Beobachtungsdau- er und von den Auswertungsmodellen. Für einen sicher gesundheitsbasierten Grenzwert besteht noch Forschungsbedarf, dessen mögliche Richtungen kurz umris- sen werden.

Schlagwörter:

Quarz, alveolengängiger Staub, Krebs, Silikose, chronische Bronchitis, Toxikologie, Epidemiologie, Dosis-Wirkungs-Beziehungen, Pathomechanismen

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Quartz – classification, dose-effect-relationships

Abstract

Experts of toxicology, epidemiology and occupational medicine gathered in that workshop to discuss the actual knowledge in these disciplines regarding cancero- genicity of respirable quartz dust. Toxicological as well as epidemiological data were demonstrated in detail. Despite the gaps in knowledge on mechanisms of cancero- genesis induced by quartz and despite the uncertainties in epidemiological studies for dose-response-relationships the participants reached consent that there are sufficient hints for causation of lung cancer in association with exposure to quartz to call for action in the labour protection system. Type and scope of those measures were not topic of the workshop, but need to be worked out and discussed in the Committee on Dangerous Substances and its subcommittees.

In view of possible measures during the second part of the workshop it was discussed if the data for the three endpoints of quartz effects (cancer, silicosis, chronic bronchitis) may allow to derive recommendations regarding a threshold limit value in air. In conclusion it must be stated that at this time there is no safe No-effect-level given for any of the endpoints. On the other hand there are dose-effect-relationships, which provide the chance of risk assessments. This can be done with satisfying results for silicosis and cancer, but with less success for chronic bronchitis if one tries to separate the general particle effect from substance specific effects of quartz. The inflammatory quartz effect is modified by accompanying other dusts, by exposure to high temperatures et al. Study results depend on the population examined, on the quality of exposure assessments, on length of follow-up and the models used in cal- culations. To reach a safe health-based threshold limit value more research is nec- essary for which recommendations are outlined in brief.

Key-words:

Quartz, respirable dust, cancer, silicosis, chronic bronchitis, toxicology, epidemiology, dose-effect-relationships, mechanisms.

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I. Einführung

W. D. Schneider

Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin, Berlin

Nachdem die Internationale Agentur für Krebsforschung (IARC) 1997 festgestellt hatte “Crystalline silica inhaled in the form of quartz or cristobalite from occupational sources is carcinogenic to humans” und die Senatskommission der DFG kristallinen Quarz und Cristobalit in der A-Fraktion 1999 mit K1 beurteilt hatte, war im AGS sei- tens der Sozialpartner anlässlich einer Diskussion dieses Sachverhalts im Vorjahr weiterer Klärungsbedarf zum Ausdruck gekommen. Um diesen Informationsbedarf zu decken und offene Fragen mit allen interessierten Partnern zu erörtern, hat die Bun- desanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin (BAuA) nach gemeinsamer Vorbe- reitung durch Vertreter des AGS, der Berufsgenossenschaften (BIA), der Industrie und der BAuA am 7./8.3.02 in Berlin den Workshop „Quarz – Einstufung, Dosis- Wirkungs-Beziehungen“ durchgeführt.

Insgesamt 73 Teilnehmer erörterten mit Experten der Toxikologie, Epidemiologie und Arbeitsmedizin den aktuellen Kenntnisstand. Das Programm gliederte sich in zwei Problemkreise:

1. Wie sicher ist auch unter Berücksichtigung neuer Untersuchungsergebnisse der experimentellen Forschung die Datenlage für die Einstufung von kristallinem Quarz als krebserzeugenden Stoff?

2. Was ist bekannt zu Dosis-Wirkungs-Beziehungen bzw. Wirkungsschwellen für die verschiedenen biologischen Wirkungen von Quarz?

Die hier zum Teil in erweiterter Textfassung, zum Teil nur als Abbildungsfolge abge- druckten Beiträge spiegeln den heutigen Kenntnisstand umfassend wider und der Interessierte wird in den Texten eine Fülle von Detailinformationen finden. Der eilige Leser sei auf die Schlussfolgerungen zu den beiden Teilen des Workshops von GREIM und STRAIF verwiesen, die ein aktuelles Fazit zu Toxikologie und Epide- miologie von Quarz enthalten.

Im Ergebnis des Workshops ergab sich Konsens dafür, dass Quarz in der A- Staubfraktion unter bestimmten Bedingungen am Arbeitsplatz für den Menschen kanzerogen wirkt. Diese Wirkung ist dosisabhängig, eine sichere Schwelle ist aber derzeit nicht zu beziffern. Die Quarzwirkung kann durch Begleitstäube anderer Zu- sammensetzung, durch Hitzeeinwirkung und anderes modifiziert werden. In dem Niedrigdosisbereich ist die Beschreibung der Dosis-Wirkungs-Beziehungen für die unterschiedlichen Endpunkte noch mit erheblichen Unsicherheiten behaftet. Diese resultieren unter anderem aus der Abhängigkeit der Ergebnisse von den Eigen- schaften der untersuchten Populationen, von der Qualität der Expositionsermittlung, von der Beobachtungsdauer oder von den Auswertungsmodellen. Für einen sicher gesundheitsbasierten Grenzwert besteht noch Forschungsbedarf. Ungeachtet dessen dominierte die Auffassung, dass die beschriebene Datenlage als Basis eines im AGS zu erörternden Maßnahmekonzeptes zur Reduzierung der Gefährdung der Be- schäftigten mit Belastung durch alveolengängigen Quarzstaub zu nutzen ist.

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II. Quarz-Einstufung: Einstufungsbegründung aus Sicht der Literatur (IARC, MAK)

H. Muhle / U. Heinrich

Fraunhofer Institut für Toxikologie und Aerosolforschung, Hannover

Einleitung

In den letzten Jahren haben sich mehrere internationale und nationale wissenschaftliche Gremien mit der Einstufung von kristallinem Siliziumdioxid (SiO2) beschäftigt.

Die „International Agency for Research on Cancer“ (IARC) in Lyon hat 1987 und 1997 Monographien zu diesem Thema verfasst. Die „Nordic Expert Group for Docu- mentation of Occupational Exposure Limits” hat 1993 kristallines SiO2 bewertet und die Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deut- schen Forschungsgemeinschaft hat 1999 ihre Einschätzung zu Quarz publiziert. In dieser kurzen Zusammenfassung wird hauptsächlich auf die Stellungnahmen der IARC und der MAK-Kommission eingegangen. Im Folgenden werden nur einige wesentliche Punkte für die Einstufung von Quarzstaub als kanzerogenes Agens nach chronischer beruflicher Exposition vorgestellt, da die ausführlichen Begründungen der genannten Kommissionen vorliegen.

In dieser Abhandlung wird der Schwerpunkt auf tierexperimentelle Studien gelegt, da im Verlauf des Workshops eine Reihe von Vorträgen die Bewertung der vorliegenden epidemiologischen Studien behandeln.

Zunächst werden die Kriterien aufgezeigt, nach denen die genannten Gremien vorgehen. Diese Prüfsteine beruhen auf einer jahrzehntelangen Erfahrung mit der Be- wertung von krebserzeugenden Stoffen. Dann wird auf die Datenbasis verwiesen, die den genannten Gremien in ihrer Beratung wesentlich erschien, und danach wird die Entscheidung dieser Gremien dargestellt.

In der Abfolge der vorliegenden Daten wird dem Vorgehen der IARC gefolgt, die zu- nächst vorliegende epidemiologische Studien heranzieht und diese für sich alleine bewertet. Danach wird die entsprechende Datenbasis für die Tierversuche dargestellt, für die ebenfalls eine eigenständige Bewertung vorgenommen wird. Schließlich wird eine Gesamtbewertung aus den Einzelbefunden abgeleitet. Da die MAK- Kommission im Prinzip analog vorgeht, werden diese beiden Bewertungen parallel dargestellt. Die Bewertung durch die „Nordische Expertengruppe“ wird nur in ihrem Gesamtergebnis zu Beginn vorgestellt.

Chemische Identifikation der zu behandelnden Stoffe

Dieser Abschnitt bezieht sich auf kristallines SiO2, das in der Modifikation als β- Quarz oder als Cristobalit vorliegt. Wie weiter unten ersichtlich wird, lassen sich die toxikologischen und arbeitsmedizinischen Ergebnisse nicht erklären, wenn man von einer gleichartigen Wirkungsstärke verschiedener Variabilitäten von β-Quarz aus-

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geht. Vielmehr gibt es eine Vielzahl unterschiedlicher Einflussfaktoren, deren toxikologische Bedeutung im Einzelnen noch nicht hinreichend klar ist.

