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8 Semi-dry Westernblot

10 Lokalisation und Regulation der Dam-MTase

10.4 Homologe Rekombination

10.4.1 Verwendete Plasmide .1 Donorplasmid

Um das Donorplasmid herzustellen, sollte ein Teil der genomische Sequenz, die dem 3'-Ende des dam-Methyltransferasegenes folgt (siehe Abb. 8), an das 3'-Ende des Gens für das DamGFP-Fusionsproteins auf dem Vektor pET28a damGFP (siehe 10.1 und 2.2.3) über NotI und XhoI- Schnittstellen einkloniert werden. Dabei sollte gleichzeitig die Erkennungssequenz für I-SceI Homing-Endonuclease eingeführt werden.

Materialien und Methoden 60

ATGAAGAAAAATCGCGCTTTTTTGAAGTGGGCAGGGGGCAAGTATCCCCTGCTTGATGATATTAAACGGCATTTGCCCAAGGGCGAATGTCTGGTTGAGCCTTTTGT AGGTGCCGGGTCGGTGTTTCTCAACACCGACTTTTCTCGTTATATCCTTGCCGATATCAATAGCGACCTGATCAGTCTCTATAACATTGTGAAGATGCGTACTGATGAGT ACGTACAGGCCGCACGCGAGCTGTTTGTTCCCGAAACAAATTGCGCCGAGGTTTACTATCAGTTCCGCGAAGAGTTCAACAAAAGCCAGGATCCGTTCCGTCG GGCGGTACTGTTTTTATATTTGAACCGCTACGGTTACAACGGCCTGTGTCGTTACAATCTGCGCGGTGAGTTTAACGTGCCGTTCGGCCGCTACAAAAAACCCTATTT CCCGGAAGCAGAGTTGTATCACTTCGCTGAAAAAGCGCAGAATGCCTTTTTCTATTGTGAGTCTTACGCCGATAGCATGGCGCGCGCAGATGATGCATCCGTCGT CTATTGCGATCCGCCTTATGCACCGCTGTCTGCGACCGCCAACTTTACGGCGTATCACACAAACAGTTTTACGCTTGAACAACAAGCGCATCTGGCGGAGATCGC CGAAGGTCTGGTTGAGCGCCATATTCCAGTGCTGATCTCCAATCACGATACGATGTTAACGCGTGAGTGGTATCAGCGCGCAAAATTGCATGTCGTCAAAGTTCGA CGCAGTATAAGCAGCAACGGCGGCACACGTAAAAAGGTGGACGAACTGCTGGCTTTGTACAAACCAGGAGTCGTTTCACCCGCGAAAAAATAAttctcaaggag aagcggATGAAACAGTATTTGATTGCCCCCTCAATTCTGTCGGCTGATTTTGCCCGCCTGGGTGAAGATACCGCAAAAGCCCTGGCAGCTGGCGCTGATGTCGTGC ATTTTGACGTCATGGATAACCACTATGTTCCCAATCTGACGATTGGGCCAATGGTGCTGAAATCCTTGCGTAACTATGGCATTACCGCCCCTATCGACGTACACCTGA TGGTGAAACCCGTCGATCGCATTGTGCCTGATTTCGCTGCCGCTGGTGCCAGCATCATTACCTTTCATCCAGAAGCCTCCGAGCATGTTGACCGCACGCTGCAAC TGATTAAAGAAAATGGCTGTAAAGCGGGTCTGGTATTTAACCCGGCGACACCTCTGAGCTATCTGGATTACGTGATGGATAAGCTGGATGTGATCCTGCTGATGTCC GTCAACCCTGGTTTCGGCGGTCAGTCTTTCATTCCTCAAACACTGGATAAACTGCGCGAAGTACGTCGCCGTATCGACGAGTCTGGCTTTGACATTCGACTAGAAGT GGACGGTGGCGTGAAGGTGAACAACATTGGCGAAATCGCTGCGGCGGGCGCGGATATGTTCGTCGCCGGTTCGGCAATCTTCGACCAGCCAGACTACAAAA AAGTCATTGATGAAATGCGCAGTGAACTGGCAAAGGTAAGTCATGAATAA

Abb. 8: Ausschnitt aus der genomischen Sequenz von E.coli K12 (NCBI/Blattner). Blau: Sequenz des dam-Methyltransferasegenes; lila: Sequenz des rpe-Genes; grün: intergenische Sequenz; gelb unterlegt: amplifizierte Sequenz.

