Gen B2M für humane Zellen. Dabei wurden die Messungen in Triplikaten durchgeführt und eine Standardabweichung nach dem Gaußschen Fehlerfortpflanzungsgesetz berechnet.
3.2.3 Einfrieren von Zellen
Zum Einfrieren wurden die Zellen wie bereits beschrieben mit Trypsinlösung abgelöst und resuspendiert. Anschließend wurden sie pelletiert (5 min, 400 x g, 4°C), der Zellrückstand in 3 ml Einfriermedium aufgenommen und auf drei Kryogefäße verteilt. Diese wurden sofort auf Eis und kurze Zeit später für zwei Stunden bei -20°C inkubiert. Danach wurden die Zellen einen Tag bis mehrere Wochen bei -80°C gelagert und schließlich in einen Tank mit flüssigem Stickstoff überführt.
3.2.4 Transfektion von siRNA in Säugerzellen
Die Transfektion von synthetischen siRNAs (Dharmacon) wurde unter Verwendung des Lipidtransfektionsreagenz LipofectamineTM RNAiMAX (Invitrogen) durchgeführt. Hierfür wurden die Zellen zunächst 24 Stunden vor der Transfektion auf 6 cm-Schalen in 4 ml Medium ohne Antibiotika ausplattiert. Zur Transfektion wurden zum Einen 5 l siRNA (20 M) mit Opti-MEM I (Invitrogen) auf 500 l verdünnt. Andererseits wurden 10 l des Transfektionsreagenz mit Opti-MEM I auf 500 l verdünnt und 5 Minuten inkubiert. Beide Lösungen wurden anschließend gemischt und weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde der Transfektionsmix zu den Zellen getropft, was einer Endkonzentration von 20 nM siRNA und 0,2% RNAiMax in 5 ml Gesamtvolumen entsprach.
12-16 Stunden nach Zugabe des Transfektionsansatzes wurde ein Mediumwechsel der Zellen vorgenommen.
3.2.5 Transfektion von Plasmid-DNA in Säugerzellen
Die Transfektion von Plasmid-DNA in Säugerzellen wurde meist durch Komplexierung mit Kalziumphosphat erreicht. Hierfür wurden die Zellen 24 Stunden zuvor in einer geeigneten Zellzahl auf 10 cm-Zellkulturschalen ausplattiert. Kurz vor der Transfektion wurden pro Ansatz 500 l einer DNA-Kalziumchlorid-Mischung angesetzt. Dazu wurden unter Vortexen langsam 500 l 2 x HBS getropft, wodurch sich Kalziumphosphat-Komplexe mit der DNA bildeten.
Unmittelbar darauf wurde dieses Kalziumphosphatgemisch gleichmäßig auf die Zellen getropft.
Schließlich wurden die Zellen 12-16 Stunden nach der Transfektion einmal mit PBS gewaschen und mit frischem Zellkulturmedium versetzt. Da es sich lediglich um eine transiente (vorübergehende) Transfektion handelte, wurden die Zellen meist 48 Stunden später für weitere
DNA-Kalziumchlorid-Mischung: 5-20 l Plasmid-DNA (1 g/l) 50 l CaCl2 (2,5 M)
ad 500 l aqua bidest.
Als weiteres Trägersystem für den Transfer von Plasmid-DNA in Säugerzellen wurde Polyethylenimin (PEI) verwendet. Zur Transfektion von Zellen (50% konfluent) auf einer 10 cm-Schale wurden 10 g DNA mit 400 l PBS bzw. 20 l PEI (1 g/l) mit 400 l PBS gemischt und jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die PEI-PBS-Mischung zur DNA-Verdünnung hinzugegeben und gründlich durchmischt. Nach einer weiteren Inkubation von 15 Minuten wurde das Medium der Zellen abgesaugt, 8 ml antibiotikafreies Medium mit lediglich 2% Serum zugegeben und der Transfektionsmix zugetropft. Nach maximal 3 Stunden wurden die Zellen aufgrund der relativ hohen Toxizität des Transfektionsreagenzes gründlich mit PBS gewaschen und mit frischem Medium (mit 10%
Serum und Antibiotika) versetzt.