Frisch gebrochene Oberflächen von Quarz scheinen eine stärkere toxische Wirkung aufzuweisen als gealterte Oberflächen (VALLYATHAN et al., 1995). Offensichtlich ist für die Beurteilung einer Quarz-Varietät nicht nur die chemische Stoffbeschreibung wichtig; sondern auch die Art der Behandlung. Dieser komplexe Zusammenhang ist ungewöhnlich für die Beschreibung eines Gefahrstoffes und erschwert eine gezielte Regulation.

Eigenschaften von Quarz, die für die gesundheitliche Wirkung von Bedeutung sein könnten

„Der Mechanismus für die Entstehung der Silikose und die Entwicklung von Lungen- tumoren bei Menschen und Tieren nach Exposition gegenüber Quarz ist noch nicht geklärt. Der Wirkungsmechanismus der Toxizität von Quarz und anderen SiO2- Modifikationen beruht wesentlich auf einer direkten Wechselwirkung der Quarzober- fläche mit den Zellmembranen oder Zellflüssigkeiten. Behandlungen wie Erhitzen, Ätzen mit Chemikalien oder Mahlen von Quarz können die Oberflächeneigenschaf- ten und somit die Toxizität von Quarzpartikeln verändern (FUBINI, 1998; FUBINI et al., 1995). Durch Bindung dreiwertiger Ionen wie Al³⁺ oder Fe³⁺ kann die Wirkung von Quarz auf Zellmembranen vermindert werden (NOLAN et al., 1981). ...“ (GREIM, 1999)

„Als beteiligte Oberflächenkomponenten werden funktionelle Gruppen diskutiert, die zu hydrophilem oder hydrophobem Charakter, zu Ladungen oder reaktiven Radika- len an den Partikeloberflächen führen und die die Fähigkeit, Wasserstoffbrückenbin- dungen auszubilden, beeinflussen (FUBINI, 1998).“ (GREIM, 1999).

Die Frage der toxischen Wirkung verschiedener Quarz-Varietäten wird verstärkt seit der Einstufung von Quarz durch die IARC diskutiert (BORM und TRAN, 2002; CLOUTER

et al., 2001; SEILER et al., 2001a, 2001b).

Bewertung durch die „Nordische Expertengruppe“ (1993)

Die zusammenfassende Bewertung ist in Englisch verfasst. Da der Wortlaut bedeut- sam ist, wird diese Bewertung in ihrer Originalfassung zitiert: “Crystalline silica (SiO2) is the most abundant mineral in the earth´s crust. This criteria document reviews en- vironmental and occupational exposure to silica-containing dust and various health effects which may result from exposure. The epidemiological and experimental evidence for a possible carcinogenic effect of silica dust is reviewed and discussed.

From the available data it is concluded that working conditions with exposures which are today regarded as low enough to prevent the occurrence of silicosis (< 0.04 mg/m³of respirable crystalline silica), will probably also be sufficiently low to prevent any possible observable increased risk of lung cancer in humans” (Hilt, Nordic expert group, 1993).

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Epidemiologie (IARC, MAK)

Kriterien der Bewertung der IARC: “Sufficient evidence of carcinogenicity: The Working Group considers that a causal relationship has been established between exposure to the agent, mixture or exposure circumstance and human cancer. That is, a positive relationship has been observed between the exposure and cancer in studies in which chance, bias and confounding could be ruled out with reasonable confi- dence.”

Die analogen Kriterien der MAK-Kommission lauten: „In Gruppe 1 werden Stoffe eingestuft, die beim Menschen Krebs erzeugen und bei denen davon auszugehen ist, dass sie einen nennenswerten Beitrag zum Krebsrisiko leisten. Epidemiologische Untersuchungen geben hinreichende Anhaltspunkte für einen Zusammenhang zwischen einer Exposition beim Menschen und dem Auftreten von Krebs. ...“

Über 40 epidemiologische Studien wurden nach den aufgeführten Kriterien bewertet.

Danach blieben etwa 10 Studien übrig, bei denen davon ausgegangen wurde, dass eine mögliche kokanzerogene Wirkung, die von anderen krebserregenden Stoffen wie Radon oder Arsen verursacht wurde, ausgeschlossen war. In diesen verbleiben- den Studien wurde ein Zusammenhang zwischen Quarzexposition und Lungenkrebs gesehen. Das relative Lungenkrebsrisiko von an Silikose Erkrankten lag dabei mit 1,5 bis 6 deutlich höher als bei Personen, die nicht an einer Silikose erkrankt waren.

Auf dieser Datenbasis kam die Arbeitsgruppe der IARC (1997) zu der Auffassung, dass eine „sufficient evidence“ für die Kanzerogenität von inhaliertem kristallinem Siliciumdioxid in der Modifikation von Quarz oder Cristobalit nach beruflicher Exposi- tion vorliegt.

„Für die Beurteilung in der MAK-Kommission bezüglich der Kanzerogenität von kristallinem Siliciumdioxid wurden neun Kohortenstudien aus verschiedenen Industrie- zweigen (3 Studien aus der Granitindustrie, 4 Studien aus der Keramikindustrie, je eine Studie aus der Gewinnung von Diatomeenerde und aus dem Goldbergbau) als besonders bewertungsrelevant betrachtet. Die Mehrzahl dieser Studien zeigt bei inhalativer Exposition gegenüber alveolengängigen Stäuben von kristallinem Silicium- dioxid im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung eine Übersterblichkeit durch Lungen- krebs.“ (GREIM, MAK-Begründung zu Siliciumdioxid, kristallin. 1999)

Tierversuche

Die Kriterien der IARC lauten. „Sufficient evidence of carcinogenicity: The Working Group considers that a causal relationship has been established between the agent or mixture and an increased incidence of malignant neoplasms or of an appropriate combination of benign and malignant neoplasms in (a) two or more species of ani- mals or (b) in two or more independent studies in one species carried out at different times or in different laboratories or under different protocols. ...”

Es existieren vier chronische Inhalationsstudien an Ratten, zwei davon mit einem DQ12 Quarz aus Deutschland und zwei weitere Studien mit einem aus Amerika stammenden Quarz mit der Bezeichnung Min-U-Sil. Bei letzterer Testsubstanz lagen die im Tierversuch eingesetzten Konzentrationen von 12 und 51,6 mg Quarzstaub

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pro m³. Die beim DQ12 Quarz eingesetzten Konzentrationen lagen bei 1; 6,1 und 30,6 mg pro m³. Bezüglich der detaillierten Versuchsprotokolle wird auf die IARC- und MAK-Begründung verwiesen.

IARC (1997): „Different specimens of quartz with particle sizes in the respirable range were tested in four experiments in rats by inhalation and in four experiments in rats by intratracheal instillation. In these eight experiments, there were significant in- creases in the incidence of adenocarcinomas and squamous-cell carcinomas of the lung; marked, dense pulmonary fibrosis was an important part of the biological response. ...”

Die Bewertung der MAK-Kommission (1999) lautet: „In mehreren Kanzerogenesestu- dien induzierte Quarz bei Ratten nach inhalativer und intratrachealer Applikation in der Lunge eine signifikante Erhöhung der Rate der Adenokarzinome und der Platten- epithelkarzinome sowie von Lungenfibrosen. Quarz verursachte jedoch bei Hamstern und bei Mäusen keine erhöhten Inzidenzen von Lungentumoren.“

Gesamtbewertung

IARC (1997)

„In making the overall evaluation, the Working Group noted that carcinogenicity in humans was not detected in all industrial circumstances studied. Carcinogenicity may be dependent on inherent characteristics of the crystalline silica or on external factors affecting its biological activity or distribution of its polymorphs.

Crystalline silica in the form of quartz or cristobalite from occupational sources is carcinogenic to humans (Group 1).

MAK-Kommission (1999)

Einstufung nach Kanzerogenitätskategorie 1 (Krebserzeugend beim Menschen)

„Das Vorliegen modifizierender Eigenschaften von Quarzstäuben bezüglich Kanze- rogenität wird durch die Ergebnisse der Tierversuche gestützt .... Obwohl nicht aus- zuschließen ist, dass die kanzerogene Wirkung der unterschiedlichen kristallinen Modifikationen von SiO2 unterschiedlich sein könnte, sind die derzeit vorliegenden Erkenntnisse jedoch für eine differenzierte Bewertung nicht ausreichend“ (GREIM, 1999).

„Die epidemiologischen Studien zeigen, dass die Lungenkrebshäufigkeit vor allem bei Arbeitern mit einer Silikose erhöht ist. Zur Reduzierung des Krebsrisikos ist daher in erster Linie auf eine Verhinderung der Silikose zu achten“ (GREIM, 1999).