Restriktionsverdau und Behandlung des Vektors pET28a damGFP mit Shrimp Alkaline Photphatase (SAP)

Der Restriktionsverdau des Plasmides erfolgte mit den Enzymen NotI und XhoI der Fa.

NEB GmbH gemäß den Angaben des Herstellers. Der verdaute Vektor wurde anschließend mit dem NucleoSpin® Extract II Kit der Fa. Macherey-Nagel GmbH &

Co. KG unter Beachtung der Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. Die anschließende Behandlung des verdauten und gereinigten Vektors erfolgte mit der SAP der Fa. USB Co. nach den Angaben des Herstellers. Anschließend wurde der behandelte Vektor mit dem NucleoSpin® Extract II Kit aufgereinigt.

Amplifikation und Verdau der genomischen Sequenz

Die Polymerase Chain Reaction (PCR)-Amplifikation erfolgte mit den in Tab. 14 angegeben Primern mit Hilfe des FailSafe™ PCR PreMix Selection Kit der Fa. Epicentre Biotechnologies (Madison, Wisconsin, USA) nach den Angaben des Herstellers. Als template wurde die genomsiche DNA von JM 109 Zellen verwendet. Mit Hilfe des Rückprimers wurde die Erkennungssequenz für I-SceI eingeführt. Für die PCR wurde folgendes Temperaturprofil verwendet: 1 x 2 min bei 94°C, 41 x (30 sec bei 94°C; 30 sec bei 60°C; 1 min bei 72°C), 1 x 10 min bei 72°C. Anschließend wurde auf 4°C abgekühlt. Die PCR Produkte wurden mit Hilfe einer Agarosegelelektrophorese

Materialien und Methoden 61 analysiert und mit dem NucleoSpin® Extract II Kit gereinigt. Das gereinigt PCR Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen NotI und XhoI der Fa. NEB GmbH gemäß den Angaben des Herstellers verdaut und anschließend mit dem NucleoSpin® Extract II Kit gereinigt.

Tab. 14: Sequenz der Primer für die Amplifikation der genomischen Sequenz 3´des dam-Methyltransferasegens. Die Erkennungssequenzen der Restriktionsenzyme (RE) mit denen anschließend geschnitten wird sind unterstrichen. Fett gedruckt ist die I-SceI-Schnittstelle, die für die Homologe Rekombination verwendet wird

Primer RE Sequenz

homf_NotI NotI 5`-agc tac gcg gcc gct tct caa gga gaa gcg gat gaa aca-3`

homrev_neu XhoI 5`-agc tac ctc gag att acc ctg tta tcc cta act tac ctt tgc cag ttc act gcg-3`

Ligation

Die Ligation des Vektors und des PCR Produktes erfolgte wie in Punkt 10.1 beschrieben.

Detektion positiver Klone:

Um positive Klone zu identifizieren, wurden acht Klone der Agarplatte, auf der die mit dem Ligationsansatz transformierten Zellen ausplattiert wurden, gepickt, jeweils eine 3 ml LB-Kultur mit den entsprechenden AB damit inokuliert und bei 37°C ü/N inkubiert.

Am nächsten Tag wurde aus diesen Kulturen das Plasmid mit Hilfe einer Minipräparation gewonnen, mit den RE NotI und XhoI bzw. I-SceI (NEB GmbH) verdaut (siehe oben) und anschließend agarosegelelektrophoretisch analysiert. Als Kontrolle für eine erfolgreiche Spaltung mit I-SceI wurde das von der Firma mitgelierte Testplasmid ebenfalls verdaut.

