Zellbiologische Methoden

Methoden

(kleine nukleoläre RNA) dienten zur Normalisierung. Die Messungen wurden in Triplikaten durchgeführt und die Standardabweichung nach dem Gaußschen Fehlerfortpflanzungsgesetz bestimmt.

Methoden 3.2.3 Einfrieren von Zellen

Um eukaryotische Zellen längerfristig aufbewahren zu können, wurden sie eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Dazu wurden die Zellen von der Kulturschale mit Trypsin abgelöst (siehe Abschnitt 3.2.2) und zentrifugiert (400 x g, 5 min, 4°C). Die Zellen wurden in DMSO-haltigem Einfriermedium resuspendiert, in spezielle Kryoröhrchen überführt und zunächst für einige Tage bis wenige Wochen bei -80°C gelagert. Anschließend wurden die Kryoröhrchen zur längerfristigen Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt.

3.2.4 Transfektion von Plasmid-DNA

Zur Transfektion von Plasmid-DNA in Säugerzellen wurde je nach Zelllinie eine der drei hier beschriebenen Methoden gewählt. Bei einer transienten Transfektion von Expressionplasmiden wurden die Zellen 48 Stunden nach der Transfektion für die weitere Analyse verwendet.

Komplexierung von DNA mit Kalziumphosphat

Die Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion auf 10 cm-Kulturschalen ausplattiert.

Zur Transfektion wurden pro Ansatz 500 µl einer DNA-Kalziumchlorid-Mischung hergestellt. Diese wurde unter Vortexen langsam zu 500 µl 2x HBS getropft, wobei sich Kalziumphosphat-DNA-Komplexe ausbildeten. Das Transfektionsgemisch wurde sofort gleichmäßig auf die Zellen getropft. 12 – 16 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit frischem Vollmedium versetzt.

DNA-Kalziumchlorid-Mischung 5 – 20 µg Plasmid-DNA 50 µl CaCl2 (2,5 M) ad 500 µl aqua bidest.

Transfektion mit Polyethylenimin

Zur Transfektion von Plasmid-DNA in Säugerzellen wurde auch Polyethylenimin (PEI) verwendet. Die Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion auf 10 cm-Kulturschalen in Vollmedium ausplattiert. 4 Stunden vor der Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel zu Transfektionsmedium (2% FCS, ohne Antibiotika). Für die Transfektion wurden

Methoden

einerseits 10 µg DNA mit 600 µl PBS, andererseits 20 µl PEI (1 µg/µl) mit 600 µl PBS versetzt und jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die beiden Lösungen wurden gemischt und für weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde auf die Zellen getropft und spätestens nach 4 Stunden wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit frischem Vollmedium versetzt.

Lipid-basierte Transfektion

Für die Transfektion von Zelllinien, die sich mit den oben beschriebenen Methoden nicht transfizieren liesen, wurde die Lipid-basierte Transfektion angewendet. Hierfür wurden die Zellen in 6 cm-Schalen in Antibiotika-freiem Medium ausplattiert. Für die Transfektion wurden einerseits 3 – 10 µg DNA, andererseits 10 µl des Transfektionsreagenzes Lipofectamin^TM 2000 (Invitrogen) mit Opti-MEM I auf 500 µl aufgefüllt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die beiden Lösungen wurden gemischt, 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf die Zellen getropft. 12 – 16 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit frischem Zellkulturmedium versetzt.

3.2.5 Transfektion von doppelsträngigen Oligonukleotiden (siRNA, miRNA) Zur Transfektion von synthetischen doppelsträngigen Oligonukleotiden wie siRNAs (Dharmacon), miRNAs (miRIDIAN microRNA Mimics, Dharmacon) und miRNA-inaktivierende Reagenzien (miRCURY LNA^TM microRNA Knockdown Probes, Exiqon) wurde das Lipidtransfektionsreagenz Lipofectamine^TM RNAiMAX (Invitrogen) verwendet.

24 Stunden vor der Transfektion wurden die Zellen auf 6 cm-Kulturschalen in 3 ml Antibiotika-freiem Medium (mit 10% FCS) ausplattiert. Einerseits wurden 5 - 7,5 µl Oligonukleotid (abhängig von der jeweiligen Art) einer 20 µM Stocklösung, andererseits 10 µl des Transfektionsreagenzes jeweils mit Opti-MEM I (Invitrogen) auf 500 µl verdünnt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die beiden Lösungen wurden gemischt und weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor der Transfektionsmix zu den Zellen getropft wurde. Die Endkonzentration der siRNA lag somit bei 25 bis 37,5 nM, die der synthetischen miRNAs bei 25 nM und die der miRNA-inaktivierenden Reagenzien bei 50 nM. Das Transfektionsreagenz lag in einer

Methoden

Vollmedium. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion für die weitere Analyse geerntet.

3.2.6 Retrovirale Infektion von Säugerzellen

Die retrovirale Infektion von Plasmid-DNA bietet den Vorteil, dass die Plasmid-DNA in das Genom der Zielzellen integriert und somit eine stabile Expression erreicht wird. Da hierzu das Moloney Murine Leukaemia Virus (Mo-MuLV) verwendet wurde, das nur Maus- bzw. Rattenzellen infizieren kann, mussten humane Zelllinien vor der Infektion mit dem murinen ekotrophen Rezeptor transfiziert werden.

Rekombinante Retroviren wurden mit Hilfe der Verpackungszelllinie Phoenix-Eco (PHX) hergestellt. Sie stammt von der humanen embryonalen Nierenzelllinie 293T (ursprünglich HEK293) ab, die mit E1A und dem T-Antigen transformiert wurde (Kinsella and Nolan, 1996). Die PHX-Zellen exprimieren die viralen Genbereiche gag, env und pol unter Verwendung einer Resistenzkassette gegen Diphteria-Toxin und Hygromycin.