Diese letztere Klarstellung ist sehr wichtig für die Gesamtbewertung. Obwohl es ersichtlich ist, dass sich quarzhaltige Stäube nicht unter allen Bedingungen als kanzerogen erwiesen haben, ist es auf der anderen Seite aber nach Auffassung der IARC und der MAK-Kommission unbestreitbar, dass unter gewissen Umständen nur die chronische Exposition gegenüber quarzhaltigem Staub als Erklärung für das Auftre- ten der beobachteten Tumore in Frage kommt. Vom Standpunkt einer zuständigen Behörde lässt es sich jedoch nicht verantworten, so lange mit Konsequenzen für den

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Arbeitsschutz zu warten, bis diese wissenschaftliche Frage geklärt ist. Die Vorge- hensweise ist vielmehr die, Quarz als kanzerogen einzustufen.

Mögliche Zwischenschritte für eine zielführende Vorgehensweise zuständiger Behör- den sind primär unter politischen Gesichtspunkten zu sehen und außerhalb dieser Abhandlung.

Die für die berufliche Exposition Verantwortlichen sind aufgerufen, die Unterschiede bei verschiedenen Quarzvariabilitäten wissenschaftlich untersuchen zu lassen. Da diese Fragen für den Arbeitsschutz weltweit von Bedeutung sind, ist es denkbar, die Kosten für entsprechende Untersuchungen auf viele Schultern zu verteilen.

Frage nach dem Vorliegen eines Schwellenwertes für die Kanzero- genität von Quarz

Die vorliegenden Daten weisen auf einen statistischen Zusammenhang zwischen Silikoseerkrankung und dem Auftreten von Lungenkrebs hin. Der Zusammenhang bezüglich Mechanismus ist nur unzureichend bekannt. Nach den vorliegenden Hypothesen spielen jedoch persistente entzündliche Reaktionen in der Lunge eine wesentliche Rolle.

SEILER et al. (2001a) behandelten Ratten mittels intratrachealer Instillation (0,15; 0,3;

0,6; 1,2; 2,4 mg/Ratte) und untersuchten die Lungen nach 21 und 90 Tagen. Die als Marker für Mutagenität untersuchte Bildung von 8-Oxoguanin zeigte Mutationen nach der Behandlung von 1,2 und 2,4 mg/Ratte an, nicht jedoch bei den niedrigeren Wer- ten. Die Autoren interpretierten die Daten als No-Effekt-Wert bezüglich Mutagenität.

Die Extrapolation dieser Ergebnisse für den Menschen ist problematisch. Wesentli- che Punkte sind:

↵ Ungleichmäßige Verteilung in der Rattenlunge

Die Vorgehensweise, mittels intratrachealer Instillation bei der Ratte einen Schwel- lenwert für das Auftreten von Mutationen abzuleiten, ist problematisch. Eine intratracheale Instillation führt in der Regel zu einer nicht so gleichmäßigen Verteilung der Prüfsubstanz in der Lunge im Vergleich zur Inhalation (DRISCOLL et al., 2000). Aus diesem Grunde ist diese Applikationsform eher zur Klärung qualitativer und mecha- nistischer Aspekte geeignet.

↵ Frage der Sensitivität des verwendeten Modells

In einer chronischen Inhalationsstudie mit DQ12 Quarz untersuchten MUHLE et al.

(1989, 1996) bei Fischer-Ratten die Kanzerogenität. Die Aerosolkonzentration betrug 1 mg/m³; die nach zwei Jahren retinierte Quarzmasse pro Lunge betrug 0,91 mg/Lunge. Die beobachtete Lungentumorinzidenz betrug 19 %. Dieser Wert lag in der Nähe des Wertes, den SEILER et al. (2001a) als No-Effekt-Wert bezüglich Mu- tagenität bezeichneten.

Eine mögliche Erklärung für die unterschiedlichen Ergebnisse im Vergleich zu SEILER

et al. (2001a) könnte in dem Zeit-Wirkungs-Verhalten liegen. Es ist bekannt, dass die Konzentration im Zielorgan oft eine kritische Zeit aufrecht erhalten werden muss, um chronisch-toxische Wirkungen auszulösen. Die Frage einer erlaubten Extrapolation von 21- oder 90-tägiger Exposition auf eine chronische Exposition (bei der Ratte 24 Monate und mehr) ist sicherlich von kritischer Bedeutung. Quarz zeigt unter den

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gegebenen Versuchsbedingungen nur eine sehr geringe Eliminationsrate aus der Lunge. Unter chronischen Bedingungen können minimale Effekte akkumulieren und so zu einem Ergebnis führen, das in einer subchronischen Studie so nicht zu erkennen ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass es einer Validierung der Methoden bedarf, um von akuten und subchronischen Experimenten auf das chronische Geschehen zu schließen.

Bezüglich der Frage, wie denn eine Extrapolation von Inhalationsexperimenten bei der Ratte für den Menschen zu bewerten ist, ist ROLLER in seinem Vortrag eingegangen.

Auflistung einiger zu klärender Fragen:

Lässt sich ein Beweis führen, dass eine bestimmte Quarz-Varietät kein kanzeroge- nes Potenzial besitzt?

÷ Wie repäsentativ ist eine Probe von ca. 1 Gramm für eine ganze Lagerstätte?

÷ Wie sollte eine verlässliche physikalisch-chemische Charakterisierung von Quarz aussehen, aus der sich die toxikologischen Eigenschaften von Quarz ableiten lassen?

÷ Können ein In-vitro-Test mit Makrophagen oder ein akutes Tierexperiment nach intratrachealer Instillation positive Tierversuche und eine positive Epidemiologie widerlegen?

Vorschlag für die weitere Vorgehensweise

(Physikalisch-chemische Charakterisierung, tierexperimentelle Stu- dien)

1) Anfertigen einer Übersicht über alle vorliegenden In-vitro-Tests und Kurzzeit-In- vivo-Tests einschließlich der physikalisch-chemischen Charakterisierung mögli- cher Testsubstanzen.

2) Identifikation aktiver und weniger aktiver Quarzspezies, die als Kandidaten für weitere toxikologische Untersuchungen in Frage kommen.

3) Herstellung geeigneter Quarzproben in geeigneter Reinheit und Partikelgrößen- verteilung und in ausreichender Menge für Inhalationsversuche.

4) Physikalisch-chemische Charakterisierung dieser Proben. Ziel ist, möglichst re- präsentative und sehr gut beschriebene Testsubstanzen für die toxikologischen Versuche zur Auswahl zu haben.

5) Durchführung subchronischer Inhalationstests an der Ratte. Identifikation geeigneter Biomarker, die qualitativ für die fibrotischen bzw. kanzerogenen Effekte verantwortlich sind. Ein Beispiel einer solchen Studie stellt die Arbeit von JOHNSTON et al. (2000) dar.

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6) Auswahl einer oder zweier geeigneter Quarz-Varietäten für einen chronischen Multidosis-Inhalationsversuch. Dieser Test sollte die in Kurzzeit-Tests verwendeten Marker validieren und die Sensitivität der verwendeten Marker prüfen.

Parallel dazu werden sicher auch weitere epidemiologische Untersuchungen durch- geführt werden. Wünschenswert wäre, dass diese Studien eine aussagefähige Be- schreibung der Expositionsatmosphären beinhalten. Da aber im Laufe eines Berufs- lebens viele unterschiedliche Quarz-Varietäten inhaliert werden, könnte dieser An- satz zu keiner klaren Differenzierung kommen. Der hier vorgeschlagene Ansatz von parallel durchgeführten Untersuchungen von physikalisch-chemischen und toxischen Eigenschaften bei Versuchstieren oder in Zellsystemen wird somit einen wichtigen Baustein zur Aufklärung darstellen.

Literaturverzeichnis

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10. Johnston CJ, Driscoll KE, Finkelstein JN, Baggs R, O’Reilly MA, Carter J, Ge- lein R, Oberdörster G (2000): Pulmonary chemokine and mutagenic responses in rats after subchronic inhalation of amorphous and crystalline silica. Toxico- logical Sciences 56: 405-413

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III. Neue experimentelle Daten mit Einstufungsre- levanz:

Inflammatorische, fibrogene und genotoxische Effekte unterschiedlicher Quarzspezies

J. Bruch

Institut für Hygiene und Arbeitsmedizin der Universität Essen

Summary

The classification of quartz fine dust as carcinogenic working material is afflicted with special problems, which result from the kind of the effects and from the effect quan- tity of this working material. Current research results point on the fact that quartz can be regarded as secondarily carcinogenic material. This means that the particles do not interact directly with the genome of proliferation competent cells. The second characteristic is the large variability of the medical-biological effect of quartz fine dust both in toxicological investigations as well as in epidemiological studies.