Sequenzierung

Zur Überprüfung der klonierten DNA-Fragmente wurde ihre Sequenz ermittelt. Die Sequenzierung erfolgte durch die Fa. Seqlab Sequence Laboratories Göttingen GmbH (Göttinen, Deutschland) nach den Angaben der Firma. Es wurden Extended Hot Shot Sequenzierungen durchgeführt. Die untersuchten Klone wurden jeweils zwei mal sequenziert, einmal mit dem Primer homf_NotI, das andere mal mit dem Primer

Materialien und Methoden 62 homrev_neu (siehe Tab. 14). Die erhaltenen Sequenzen wurden mit dem Programm GeneDoc (Nicholas et al, 1997) analysiert.

10.4.1.2 Plasmid HR Kontrolle

Zur Kontrolle für die homologie Rekombination wurde eine stille Mutation innerhalb des dam-Methyltransferasegenes eingeführt, durch die die einzige BamHI-Schnittstelle entfernt wurde. Wie in Abb. 9 zu sehen, wurde an der Stelle 309 des dam-Methyltransferasegens die Base Thymin durch Cytosin ersetzt werden. Dadurch bleibt die Aminosäure erhalten, die BamHI Schnittstelle aber nicht.

ATGAAGAAAAATCGCGCTTTTTTGAAGTGGGCAGGGGGCAAGTATCCCCTGCTTGATGATATTAAACGGCATTTGCCCAAGGGCGAATGTCTGGTTGAGCCTTTTGT AGGTGCCGGGTCGGTGTTTCTCAACACCGACTTTTCTCGTTATATCCTTGCCGATATCAATAGCGACCTGATCAGTCTCTATAACATTGTGAAGATGCGTACTGATGAGT ACGTACAGGCCGCACGCGAGCTGTTTGTTCCCGAAACAAATTGCGCCGAGGTTTACTATCAGTTCCGCGAAGAGTTCAACAAAAGCCAGGATCCGTTCCGTCGG GCGGTACTGTTTTTATATTTGAACCGCTACGGTTACAACGGCCTGTGTCGTTACAATCTGCGCGGTGAGTTTAACGTGCCGTTCGGCCGCTACAAAAAACCCTATTTC CCGGAAGCAGAGTTGTATCACTTCGCTGAAAAAGCGCAGAATGCCTTTTTCTATTGTGAGTCTTACGCCGATAGCATGGCGCGCGCAGATGATGCATCCGTCGTCT ATTGCGATCCGCCTTATGCACCGCTGTCTGCGACCGCCAACTTTACGGCGTATCACACAAACAGTTTTACGCTTGAACAACAAGCGCATCTGGCGGAGATCGCC GAAGGTCTGGTTGAGCGCCATATTCCAGTGCTGATCTCCAATCACGATACGATGTTAACGCGTGAGTGGTATCAGCGCGCAAAATTGCATGTCGTCAAAGTTCGAC GCAGTATAAGCAGCAACGGCGGCACACGTAAAAAGGTGGACGAACTGCTGGCTTTGTACAAACCAGGAGTCGTTTCACCCGCGAAAAAATAA

Abb. 9: Sequenz des dam-Methyltransferasegens. Fett gedruckt: BamHI-Schnittstelle. Gelb unterlegt: zu mutierende Base

Zielgerichtete PCR-Mutagenese Erster PCR-Mutagensesschritt:

In diesem Fall wurden die in Tab. 15 angegebenen Primer verwendet. Der Hin-Primer trägt die einzuführende Mutation, der Rück-Primer trägt die einzuführende I-SceI-Schittstelle. Als template diente das Plasmid pET28a dam WT (siehe 2.2.1). Für die PCR wurde die Pfu-Polymerase und folgendes Temperaturprofil verwendet: 1 x 5 min bei 95°C, 25 x (30 sec bei 95°C; 30 sec bei 55°C; 1 min bei 75°C), 1 x 10 min bei 75°C.