3.2.6 Stabile retrovirale Infektion
Die retrovirale Infektion stellt eine hocheffiziente Methode da, eine genomische Integration der Plasmid-DNA und somit eine stabile Expression zu erreichen. Die Verwendung des Moloney Murine Leukaemia Virus (Mo-MuLV) setzt jedoch Maus- bzw. Rattenzellen oder Zellen, die den murinen ekotrophen Rezeptor exprimieren, für eine Infektion voraus.
Hergestellt wurden rekombinante Retroviren in der Verpackungszelllinie Phoenix-Eco (PHX), welche von der 293T-Zelllinie abstammt. Dabei handelt es sich um eine mit E1A und T-Antigen transformierte humane embryonale Nierenzelllinie (ursprünglich HEK293). Phoenix-Zellen exprimieren die viralen Genbereiche gag, env und pol unter Verwendung der Resistenz gegen Hygromycin und Diphteriatoxin. 24 Stunden vor Transfektion dieser Zellen mit Hilfe der Kalziumphosphatmethode wurden sie in einer Zelldichte von 5 Millionen pro 10 cm-Schale ausplattiert. Nach der Transfektion der PHX-Zellen mit retroviralen Expressionsvektoren (z.B.
pRETRO-SUPER) produzieren diese Zellen rekombinante Retroviren, die in den Zellkulturüberstand abgegeben werden. Es erfolgte 15 Stunden nach der Transfektion ein Mediumwechsel mit 7 ml Medium. Der erste Virusüberstand wurde 48 Stunden nach Transfektion abgenommen, in ein 15 ml-Reaktionsgefäß überführt und zentrifugiert (5 min, 500 x g, 4°C). Der Überstand wurde erneut in ein neues 15 ml-Reaktionsgefäß überführt, mittels flüssigen Stickstoffs schockgefroren und bei -80°C gelagert. Den Zellen wurden nochmals 7 ml
an frischem Medium zugegeben, nach weiteren 18 Stunden ein zweiter Virusüberstand abgenommen und die Zellen anschließend verworfen.
Zur Infektion von Zellen mit den rekombinanten Retroviren wurden die Zellen 24 Stunden vor Infektion auf eine 10 cm-Schale ausplattiert. Der tiefgefrorene Virusüberstand wurde dann schnell bei 37°C aufgetaut und jeweils 3 ml Virusüberstand mit 2 ml frischem Medium sowie 5 l Polybren (4 g/l, Hexadimethrinbromid, Sigma) gemischt. Anschließend wurde das Kulturmedium der Zellen abgenommen und das Infektionsgemisch von 5 ml auf die Zellen gegeben. Nach einer Inkubation von 12-16 Stunden erfolgte die Zugabe von weiteren 5 ml Medium. Die Selektion erfolgreich transfizierter Zellen mit entsprechenden Zytostatika wurde nach 24-48 Stunden eingeleitet, wobei der Zeitpunkt der abgeschlossenen Selektion durch Vergleich mit einer Schale nicht infizierter Zellen bestimmt wurde.
3.2.7 Wachstumskurve
Zum Vergleich des Wachstumsverhaltens mehrerer Zelllinien wurden diese zunächst in identischer Zellzahl ausplattiert und anschließend an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen die Anzahl lebender Zellen von jeweils drei Schalen bestimmt. Dafür wurden die Zellen mittels Trypsinlösung wie beim Passagieren abgelöst und eine 1:1-Mischung der Zellsuspension und Trypanblaulösung hergestellt. Dieser anionische Farbstoff bindet an Zellproteine und gelangt lediglich bei toten Zellen durch die defekte Zellmembran in das Zytosol und färbt diese somit blau. Lebende Zellen erscheinen im Mikroskop dagegen hell. Die lebenden Zellen wurden nun in einer Neubauer-Zählkammer für drei Schalen pro Bedingung ausgezählt und der Mittelwert dieser drei Werte sowie die Standardabweichung graphisch dargestellt.
3.2.8 Etablierung immortaler 3T3 Zelllinien
Da die Arbeit mit primären murinen embryonalen Fibroblasten durch den Eintritt in die Seneszenz auf wenige Passagen beschränkt ist, wurden zur näheren Charakterisierung der MizPOZ/POZ MEFs immortale 3T3 Zelllinien etabliert. Hierfür wurden frisch isolierte MEFs in einer Zelldichte von 3*105 Zellen pro 6 cm-Zellkulturschale ausgesät, alle drei Tage passagiert und erneut in der gleichen Dichte ausplattiert (Todaro und Green, 1963). Nach etwa 6-8 Passagen durchläuft ein Großteil der Kultur eine sogenannte „Krise“, aus der schließlich die immortalisierten Zellen hervorgehen (14-18 Passagen).