In the research project the hypothesis of the secondary genotoxicity should be examined on the basis of a subchronic animal experiment; it is hypothezised that quartz fine dust exhibit threshold values in view to genotoxic effects. The investigation compromises three types of occupational exposure: pure quartz dust (i), quartz dust with small admixtures of clay minerals (product types of dust of the company Hoff- mann mineral) (ii) and finally special fine dust of crystalline silica, from which in epidemiological investigations apparent special endangerments proceed (iii). The two first mentioned groups were tested in vitro in the vector model and in vivo in a subchronic attempt (90 days). It was shown that all examined samples exhibit threshold values for genotoxic effects regarding the formation of 8-oxo-Gua. The genotoxic effects lie clearly above inflammatory and fibroblastic doses. The second important test result is that even with pure quartz fine dusts a very large spreading of the toxic effects including genotoxic thresholds exists; here a good agreement of the in-vitro- data with the in-vivo-results was demonstrated. Small admixtures of clay minerals drastically reduce the quartz-specific effects, which lead practically to an inertization of these dust samples in the subchronic attempt. The available data permit conclusi- ons over the large extent of the toxic potential. However, these statements must be extended and confirmed in the chronic attempt. The materialness crucial for the im- pact at humans is not located in the crystal lattice of the bulk (SiO2-Tretraeder) all toxic effects are linked with the surface of the lattice. The conformation of the surface is apparent not stable. The samples from special work sites (cristobalit as example of the high temperature modification as well as four Chinese tin mine types of dust) show in the vector model a qualitatively specific behavior opposite to pure quartz types of dust. A characteristic consists of the fact that cristobalit like also the tin mine types of dust already induce in low dosages a release of ROS in alveolar macropha- ges.

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Beyond that two of the tin mine types of dust cause a very high secretion of TNF, which is clearly higher than those of the reference quartz DQ12; the quartz contents of these mixed types of dust amount to 15 % and/or 12 %. Hereby it is indicated that in special types of mixed dust beside the quartz other materials in the mixture exist, which exert particular toxic effects.

For the classification of quartz fine dust the secondarily genotoxic effect character is important, since concerning this no stochastic risk model is to be derived. The practi- cal hygienic regulation should also consider that quartz species themselves exert far different effects. In the mixed types of dust both effective protecting agents can be contained as well as toxifying components. The special types of dust of the third group examined here (iii) play a meaningful role in certain epidemiological studies, which are consulted for the quantification of the risks associated with quartz fine dust.

Zusammenfassung

Die Einstufung von Quarzfeinstaub als kanzerogener Arbeitsstoff ist mit besonderen Problemen behaftet, die einerseits aus der Wirkungsweise und andererseits aus der Wirkungsmenge dieses Arbeitsstoffes resultieren. Aktuelle Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass Quarz als sekundär kanzerogener Stoff betrachtet werden kann. Dies bedeutet, dass die Partikel nicht am Genom proliferationskompetenter Zellen unmittelbar wirken. Die zweite Besonderheit ist die große Unterschiedlichkeit der medizinisch-biologischen Wirkung von Quarzfeinstaub sowohl in toxikologischen Untersuchungen wie auch in epidemiologischen Studien.

In dem Forschungsprojekt sollte in einem toxikologischen, subchronischen Versuch geprüft werden, in wie weit Quarzfeinstäube in Hinblick auf genotoxische Effekte Schwellenwerte aufweisen und damit sich die Hypothese der sekundären Genotoxi- zität bestätigt. Der vorliegende Untersuchungsansatz prüft einerseits Quarzreinstäu- be (i), zum weiteren Quarzfeinstäube mit geringen Beimengungen von Tonmineralien (Produktstäube der Firma Hoffmann Mineral) (ii) und schließlich besondere Fein- stäube kristalliner Kieselsäuren, von denen in epidemiologischen Untersuchungen anscheinend besondere Gefährdungen ausgehen (iii). Die beiden erstgenannten Gruppen wurden in vitro im Vektorenmodell und in vivo im subchronischen Versuch (90 Tage) getestet. Es zeigte sich, dass alle geprüften Proben Schwellenwerte für genotoxische Effekte im Hinblick auf die Bildung von 8-oxo-Gua aufweisen. Die ge- notoxischen Effekte liegen deutlich oberhalb entzündlicher und fibroblastischer Do- sen. Das zweite wichtige Versuchsergebnis ist, dass selbst bei Quarzreinstproben eine sehr große Spreizung der toxischen Effekte einschließlich genotoxischer Schwellen existiert; hier besteht eine gute Übereinstimmung der in-vitro-Daten mit den in-vivo-Ergebnissen. Kleine Beimengungen von Tonmineralien führen zu einer drastischen Reduzierung der quarzspezifischen Effekte, die praktisch zu einer Inerti- sierung dieser Staubproben im subchronischen Versuch führen. Die vorliegenden Daten erlauben Rückschlüsse über Wirkungsmöglichkeiten. Diese Aussagen müssen noch im chronischen Versuch erweitert werden.

Die für die Wirkungsweise am Menschen entscheidende Stofflichkeit ist nicht im Kristallgitter (SiO2-Tretraeder), sondern mit der Oberfläche des Gitters und damit in-

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herent an seine Störungen verküpft. Die Konformation der Oberfläche ist anscheinend nicht stabil.

Die Arbeitsplatzproben aus besonderen Expositionsverhältnissen (Cristobalit als Bei- spiel der Hochtemperaturmodifikation sowie vier chinesische Zinnminenstäube) zeigen im Vektorenmodell ein gegenüber den reinen Quarzstäuben qualitativ differentes Verhalten. Eine Besonderheit besteht darin, dass Cristobalit – wie auch die Zinnmi- nenstäube – bereits in niedrigen Dosierungen eine Freisetzung von ROS in Alveo- larmakrophagen induzieren; dies ist bei reinen Quarzproben nicht der Fall. Darüber hinaus bewirken zwei der Zinnminenstäube eine sehr hohe Sekretion von TNF, die deutlich höher ist als die des Referenzquarzes DQ12; die Quarzgehalte dieser Mischstäube betragen 15 % bzw. 12 %. Hiermit wird belegt, dass in besonderen Mischstäuben neben den Quarzen andere Stoffe im Gemisch existieren, die zu einer besonderen Toxifizierung führen.

Für die regulatorische Einstufung von Quarzfeinstaub ist der sekundär genotoxische Wirkungscharakter bedeutend, da hierüber kein stochastisches Risikomodell abzuleiten ist. Die praktische hygienische Regelung sollte auch berücksichtigen, dass Quarze selbst ein unterschiedliches Wirkungsmuster besitzen, und dass ggf. in den Mischstäuben sowohl inertisierende wie auch toxifizierende Komponenten enthalten sein können. Die hier untersuchten besonderen Stäube der dritten Gruppe (iii) spielen in bestimmten epidemiologischen Studien, die für die Quantifizierung der mit Quarzfeinstaub assoziierten Risiken herangezogen werden, eine besondere Rolle.

Einleitung

Die Einstufung von Quarzfeinstaub als kanzerogener Arbeitsstoff

Führender Grund für die Einstufung des Quarzfeinstaubes als kanzerogener Arbeits- stoff durch die Senatskommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft (GREIM

and BORM et al., 2001) ist eine erhöhte Rate an Bronchialkrebs bei Silikose-kranken Patienten, die in verschiedenen epidemiologischen Befunden belegt ist. Unterstützt wird diese Bewertung durch positive Experimente im Inhalationstest an Ratten in relativ niedriger Konzentration (MUHLE and KITTEL et al., 1995). Vorausgegangen war eine ähnliche Einschätzung des IARC 1996 (IARC 1997).

Weitere wichtige Informationen in den Begründungspapieren der DFG und des IARC sind:

↵ kein sicherer Nachweis einer erhöhten Tumorrate bei quarzexponierten Proban- den ohne röntgenologisch sichtbare silikotische Lungenerkrankung,

↵ keine erhöhte Tumorrate bei Patienten mit Anthrakopneumokoniose (identische BK-Ziffer für diese Patientengruppe in Deutschland),

↵ keine Kanzerogenität von Quarz für andere Versuchstiere (getestet: Maus, Hamster, Meerschweinchen).