Anschließend wurde auf 4°C abgekühlt. Das PCR-Produkt wurde anschließend mit Hilfe einer Agarosegelelektrophorese analysiert und mit dem NucleoSpin® Extract II Kit gereinigt.

Materialien und Methoden 63

Tab. 15:Primer für den ersten PCR-Mutagenseschritt für die Herstellung des Plasmids HR Kontrolle. Die I-SceI-Schittstelle ist unterstrichen, die mutierte Base ist fettgedruckt

Primer Sequenz

HR Kontrolle_f 5`-aag cca gga ccc gtt ccg tc-3`

HR Kontrolle_rev 5`-tag gga taa cag ggt aat tta ttt ttt cgc ggg tga aac ga-3`

Zweiter PCR-Mutagenseschritt:

In diesem Fall wurde als template das Plasmid pET28a dam WT (siehe 2.2.1) verwendet. Für die PCR wurden 10 µl des aufgereinigten Megaprimers aus der ersten PCR-Reaktion eingesetzt, die Pfu-Polymerase und folgendes Temperaturprofil verwendet: 1 x 5 min bei 95°C, 25 x (1 min bei 95°C; 15 min bei 68°C), 1 x 20 min bei 68°C. Anschließend wurde auf 4°C abgekühlt.

DpnI-Verdau:

Siehe Punkt 9.2

Detektion positiver Klone:

Um Klone zu finden, die die Mutation tragen wurden acht Klone von der Agarplatte gepickt und einerseits direkt in ein PCR-Gefäß geschmiert und andererseits eine 3 ml Kultur mit entspechenden AB damit inokuliert und bei 37°C ü/N inkubiert. Von den acht Klonen und dem Plasmid pET28a dam WT wurde mit den in Tab. 16 angegebenen Primern das dam-Methyltransferasegen amplifiziert. Es wurde die Pfu-Polymerase und folgendes Temperaturprofil verwendet: 1 x 5 min bei 95°C, 25 x (30 sec bei 95°C; 30 sec bei 55°C; 1 min bei 75°C), 1 x 10 min bei 75°C. Anschließend wurde auf 4°C abgekühlt. Das ampilfizierte Produkt wurde anschließend mit dem RE BamHI von MBI Fermentas GmbH nach den Angaben des Herstellers verdaut und die Spaltprodukte anschließend agarosegelelektrophoretisch analysiert. Von den Klonen die sich durch diesen Restriktionsverdau als positiv erwiesen haben wurde von den ü/N-Kulturen das Plasmid mit einer Minipräparation isoliert und eine Testspaltung mit dem RE I-SceI der Fa. NEB GmbH nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

Als Kontrolle für eine erfolgreiche Spaltung wurde das von der Firma mitgelierte

Materialien und Methoden 64 Testplasmid ebenfalls verdaut. Die Spaltprodukte wurden anschließend Agarosegelelektrophoretisch analysiert.

Tab. 16:Primer für die Detektion positiver Klone Primer Sequenz

Dam_hin 5`-atg aag aaa aat cgc gct ttt ttg a-3`

Dam_rück 5`-tta ttt ttt cgc ggg tga aac ga-3`

Sequenzierung

Um die Korrektheit der Klone weiter zu überprüfen wurden sie sequenziert. Die Sequenzierung erfolgte durch die Fa. Seqlab Sequence Laboratories Göttingen GmbH (Göttinen, Deutschland) nach den Angaben der Firma. Es wurden Extended Hot Shot Sequenzierungen durchgeführt. Die untersuchten Klone wurden mit drei unterschiedlichen Primern sequenziert (dam_hin, dam_rück (siehe Tab. 16) und damGFP (5`- ggc gta tca cac aaa cag-3`)). Die erhaltenen Sequenzen wurden mit dem Programm GeneDoc (Nicholas et al, 1997) analysiert.

10.4.1.3 Mutageneseplasmid pACBSR Siehe 2.2.10 und Abb. 10.