24 Stunden vor der Transfektion wurden 4 Millionen PHX-Zellen pro 10 cm-Kulturschale ausplattiert. Die Transfektion von 30 – 40 µg von geeigneten retroviralen Expressions-vektoren (z.B. pBabe, pWZL, pRETRO.SUPER) erfolgte mit Hilfe der Kalziumphosphat-DNA-Komplexierung. Die Zellen produzieren daraufhin rekombinante Retroviren und geben sie in den Zellkulturüberstand ab. 12 – 16 Stunden nach der Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel mit 7 ml Vollmedium. Der erste Virusüberstand konnte 48 Stunden nach der Transfektion abgenommen, in einem Reaktionsgefäß zentrifugiert (400 x g, 5 min, 4°C), in 3 ml-Aliquots in neue Reaktionsgefäße überführt und im flüssigem Stickstoff schockgefroren werden. Die Lagerung des Virusüberstands erfolgte bei -80°C.

Den PHX-Zellen wurden erneut 7 ml frisches Medium zugegeben und nach weiteren 24 Stunden der zweite Virusüberstand geerntet und eingefroren.

Für die Infektion von Zellen mit den rekombinanten Retroviren wurden diese auf 10 cm-Kulturschalen ausplattiert. Ein 3 ml-Aliquot des Virusüberstands wurde bei 37°C aufgetaut und mit 2 ml frischem Vollmedium und 5 µl einer Polybren-Lösung (Hexadimethrinbromid, Sigma, 4 µg/µl) gemischt. Das Medium der Zellen wurde abgenommen und durch das Infektionsgemisch ersetzt. Die Zellen wurden für 16 Stunden inkubiert, bevor 5 ml Vollmedium zugegeben wurden. 48 Stunden nach der Infektion

Methoden

begann die Behandlung mit Zytostatika. Dabei wurde der Zeitpunkt einer erfolgreich abgeschlossenen Selektion durch Vergleich mit einer nicht infizierten Zellschale bestimmt.

3.2.7 Propidiumiodid-Durchflusszytometrie

Zur Messung des DNA-Gehalts einer Zelle und somit zur Bestimmung der Verteilung der Zellzyklusphasen wurde die Propidiumiodid (PI)-Färbung mit anschließender Messung im Durchflusszytometer (fluorescence-activated cell sorting, FACS) herangezogen. PI ist ein fluoreszierender Farbstoff, der in die DNA interkaliert und eine Unterscheidung der Zellzyklusphasen der Zellen erlaubt. Somit lässt sich je nach DNA-Gehalt der Zelle unterscheiden, ob sie sich in der Zellzyklusphase G1/G0 (DNA-Gehalt: 2N), S (>2N, <4N) oder G2/M (4N) befindet. Außerdem können polyploide Zellen (>4N) und apoptotische Zellen („sub-G1“, <2N) identifiziert werden.

Der Zellkulturüberstand, der die apoptotischen Zellen enthielt, wurde in Probenröhrchen überführt. Die adhärenten Zellen wurden mit PBS gewaschen und durch Zugabe von Trypsin abgelöst. Sie wurden zum apoptotischen Zellkulturüberstand gegeben und zentrifugiert (400 x g, 5 min, 4°C). Das Zellpellet wurde mit 10 ml kaltem PBS gewaschen und erneut zentrifugiert. Die Zellen wurden dann in 1 ml kaltem PBS aufgenommen und tropfenweise in 4 ml kalten Ethanol gegeben. Um die Adhäsion der Zellen an das Plastik zu verhindern, wurden die Probenröhrchen vorher mit 2%iger Serumalbumin-Lösung für einige Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Diese Zellsuspension wurde bis zum nächsten Tag bei -20°C gelagert und dann auf die Färbung vorbereitet. Dazu wurde die Probe zentrifugiert (400 x g, 5 min, 4°C), das Zellpellet in PBS gewaschen und nach erneuter Pellettierung 1x10⁶ Zellen für die Färbung eingesetzt. Die Zellen wurden in kleinere Reaktionsgefäße überführt und nach Pelletierung in der Propidiumiodid-Färbelösung aufgenommen. Nach 30-minütiger Inkubation im Dunkeln bei 37°C konnten die Proben am Durchflusszytometer (BD FACSCanto II) gemessen werden. Dazu erfolgte die Messung bei 488 nm Anregungswellenlänge und mit einem 585 ± 21 nm Bandpassfilter (Detektor FL2) für Propidiumiodid (Emission 617 nm). Zur Messung und Analyse der Zellzyklusverteilung wurde das Programm BD FACSDiva 6.1.2 verwendet.

Methoden 3.2.8 Kristallviolett-Färbung

Bei Kristallviolett handelt es sich um einen violetten Triphenylmethan-Farbstoff, der zur Färbung von Zellen auf Kulturschalen verwendet wird. Dadurch kann die Zelldichte bestimmt und anschließend quantifiziert werden. Zunächst wurden die Zellen mit PBS gewaschen, die verbleibende Flüssigkeit gründlich entfernt und die Schalen leicht getrocknet. Nach 10-minütiger Fixierung der Zellen in 70%igem Alkohol (v/v) wurden die Kulturschalen für 30 Minuten in der Kristallviolett-Lösung inkubiert und anschließend der überschüssige Farbstoff mit Wasser abgewaschen. Die gefärbten Kulturschalen wurden einige Stunden lang getrocknet und konnten gegebenenfalls quantifiziert werden. Dazu wurde der Farbstoff in 10%iger Essigsäure durch 5-minütige Inkubation extrahiert. Von der 1:20 verdünnten Lösung erfolgte anschließend die photometrische Messung der Absorption bei 590 nm.