Für die Entwicklung von konkreten Regelungen ist in einem weiteren Schritt die Fra- ge des objektiven Risikos, das sich mit dem Gegenstand (Objekt) der Regelung ver- knüpft, zu klären. Dieser Schritt von der Risikoidentifizierung zur Risikoquantifizie-

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rung (engl.: step from hazard identification to quantitative risk assessment) für Fein- stäube kristalliner Kieselsäuren ist aus mehreren Gründen besonders kritisch (MCDONALD, 2000). In der wissenschaftlichen Diskussion der Einstufung des Feinstaubes kristalliner Kieselsäuren (Quarz, Cristobalit) existieren kontroverse An- schauungen über den Wirkungscharakter und die Wirkungsart dieser Stoffgruppe.

Ein gleichförmiger Wirkungsansatz wird beispielsweise von STEENLAND et al. aus einer 10-Kohortenstudie (STEENLAND and MANNETJE et al., 2001) hergeleitet. Er stellt auch fest, dass die epidemiologischen Daten einen linearen Dosis-Wirkungsbezug begründen..

Die These einer breit gefächerten Wirkungscharakteristik von Quarz wird durch epidemiologische Erfahrungen und durch toxikologische Untersuchungen gestützt (DONALDSON and BORM, 1998; FUBINI, 1998). Auch die IARC grenzt seine Einstufung unter Berücksichtigung der Exposition des Menschen zunächst schon ein, indem die Exposition mit Quarzfeinstaub am Arbeitsplatz als human cancerogen eingestuft wird. Weiterhin wird zur Uneinheitlichkeit der Wirkungen festgestellt (IARC 1997): In making the overall evaluation, the Working Group noted that carcinogenicity in humans was not detected in all industrial circumstances studied. Carcinogenicity may be dependent on inherent characteristics of the crystalline silica or on external factors affecting its biological activity or distribution of its polymorphs.

Neben diesen Ungewissheiten der spezifischen Wirkungsmenge und der Wirkungs- art von verschiedenen Spezies kristalliner Kieselsäuren (Quarz, Cristobalit) sind auch Fragen der Dosis-Wirkungs-Beziehung (linear vs. nichtlinear) und besonders der Wirkungsstärke im unteren Dosisbereich in der Diskussion.

Für die regulatorische Ebene müssen folgende Punkte geklärt sein

1. Wirkungen im Bereich einer niedrigen Belastung in Bezug auf den Zusammen- hang des Potenzials der kanzerogenen Wirkung mit der fibrotischen Erkrankung und die Möglichkeit des Schwellenwertes einer kanzerogenen Wirkung

2. Unterschiedliche Wirkungsstärken verschiedener Quarzfeinstaubspezies

3. Unterschiedliche Wirkungsarten verschiedener Spezies der Feinstäube kristalli- ner Kieselsäuren

In diesem Zusammenhang ist es erwähnenswert, dass mehrere epidemiologische Arbeiten mit einer besonders niedrigen Wirkungsschätzung in Verbindung mit mehreren Dosis-Wirkungspunkten auf die Diatomeenpopulation von CHECKOWAY mit hoher Cristobalitbelastung basieren. Die Autoren der epidemiologischen Untersuchungen zeigen diese Probleme selbst auf und betonen die Notwendigkeit weiterer toxikologi- scher und epidemiologischer Untersuchungen zur Abklärung der besonderen Ge- fährdung an Arbeitsplätzen mit Hochtemperaturmodifikation von kristalliner Kiesel- säure (CHECKOWAY and HUGHES et al., 1999; CHECKOWAY und FRANZBLAU, 2000).

Andere epidemiologische Studien zur Frage der Wirkungsstärke mit mehreren Dosis- Wirkungspunkten sind durch Confounder wie Arsen belastet (COCCO, 2001; COCCO

and RICE et al., 2001; HAZELTON and LUEBECK et al., 2001).

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Rationale des toxikologischen Ansatzes

Tiermodell und Entzündung

Toxikologische Untersuchungen im Standardmodell der Ratte geben Hinweise für kanzerogene Effekte von Hartstäuben; die Staubexposition erfolgt inhalativ oder durch eine intratracheale Instillation.

Fast alle Staubarten verursachen dosisabhängig entzündliche Erscheinungen in der Lunge. Hierzu werden gerechnet das Einströmen von Entzündungszellen, die Ab- nahme der Dichtigkeit der alveolo-kapillären Membran und die gesteigerte Sekretion von Entzündungsmediatoren. Vielfach besteht ein Zusammenhang zwischen dem Grad entzündlicher Erscheinungen unter der Staubexposition und der Tumorhäufig- keit; überdies wurde ein Zusammenhang genotoxischer Effekte wie Mutationen am HPRT-Gen sowie der Bildung von DNS-Addukten mit der Entzündung unter der Staubexposition festgestellt. Somit nimmt die Entzündung eine Schlüsselrolle für die Genotoxizität von Hartstäuben ein. Ein wichtiger Faktor der entzündlichen Wirkung der Hartstäube ist die Größe der Stauboberfläche; je größer die spezifische Oberflä- che desto stärker ist die Entzündung und die Genotoxizität bzw. Tumorgenität (DRISCOLL, 1996; DRISCOLL and DEYO et al., 1997).

Die Dosisfrage

Toxikologische Untersuchungen sind in der Regel angelegt, die Art der Effekte bzw.

schädlichen Wirkungen erkennbar zu machen. Als Endpunkte der potentiell schädli- chen Staubwirkungen werden betrachtet die Fibrose (z.B. Silikose oder Asbestose) und/oder die kanzerogenen Effekte. Im Prozess der hygienischen Bewertung wird diese Stufe als hazard identification eingeordnet. Für eine eindeutige Bewertung sollten die Endpunkte statistisch sicher aus den versuchsbedingten Unschärfen her- ausragen, was in der Regel zu relativ hohen Dosierungen führt; im Rattenmodell wurden Dosen von 3-5 mg/Lunge (z.T. auch 20-50 mg) appliziert. Wir hatten mit methodischen Verbesserungen beginnende Bindegewebsvermehrungen der Lunge unter Quarz-Staubbelastungen in einem Dosisbereich von 0.05 mg/Lunge nachge- wiesen (MALKUSCH and REHN et al., 1995), die Diskrepanz der Dosen beträgt somit ein bis zwei Größenordnungen. Bekanntlich ist die Trennschärfe für unterschiedliche Wirkungen im Hochdosisbereich eher geringer; zudem belasten unspezifische Ne- beneffekte, die mit der eigentlich zu untersuchenden kritischen Wirkung nichts ge- mein haben, das Ergebnisbild. Im Rahmen hygienisch-toxischer Fragestellungen im Sinne eines quantitativen Risk Assessment und des NOAEL sind Untersuchungen in diesem unteren Dosisbereich besonders diskriminant. So lassen sich verschiedene Spezies kristalliner Kieselsäure hinsichtlich der Frage wesentlicher Unterschiede der Aggressivität vergleichend untersuchen.

Verfeinerte Untersuchungsverfahren

Unsere Arbeitsgruppe hat mit der Entwicklung eines immunhistochemischen Nach- weises von 8-oxo-dG einen wichtigen Baustein in den Parametern der Untersuchun- gen entwickelt (SEILER and KIRSTEIN et al., 1993; NEHLS and SEILER et al., 1997).

Durch die quantitative Bestimmung der oxidativen DNA-Addukte in einzelnen Zell- kernen des Lungengewebe lässt sich hochsensitiv der oxidative DNA-Schaden als

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eine wichtige Vorstufe der Tumorentwicklung quantifizieren. Über die Bestimmung im Einzelzellniveau ist insbesondere eine Möglichkeit gegeben, diese Schäden in proli- ferationskompetenten Zellen, wie z.B. Pneumozyten Typ II und Clarazellen, selektiv zu erfassen (BRUCH and SEILER et al., 2000; SEILER and REHN et al., 2001; SEILER

and REHN et al., 2001). Weitere Parameter des Essener Untersuchungsansatzes umfassen die Reaktion der Pneumozyten Typ II, die nach heutigen experimentellen und klinischen Daten als eine Schlüsselzelle für den Beginn interstitiell-fibrotischer Lungenerkrankungen und anderer chronischer Schäden der Lunge betrachtet wird.

Das Konzept der Bewertung der persistenten DNA-Addukte in potentiellen Zielzellen als einen kritischen Schritt im pathogenetischen Pfad zum Tumor ist bereits früher dargelegt worden. Die Menge der persistenten DNA-Addukte spiegelt die Summe aller aktivierenden und kompensatorischen Schritte (Radikalscavenging und DNA- Reparatur) an einer kritischen Stelle im pathogenetischen Pfad zum Tumor wider; wir fassen daher diese Addukte als einen intermediären Endpunkt auf (BRUCH and SEILER et al., 2001).

