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Circulardichroismusuntersuchungen des Thyreotropin-Releasinghormons (T R H )
Circular Dichroism Investigations of TRH
Wo l f g a n g Vo e l t e r, Ka r l Ze c h, Pe t e r Gö b e l, Os k a r Os t e r u n d An t o n i o At t a n a s io
C hem isches I n s titu t der U n iv ersitä t Tübingen
(Z. Naturforsch. 30 b, 142-143 [1975]; eingegangen am 15. September 1973)
Circular D ichroism , R eleasing H orm ones, P ep tid es
Im Zusammenhang mit Untersuchungen zur Struktur13 und Wirkungsweise4 der kürzlich aufge
klärten5-6 Hypothalamus-Releasinghormone haben wir Circulardichroismus(CD)-Spektren des Thyreo
tropin-Releasinghormons (TRH) vermessen, da mit der Methode des CD konformative und konfi
gurative Änderungen optisch aktiver Moleküle nachweisbar sind.
TRH wird durch Kuppeln der Aminosäurederi
vate Benzyloxycarbonyl- (4.4'-dimethoxybenzhy-
d r y l) - L - g lu t a m in , L - H is t id in - m e t h y le s t e r und l-
Prolinamid mit N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid dar
g e s t e l l t 3. Die Primärstruktur von TRH ist Pyr-His- Pro-NH2.
Abb. 1 zeigt CD-Spektren von TRH bei verschie
denen pH-Werten. Auffallend ist, daß das Peptid
hormon bei pH-Werten > 5 einen intensiven positiven Cottoneffekt zwischen 214 und 220 nm ([0] « 4000-7100 und einen schwächeren negativen bei 230 bis 240 nm ([0] « -700 bis -1000), in sauren Lösungen dagegen negative Cottoneffekte bei 213 nm und zwischen 230 und 240 nm zeigt.
Sonderdruckanforderungen an Prof. Dr. W . Vo e l t e r, Chem isches In s titu t, D -7400 Tübingen, A u f der M orgenstelle.
Das CD-Spektrum von TRH in wäßriger und alkalischer Lösung entspricht im wesentlichen dem von Aminosäuren, deren Seitenketten keine meß
baren chromophoren Gruppen enthalten (l-Alanin, L-Asparagin etc.): Alle l-Aminosäuren dieser Art zeigen je nach dem Protonierungsgrad im Bereich 200 bis 216 nm positive Cottoneffekte8.9, die durch einen n -» jr*-Elektronen-Übergang der Carboxyl- gruppe verursacht werden.
Um die pH-Abhängigkeit der TRH-CD-Spektren zu deuten, haben wir von L-Histidin und L-Alanyl- L-Prolin als Modelle Circulardichroismusspektren gemessen. In Abb. 2 sind die Circulardichroismus
spektren von L-Histidin bei pH 1,3 und 11,1 aufge.
nommen. Wie Abb. 2 zeigt, verursacht der benach
barte Imidazolrest eine Erhöhung der Rotatorstärke und eine bathochrome Verschiebung des durch die Carboxylgruppe verursachten Cottoneffektes (Amax 215-220 nm; [0] = 5000-7000)8>9.
190 200 210 220 230 240 250
A [n m ]---
A bb. 2. C irculardichroism usspektren v o n L-H istidin ( -0-0-0- p H 1 , 3 0 ; --- p H 11,10).
Um den Beitrag des Prolinrestes zu den Cotton
effekten im Circulardichroismusspektrum des TRH zu studieren, haben wir L-Alanyl-L-prolin syntheti
siert und bei pH 0,78, 8,94 und in Methanol ge
messen (vgl. Abb. 3). Im Gegensatz zu Aminosäuren
200 210 220 230 240 250 260
A [n m ] ----
A bb. 3. C irculardichroism usspektren v o n L-Alanyl-L- prolin (---p H 0 ,7 8 ; --- pH 8 ,9 4 ;--- M etha
nol).