3.2.9 Propidiumiodid-Durchflusszytometrie (PI-FACS)
Die Durchflusszytometrie (fluorescence-activated cell sorting, FACS) basiert auf der Laser-vermittelten Anregung fluoreszierender Farbstoffe und der Messung der Farbstoffintensität einzelner Zellen, die auch zum Sortieren der Zellen verwendet werden kann.
Zur Zellzyklusanalyse eignet sich die Bestimmung des DNA-Gehalts der Zellen mit Hilfe eines interkalierenden, fluoreszierenden Farbstoffs, wie z.B. Propidiumiodid. Der DNA-Gehalt ermöglicht hierbei eine Unterscheidung der Zellzyklusphasen G1/G0 (DNA-Gehalt 2N), S (>2N, <4N) und G2/M (4N). Darüber hinaus können polyploide Zellen (>4N) sowie apoptotische Zellen („sub-G1“; <2N) identifiziert werden.
Um bereits abgelöste, apoptotische Zellen in die Messung miteinzubeziehen wurde das Medium in ein 15 ml-Reaktionsgefäß überführt, die adhärenten Zellen mittels Trypsinlösung abgelöst, in dem Zellkulturüberstand resuspendiert und zentrifugiert (5 min, 400 x g, 4°C). Der Zellrückstand wurde mit PBS gewaschen und anschließend unter intensivem Vortexen in ein 15 ml-Polystyrol-Reaktionsgefäß mit 4 ml eiskaltem Ethanol abs. getropft. Diese Ethanol-fixierten Zellen wurden über Nacht (gegebenenfalls mehrere Tage) bei -20°C gelagert.
Am Tag der FACS-Messung wurden die Zellen zentrifugiert (5 min, 400 x g, 4°C), mit kaltem PBS gewaschen und in 1 ml PBS resuspendiert. Anschließend wurden von jeder Probe 106 Zellen in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt und zentrifugiert (5 min, 400 x g, 4°C). Der Zellrückstand wurde in 400 l PI-FACS-Puffer resuspendiert und 30 Minuten bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Nach einem Transfer in FACS-Röhrchen wurde die Messung bei 488 nm Anregungswellenlänge und mit einem 585 ±21 nm Bandpassfilter (Detektor FL2) für Propidiumiodid (Emission 617 nm) gemessen. Ein Ausschluss von Zellaggregaten erfolgte durch Ausgrenzen hoher Signalweite bei der Auswertung. Zur Analyse der Zellzyklusverteilung wurde das Programm CellQuest Pro (BD Biosciences) verwendet.
3.2.10 Untersuchung der Schweifbildung zum Nachweis von DNA-Strangbrüchen (Comet Assay)
Zum Nachweis von DNA-Schädigungen wurde ein alkalischer Comet Assay mit Hilfe des Comet AssayTM Reagent Kit for Single Cell Electrophoreses Assay (Trevigen) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Hierbei wird die DNA einzelner Zellen elektrophoretisch aufgetrennt
und es entsteht neben dem Kopf (intakte DNA) ein Schweif bestehend aus gewanderten DNA-Fragmenten. Die einzelnen Schritte des Comet Assay beinhalten die Ablösung der Zellen von den Zellkulturschalen, die Einbettung der Zellen in Agarose auf Objektträgern, die Lyse und alkalische pH-Werteinstellung, die Elektrophorese sowie die anschließende Fixierung und Färbung der DNA. Da zur Anfärbung der DNA der Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green I mit einem Anregungs- bzw. Emissionsmaximum von 494 nm bzw. 521 nm verwendet wurde, konnte die DNA im Anschluss am Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines Fluoreszeinfilters detektiert werden. Die Quantifizierung der vorliegenden DNA-Schäden erfolgte mit Hilfe der Software Cometscore15 in Form des Comet Tail Moment. Die Berechung des Comet Tail Moment beruht auf der Formel „Schweiflänge x (Anteil der DNA im Schweif
%/100)“.