Toxikologische Testungen in vitro – das Vektorenmodell –

Untersuchungen der Schädlichkeit von Stäuben im Zellmodell wurden seit langem durchgeführt; hierbei benutzte man häufig lavagierte Alveolarmakrophagen. Als Krite- rien der Toxizität dienten Bestimmungen des Metabolismus der Zellen (O2-Ver- brauch, TTC-Test u.a.) oder Marker der Vitalität (LDH, Vitalfärbungen). Auch andere Zellarten werden in in-vitro-Testen benutzt wie Epithelzellen ex vivo oder immortali- sierte Zellen. Das Vektorenmodell stützt sich ab auf die Prüfung der Alveolar- makrophagen, da diese Zellart als primäre Zielzelle der Staubwirkung in der Lunge betrachtet wird; sie kann durch ein komplexes Antwortmuster spezifisch nachfolgen- de pathologische Lungenreaktionen in Gang setzen. Das Vektorenmodell bewertet unterschiedliche spezifische und unspezifische Reaktionen (LDH, TNF alpha, ROS etc.) der Alveolarmakrophagen nach Staubbelastungen (REHN andREHN et al., 1999).

Es hat sich gezeigt, dass diese Reaktionen je nach Staubart in einem unterschiedlichen Muster ausgelöst werden, so dass man einzelne Reaktionen als Vektoren auf- fassen kann (REHN and SEILER et al., 2001).

Ungleichheit der Wirkungsstärke und Wirkungsart verschiedener Spezies von kristallinem SiO

₂

-Feinstaub

Wissenschaftlich-toxikologische Studien zur Unterstützung der regulatorischen Ebe- ne sind aktuell folgenden Themen zugewandt:

1. Gleiche oder ungleiche medizinische Wirkungen von kristallinem SiO2-Feinstaub (Gegenstand der Einstufung) nach der Speciation von Quarz

2. Primäre und sekundäre Genotoxizität 3. Schwellwert für kanzerogene Effekte

4. Weitere Fragen sind: Fibrogenität, Voraussetzung für Kanzerogenität und/oder Dosismarker (I). Zielzellen der Quarzwirkung in der Lunge (ii). Gleiche oder ungleiche Dosis-Wirkungs-Beziehungen für Fibrogenität und Kanzerogenität (iii)

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Die experimentellen Untersuchungen sollen prüfen, ob für verschiedene Spezies kristalliner Kieselsäuren verschiedene biologische Effekte, insbesondere der Genotoxi- zität (i) existieren. Weiterhin war zu überprüfen, ob in einem unteren Dosisbereich mit noch klaren pathogenen Effekten für Inflammation ein Schwellwert (ii) der Genotoxi- zität existiert. Schließlich interessiert die Frage, ob für kristalline Kieselsäuren neben Unterschieden der Wirkungsstärke auch solche der Wirkungsart (iii) existieren.

Der vorliegende Bericht umfasst Teilergebnisse von Untersuchungen, die im Auftrag der Quarzindustrie (Quarzwerke Frechen (QWF); Hoffmann Mineral GmbH, Neu- burg/Donau) durchgeführt wurden; die Untersuchungen der QWF sind Bestandteil eines größeren Untersuchungsvorhabens, in dem weitere Forschungen zur in-vitro- Schädlichkeit (Arbeitsgruppe BORM, im selben Band) und Untersuchungen zur che- misch-physikalischen Charakterisierung der verschiedenen Proben eingeschlossen sind (FUBINI, im selben Band). Andere Staubproben wurden vom BIA sowie aus der Kooperation mit dem Tongji Medical Department, Wuhan PR China, bereitgestellt.

Material und Methoden

Insgesamt wurden Staubproben aus drei Bereichen für die oben genannten Frage- stellungen in die Untersuchungen einbezogen:

÷ Reinstquarzproben; Quarzwerke Frechen

÷ Quarzproben aus bestimmten Produkten für gezielte industrielle Anwendungen (z.B. Füllstoffe); Fa. Hoffmann Mineral

÷ Kristalline Kieselsäuren aus besonderen industriellen Umständen in gut untersuchten epidemiologischen Studien: Cristobalit, Stäube aus chinesischen Zinn- minen.

Für alle toxikologischen Untersuchungen wurden Leerkontrollen sowie positive Staubkontrollen (Quarz DQ12) und Inertstaubkontollen (Korund) mitgeführt.

Staubproben der Quarzwerke Frechen

Die Quarzindustrie stellte insgesamt 32 unterschiedliche Proben aus verschiedenen Lagerstätten zusammen, die durch Aufmahlung und Sichtung auf eine einheitliche Korngröße präpariert wurden (Alpine Zick-Zack-Sichter MZR 100). Der Quarzgehalt der Quarzfeinstaubproben lag bei 99 %. Alle Proben wurden im Vektorenmodell hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität auf Alveolarmakrophagen in vitro untersucht.

In einem Selektionsverfahren wurden repräsentative Proben für die in-vivo-Testung ausgesucht; die Auswahl erfolgte anhand der Ergebnisse des Vektorenmodells; sie wurde unabhängig durch mehrere externe Experten (Borm, Donaldson, Fubini) aus den geblindeten Probenergebnissen vorgenommen. Jeweils zwei Proben wurden für den Bereich einer gering-toxischen und einer hoch-toxischen biologischen Aktivität selektiert. Diese vier Staubproben wurden im subchronischen Tierversuch einge- setzt.

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Proben der Fa. Hoffmann Mineral

Die Fa. Hoffmann Mineral stellte zwei quarzhaltige Proben zur Verfügung, die als Produkte im Handel sind; alle Proben hatten eine Teilchengröße > 5µm. Die Zusam- mensetzung ist in der Tabelle III.1 aufgeführt.

Tab. III.1 Zusammensetzung der untersuchten Proben

Produktbezeichnung Quarzanteil Kaolinit sonstiges Korngröße

Sillitin 79% 15% 6% < 5µm

AktiSil

silanisiertes Sillitin 79% 15% 6% < 5µm

Sonderproben von Arbeitsplätzen mit einem spezifischen Risiko

Cristobalit wurde vom BIA St. Augustin zur Verfügung gestellt. Die Herstellung erfolgte durch Brennen eines reinen Quarzes; die Korngröße lag < 5µm.

Tab. III.2 Die Zusammensetzung der vier chinesischen Zinnminenstäube Elements Changpo (%) Bali (%) Tongken (%) Limu (%)

Cryst. Silica 43.60 10.40 15.10 12.00

Aluminum 2.80 0.51 0.58 2.24

Iron 2.02 3.16 6.72 3.73

Arsenic 0.40 0.26 0.72 0.05

Calcium 9.62 38.87 19.22 17.83

Zinc 0.33 1.55 2.39 0.12

Tin 0.04 0.02 0.06 0.06

Die Zinnminenstäube waren ursprünglich als Sedimentstäube gesammelt, von denen die Feinstaubfraktionen mit dem Präzisionskaskadenimpaktor der Firma Retsch ab- getrennt wurden. Die Bestimmung des Quarzgehaltes erfolgte mit der Röntgen- diffraktometrie (DMT, Essen). Die Kenndaten dieser Staubproben sind in Tabelle III.2 aufgeführt. Toxikologische Daten liegen zum Berichtszeitpunkt über die Proben des dritten Satzes nur aus in-vitro-Untersuchungen mit dem Vektorenmodell vor.

(24)

Toxikologische Untersuchungen

In-vitro-Untersuchungen

Einzelheiten des Vektorenmodells sind an anderer Stelle ausführlich beschrieben.

Grundprinzip ist, dass die Staubproben an Alveolarmakrophagen in vitro im multi- dose-Regime überprüft werden, da unterschiedliche Stäube sowohl eine unterschiedliche Lage wie auch Steilheit des Dosis-Wirkungs-Bezuges für einzelne Vekto- ren besitzen. Zusätzlich zeigt sich, dass bestimmte Vektoren, so z.B. die Sekretion von ROS ggf. schwellwertartig über die Dosis sezerniert werden. Als Parameter werden ausgewiesen: Glucuronidase (i), Zellschädlichkeit (ZS), Stoffwechselaktivität (LPS ausgelöstes ROS) (ii), TNF alpha bestimmt als biologisch aktives TNF (iii), durch Staub ausgelöste ROS-Freisetzung (iv). Die Darstellung erfolgt im Vektordia- gramm als Wirkungsraute. Alle in-vitro-Teste wurden im multi-dose-Ansatz durchge- führt mit Dosen von 10, 30, 60, 120, 240 mg/10⁶ Zellen.