- H20 PH = 0,78 - H20 PH = 8.94 - Methanol
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mit einer Alkanseitenkette zeigt das CD-Spektrum dieses Dipeptids in wäßriger Lösung und in Methanol zwischen 210 und 220 nm eine intensive negative CottonefFektbande, die sich im stark sauren PH- Bereich nach tiefen Wellenlängen verschiebt; gleich
zeitig erhöht sich die Rotatorstärke dieser CD- Bande. Diese starke pH-Abhängigkeit dürfte beim L-Alanyl-L-prolin unter anderem auch mit der Änderung des cis-fraws-Isomeriegleichgewichtes Zu
sammenhängen11. So haben wir mit 13C-Kernreso- nanz festgestellt, daß Ala-Pro bei pH 9 zu 50% als
cis- und zu 50% als Jra/is-Isomeres vor liegt. Bei pH 1-1,5 ist jedoch zu 100% das fraws-Isomere existent.
Ebenso wie beim L-Alanyl-L-prolin konnten wir auch beim TRH3 durch 13C-Resonanz nachweisen, daß dieses Molekül in Wasser zu 90% als trans und 10% als ci<s-Isomeres vorliegt (vgl. Abb. 4). Die frappierenden Unterschiede der CD-Spektren von TRH, in Wasser bzw. bei pH 1 gemessen, ließen sich nach den oben diskutierten Befunden dadurch er
klären, daß in wäßriger Lösung die Intensität des Prolin-Peptid-Bindungs-n ->7r*-Cottoneffektes we
sentlich kleiner ist als die Intensitäten aller anderen n->7r*-Cottoneffekte (Peptidbindung -f Säure
amidgruppe). Gerade umgekehrte Intensitätsver
hältnisse der Cottoneffekte müssen durch Protonie
rung des TRH erreicht werden, so daß bei pH 1 ein CD-Spektrum erhalten wird, das dem von Prolin
peptiden ähnlich ist. Auch eine Verschiebung des cis-Jraws-Isomeriegleichgewichtes durch pH-Wert-
1 W. Vo e l t e r u. K . Ze c h, Chimia 26, 313 [1972].
2 W . Vo e l t e r, O . Os t e r u. K . Ze c h, A ngew . C hem ., im Druck.
3 K . Ze c h, D issertation , T übingen 1973.
4 K . Z e c h , D . G t t p t a u. W . V o e l t e r , A cta endocr.
Suppl. 178, 80 [1973].
5 K . F o l k e r s , F . E n z m a n n , J . B0l e r , C. Y . B o w e r s ,
u. A. V. S c h a l l y , B iochem . B iop h ys. R es. C om m un.
37, 123 [1969].
6 H . M a t s u o , Y . B a b a , R . M . G . N a i r , A . A r i m u r a u. A . V. S c h a l l y , B iochem . B iop h ys. R es. Com m un.
48, 1334 [1971].
A bb. 4. C'is-tfrans-Isomerie v o n T R H .
Änderung des Mediums dürfte die Rotatorstärke der Cottoneffekte stark beeinflussen.
Alle Spektren wurden mit einem Gerät der Firma Jasco-Biotronik (Frankfurt) gemessen.
D er D eu tsch en F orschungsgem einschaft danken wir für finanzielle U n terstü tzu n g. Frl. Br u n danken w ir für die A ufnahm e der C D-Spektren.
7 P . C ra b b e, A n In trod u ction to th e C hirooptical M ethods in C hem istry, M exico 1971.
8 W . V o e l t e r , L . F l o h e , P . K r a u s s , U . W e s e r u.
E . B a y e r , Sym posion über exp erim en telle P r o b lem e der E pilepsie-Forschung, B eth el 1972.
9 M. L e g r a n d u. R . V i e n n e t , B u ll. Soc. chim . France 1965, 679.
10 L . I . K a t z i n u. E . G u l y a s , J. Am er. chem . Soc. 90, 247 [1968].
11 O . O s t e r , D issertation, T übingen 1973.