Tierversuche Expositionen

Weibliche Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von ca. 200 g (10 Tiere pro Expo- sition und Zeitpunkt) wurden mittels intratrachealer Instillation von Quarz (0.15, 0.3, 0.6, 1.2, 2.4 mg/Tier) in physiologischer Kochsalzlösung (0,5 ml) exponiert; Kontroll- tiere wurden nur mit Salzlösung instilliert oder blieben unbehandelt (Basisversuche mit DQ12). Die Gruppen der Reinstquarzproben der Quarzindustrie erhielten 0.6, 1.2 und 2.4 mg/Tier. Die Tiere der Gruppe Neuburger Kieselerden wurden mit 0.3, 1.5 und 7.5 mg/Tier belastet. Die Tiere wurden 3, 21 und 90 Tage nach der Behandlung getötet. Jeweils fünf Tiere wurden ausgeblutet und die Lungen nach Eröffnung des Brustraumes über die Trachea mit physiologischer Kochsalzlösung gespült. In der zurückgewonnenen Spülflüssigkeit (BAL) wurden folgende Untersuchungen durch- geführt: Bestimmung des Differenzialzellbildes, des Protein-, TNF-alpha- und Fibro- nektingehaltes sowie die Analyse der Surfactantphospholipide. Bei den verbliebenen fünf Tieren wurden die Lungen entnommen und in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Von diesem Material wurden Gefriergewebeschnitte angefertigt und daran die quantitative Bestimmung von 8-Oxoguanin, die Menge p53 und p53 mut positiver Zellen sowie die Proliferationsrate bestimmt.

8-Oxoguanin

Die Gewebeschnitte wurden 15 min in Methanol fixiert und in 2 x SSC (300 mM Nat- riumchlorid, 30 mM Natriumcitrat, pH 7,2) rehydriert. Nach Behandlung mit RNAsen wurde die zelluläre DNS durch Inkubation mit Proteinase K denaturiert. Zur Reduzie- rung unspezifischer Antikörperbindung wurden die Proben mit PBS/20 % BSA für 20 min vorinkubiert. Danach wurden sie mit einem Kaninchen-anti-8-Oxoguanin- Antikörper (1 µg/ml PBS/1 % BSA) (Lit) für 16 h bei 4°C behandelt. Nach dem Aus- waschen nicht gebundener Antikörper wurden die Proben mit einem TRITC-gekoppelten Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (2 µg/ml PBS/1 % BSA, Dianova, Hamburg) für 45 min bei 37 °C exponiert, die Kern-DNS mit DAPI (0,3 µL in PBS, 10 min) ge- färbt und danach in PBS/Glycerol eingebettet.

(25)

Bildanalyse

Die Fluoreszenzbilder wurden mit einer gekühlten CCD-Kamera (Hammamatsu, Hammamatsu City, Japan) und einem Multiparameter-Bildanalyseprogramm (Ahrens ACAS, Bargteheide), wie beschrieben (SEILER and KIRSTEIN et al., 1993), durchge- führt. Jede Messung repräsentiert den Mittelwert der Fluoreszenzwerte von 100 einzelnen Zellen.

Proliferation

Die Fraktion der proliferierenden Lungenzellen wurde durch den immunhistochemischen Nachweis von Ki67 bestimmt. Die Gewebeschnitte wurden hierzu mit Ethanol fixiert (30 min), mit PBS rehydriert und 2 x 5 min in einem 650 W Mikrowellengerät behandelt (in Citratpuffer, pH 6,0). Die Proben wurden danach auf Raumtemperatur abgekühlt und mit A. dest sowie PBS gewaschen. Nach einer Vorinkubation mit PBS/1 % BSA (30 min, 37°C) wurden die Proben mit einem Kaninchen-anti-Ki67- Antikörper (20 µg/ml PBS/1 % BSA, 2 h, RT, Dianova, Hamburg) inkubiert. Nach dem Auswaschen nicht gebundener Antikörper wurden die Proben mit einem TRITC- gekoppelten anti-Kaninchen-Antikörper (2 µg/ml PBS/1 % BSA, Dianova, Hamburg) für 45 min bei 37 °C exponiert, die Kern-DNS mit DAPI (0,3 µL in PBS, 10 min) ge- färbt und danach in PBS/Glycerol eingebettet. Zur Bestimmung der Menge der positiven Zellen wurden mindestens 300 Zellen pro Gewebeschnitt in vier bis sechs Mik- roskopgesichtsfeldern kontrolliert.

p53/p53 mut – Protein

Die Gewebeschnitte wurden mit Ethanol fixiert (30 min), mit PBS rehydriert und 2 x 5 min in einem 650 W Mikrowellengerät behandelt (in Citratpuffer, pH 6,0). Die Proben wurden danach auf Raumtemperatur abgekühlt und mit A. dest sowie PBS gewaschen. Nach einer Vorinkubation mit PBS/1 % BSA (30 min, 37°C) wurden die Proben mit den anti-p53-Antikörpern (1 h, 37°C) inkubiert. Nach dem Auswaschen nicht gebundener Antikörper wurden die Proben mit dem entsprechenden zweiten Antikörper für 45 min bei 37 °C exponiert, die Kern-DNS mit DAPI (0,3 µL in PBS, 10 min) gefärbt und danach in PBS/Glycerol eingebettet. Zur Bestimmung der Menge der positiven Zellen wurden mindestens 300 Zellen pro Gewebeschnitt in vier bis sechs Mikroskopgesichtsfeldern kontrolliert.

Die verwendeten Antikörper:

(1) p53: Pan (Wildtyp und Mutanten-spezifisch) Schaf anti p53 (Roche, Mannheim).

Verdünnung: 1:40 in PBS/1 % BSA. Zweiter Antikörper: Kaninchen anti Schaf TRITC gekoppelt (Dianova, Hamburg). Verdünnung: 2 µg/ml PBS/ 1% BSA.

(2) p53 mut: Ab-1 Mutanten spezifischer (Epitop aa 212-217) Maus monoklonaler Antikörper (Neomarkers, Union City, USA). Verdünnung: 1:250 in PBS/ 1 % BSA. Zweiter Antikörper: Ziege anti Maus FITC-Konjugat (Dianova, Hamburg).

Verdünnung: 2 µg/ml PBS/1 % BSA.

(26)

Entzündungsmarker

Die in der BAL enthaltenen Zellen wurden isoliert, in Hanks-Lösung resuspendiert, gezählt und ein Differenzialzellbild erstellt. Die Proteinkonzentration der BAL- Überstände wurde mit der Methode von Lowry bestimmt. Die Aktivität von TNF-alpha in der BAL-Flüssigkeit (BALF) wurde durch den Zelllyse-Test nach AGGARWAL

(AGGARWAL and KOHR et al., 1985) bestimmt. Die Analyse des Surfactant- Phospholipides Phosphatidylcholin in der BALF wurde wie bei BRUCH (BRUCH and GONO et al., 1994) beschrieben durchgeführt.

In der aktuellen Veröffentlichung werden nur die Daten des 90d-Zeitpunktes dargestellt.

Die statistische Analyse der Daten erfolgte mit nonparametrischen Testen (MAC-OS;

Statview2), die Darstellung benützt den Box-Plot (Median sowie 25 bzw. 75 % der Daten als Grenzen der Box).

Ergebnisse

Die Ergebnisse von abgeschlossenen Auswertungen größerer Untersuchungsreihen an den drei Probengruppen mit dem wichtigen Versuchszeitpunkt 90 Tage post- expositionem (nur für Gruppe 1 und 2) sowie die Resultate der in-vitro-Teste im Vektorenmodell sind nachstehend aufgesetzt.

Basisergebnisse mit dem Referenzstaub Quarz DQ12

In der Abbildung III.1 sind die Ergebnisse der Grunduntersuchungen am Referenz- quarz DQ12 zusammengefasst; die Daten sind in einer Veröffentlichung bereits vorgestellt worden (SEILER and REHN et al., 2001).

In der Abbildung III.1 ist zu erkennen, dass bei der niedrigsten Dosis von 0.15 mg Quarz-DQ12/Lunge deutliche entzündliche und fibroblastische Effekte (li und re oben) festzustellen sind; die Ratio PG/PI < 2 ist pathologisch. Genotoxizität tritt erst bei Dosen ≥ 0.6 mg für 8-oxoGua und ≥ 1.2 mg für p 53 mutant auf. Die lowest adverse effect levels (LOAEL) sind mit einer blauen Box eingegrenzt. Somit treten genotoxische Effekte oberhalb entzündlicher und fibroblastischer Dosen auf. Über zwei Dosenstufen ist für Quarz DQ12 kein Effekt sichtbar. Die niedrigen subnormalen Werte für 8-oxoGua werden als Effekte einer stimulierten Reparatur oder anderer Ausgleichsmechanismen aufgefasst (SEILER and REHN et al., 2001).

(27)

2,4 1,8

1,2 0,6

0,0 0 25 50 75 100

Quartz DQ12 (mg / Lung)

D NA-d amage

2,4 1,8

1,2 0,6

0,0 -0,5

1,0 2,5

4,0 Q u a rt z DQ 12

Mu tation

8-0x0Gua, rel. FU p53 mutant positive cells, %

2,4 1,8

1,2 0,6

0,0 -5 10 25 40 55

Percentage of Neutrophils in BALF

Inflammation

2,4 1,8

1,2 0,6

0,0 0 1 2 3

Ratio PG / PI in BALF

Fibrosis

Physiog.Saline (control)

Abb. III.1 Ergebnisse einer Quarzdosisreihe it 90 d von 0.15, 0.3, 0.6, 1.2, 2.4 mg/Rattenlunge für die Parameter von Entzündung, DNA-Schaden (Addukt), und Mutation (p53 Mutante). Mit einem Rechteck markiert ist der Bereich des lowest adverse effect levels (LOAEL). LOAEL für DNA- Schäden treten erst bei fünf- bis zehnmal und höheren Dosen auf ge- genüber dem LOAEL für Entzündung und Fibrose. DNA-Schäden Schwellwert-assoziiert; kein direkt genotoxischer Effekt. Daten veröf- fentlicht (SEILER and REHN et al., 2001).

Reinstquarzstaubproben der Quarzwerke Frechen

Aufbauend auf den Grundergebnissen mit dem Standardquarz DQ12 wurden unterschiedliche Reinstquarzproben (insgesamt 32) aus verschiedenen Lagerstätten im Vektorenmodell untersucht. Im Prescreening selektierten drei Wissenschaftler (Borm, Donaldson, Bruch) unabhängig voneinander anhand geblindeter Ergebnisse über- einstimmend zwei Proben mit niedriger und zwei Proben mit hoher Aktivität.

(28)

-100

-8 0 -7 0 -6 0 -3 0 -2 0 20 40 50 60 70 90

ZS 100 %

TNF 30 units Glucuronidase 200

l

ROS 250 l

Quarz DQ12 Korund

2 /1 C (S1 )

-10 0 -90 -80 -60 -50 -40 -10 0 10 40 50 80 90

ZS 100 %

TNF 30 units

Glucuronidase 200 nmol

ROS 250 nmol Quarz DQ12 Korund

3 /1 C (S 2 )

-100

-80 -30 20 40 50 60 70 90

ZS 100 %

TNF 30 units

ROS 250 nmol 5 / 1 C (S 3 )

-100 -90 -80 -60 -50 -40 -10 0 10 40 50 80 90

ZS 100 %

TNF 30 units

ROS 200 nmol 1 1/ 1 C ( S 4 )

Abb. III.2 Vier Reinstquarzproben im Vektormodell, Dosis 120 µg/10⁶ Zellen li oben und unten: Proben mit hoher Aktivität. Re zwei Proben mit niedriger Aktivität. Die Unterschiede sind vor allem durch die unterschiedliche Aktivität der Induktion von TNF-alpha bedingt.

Proben 2/1C und 3/1C repräsentieren Stäube einer hohen biologischen Aktivität, 5/1C und 11/1C einer niedrigen Aktivität. Bei diesen Reinststaubquarzen sind die Unterschiede vor allem durch den Vektor TNF-alpha und durch den Parameter der Zellschädigung charakterisiert. Die Resultate sind in Abb. III.2 festgehalten.

Die vier Proben wurden im Tierversuch im multi-dose- und multi-time-Regime in Do- sen von 0.6, 1.2 und 2.4 mg/Lunge über 3, 21 und 90d Versuch getestet. Vorgestellt werden die Daten des 90d–Versuches für die Parameter-Anzahl Neutrophiler in der BAL (Entzündungsparameter) (Abb. III.3), Ratio PI/PG in der BAL (Fibroseparame- ter) (Abb. III.4) und 8-OxoGua in den Lungenzellen (Genotoxizität) (Abb. III.5). Die Abstufung der Proben in zwei Vertreter einer hohen und zwei Vertreter einer niedrigen Aktivität in vitro lässt sich in den drei Parametern der in-vivo-Untersuchungen wieder finden. In diesem Grundmuster scheint die Probe 2/1C in dem Parameter Entzündungszellen sogar den Referenzstaub DQ12 deutlich zu überragen. In den anderen Parametern lässt sich diese Eigenheit auch für die Genotoxizität andeu- tungsweise wieder finden. Weiter fällt auf, dass die Probe 11/1C sehr niedrige Werte genotoxischer Aktivität besitzt.

1 1/1 C (S4) 5/1 C (S 3)

Korund Korund Quarz DQ12

Quarz DQ12

(29)

50

10

0 20 30 40

DQ1 2 2 / 1C (S1 ) 3/ 1C (S2 ) 5/ 1 C (S3 ) 1 1/ 1 C (S4 ) Kont r

0.6 1.2 2.4 0.6 1.2 2.4 0.6 1.2 2.4 0.6 1.2 2.4 1.2

Anzahl der Neutrophilen in der BALF, x 10⁶

Abb. III.3 Entzündungszellen in der BAL 90d nach it von vier Proben Reinstquarz.

0 ,5 1 1,5 2 2,5 3

0.6 1.2 2.4 0.6 1.2 2.4 0.6 1.2 2.4 0.6 1.2 2.4 Kontr. 1.2

DQ12 2/1C (S1) 3/1C (S2) 5/1C (S3) 11/1C (S4) Ratio Phosphatidyl-Inositol/-Glycerin PI/PG

Abb. III.4 Fibrotische Effekte von vier Reinstquarzproben, bestimmt über PI/PG.

Werte über 1 sind pathologisch.

10⁶

5/ 1C (S3) 11/ 1C (S4)

5/1C (S3) 11/1C (S4)

(30)

5 10 15 20 25 30 35 40

Kontr. DQ12 2/1C (S1) 5/1C (S3) 11/1C (S4)

*

3/1C (S2) 8-Oxoguaningehalt der DNS, rel. FE.

0.6 1.2 2.4 0.6 1.2 2.4 0.6 1.2 2.4 0.6 1.2 2.4 1.2

Abb. III.5 Genotoxische Effekte in der Lunge bestimmt über das DNA-Addukt 8- oxoGua. Graue Schattierung hinterlegt den Normalbereich. Proben 2/1C und geringer 3/1C sind stärker genotoxisch als die Proben 5/1C und 11/1C.

Quarzhaltige Produktstäube der Fa. Hoffmann Mineral

Die Ergebnisse der Testung im Vektorenmodell in vitro sind in Abbildung III.6 festgehalten. Hier zeigt sich, dass die Proben bei einer hohen Dosierung von 120 µg/10⁶ Zellen praktisch keine Schädlichkeit auf Alveolarmakrophagen ausüben. Analog fal- len die Ergebnisse der in-vivo-Untersuchungen aus. Hier sind nur die Daten der ge- notoxischen Untersuchungen ausgeführt. Es zeigt sich sogar bis in den Dosisbereich von 7.5 mg/Lunge keine signifikant erhöhte Genotoxizität der Prüfsubstanzen. Die Daten anderer Parameter und Prüfzeiten werden getrennt publiziert.

5/1C (S3) 11/1C (S4)

(31)

0 20

Gluc 200 nmol

ZS 100 %

TNF 30 units aktisil VM56

Korund Quarz DQ12

Sillitin V 85

TNF 30 units Gluc 200 nmol

ZS 100 %

Abb. III.6 Biologische Aktivität im Vektormodell von zwei Neuburger Kieselerden 120 µg/10⁶ Zellen mit Quarzanteilen von 79 %. Sehr geringe Aktivität im Vergleich zu DQ12.

0 2 4 6 8 10 12 14

1.5 0.3 1.5 7.5 0.3 1.5 7.5 8-Oxoguanin / DNS

Kontr. _{Quarz DQ12} aktiSil VM56 Sillitin V85

Abb. III.7 Genotoxizität von zwei Neuburger Kieselerden (Quarzgehalt 79 %) in der Rattenlunge 90d nach it Applikation. Praktisch keine Genotoxizität bis in den Dosisbereich 7.5 mg/Lunge.

Korund Quarz DQ12 ROS 150 nmol

ROS 150 nmol