3. Ergebnisse und Diskussion
3.1 Der Einfluss der Hepatitis C Virus 3’-UTR auf die Translation durch
3.1.3 Verschiedene Deletionen innerhalb der HCV 3’-UTR reduzieren die
einen Effekt zu sehen und dass für eine korrekte Termination der Translation mehr Nukleotide hinter dem Reportergen notwendig sind. Die hier anhand der neuen Reporter RNAs ermittelten Stimulationswerte durch die HCV 3’-UTR sind allerdings nun besser mit den Resultaten der Studie von Song et al. zu vergleichen. Auch hier konnte nun keine Stimulation im RRL mehr gefunden werden. Trotzdem kann die dort festgestellte Zelltyp-Spezifität hier nicht nachgewiesen werden, da die sich hier ähnliche Stimulationswerte in Leberzellen und Nicht-Leberzellen zeigen. Wie diese Unterschiede zu erklären sind, konnte nicht gezeigt werden. Der Effekt der Translationsstimulation durch die HCV 3’-UTR ist also auch neben Huh7- und HeLa-Zellen in HEK293 Zellen zu beobachten. Außerdem zeigen die Elektroporations-Experimente, dass dieser Effekt nicht durch Unterschiede in der Transfektion der RNA-Konstrukte zustande kommt, sondern dass es sich um eine tatsächliche Translationsstimulation handelt. Da diese nicht nur in der Hepatomzelllinie, sondern auch in der Zervixkarzinom- und Nierenzelllinie zu erkennen ist, scheint es sich hierbei nicht um einen zelltypabhängigen, sondern eher um einen universellen Effekt der Stimulation zu handeln. Eine erhöhte Translation der viralen RNA durch die HCV 3’-UTR scheint also kein entscheidender Faktor für eine Zellspezifität des Virus zu sein.
Um zu überprüfen, dass die gemessenen Stimulationen tatsächlich auf Translationsebene stattfinden und nicht durch eine vermehrte Degradation des Konstrukts ohne HCV 3’-UTR zustande kommen, wurde eine RNA-Stabilitätskontrolle durchgeführt. Dafür wurde nach Transfektion der Reporter RNAs nach verschiedenen Zeitpunkten von zwei bis acht Stunden, eine Reextraktion der RNA aus den Zellen und eine Mengenbestimmung mit Hilfe der quantitativen real-time PCR vorgenommen. Die Daten (gezeigt in Bung, Bochkaeva et al., 2010) lassen keine Unterschiede in der Degradation der unterschiedlichen Konstrukte erkennen. Dies deckt sich mit der Stabilitätskontrolle aus Song et al., wo ebenfalls keine Unterschiede nach Reextraktion der RNA und darauf folgendem „RNase-Protection Assay“
detektiert wurden.
3.1.3 Verschiedene Deletionen innerhalb der HCV 3’-UTR reduzieren die
Die entsprechenden RNAs wurden zusammen mit der RNA ohne HCV 3’-UTR in Huh7 und HeLa-Zellen transfiziert.
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0
HCV -3'UTR
HCV + 3'UTR
dVR dUC dVUC dSL1-3
rel. Stimulation
Huh7 Hela
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0
PTV -3'UTR
PTV + 3'UTR
dVR dUC dVUC dSL1-3
rel.Stimulation
Huh7 Hela
Abbildung 3.10: Effekt der HCV 3’-UTR Mutanten auf die IRES-abhängige Translation der HCV IRES (A) und PTV IRES (B). Transfektion der RNA-Konstrukte mit mutierter HCV 3’-UTR im Vergleich zu RNAs ohne oder mit vollständiger HCV 3’-UTR in Huh7- und HeLa-Zellen. Die Werte ohne 3’-UTR wurden gleich 1 gesetzt. dVR = Deletion der variablen Region; dUC = Deletion des PolyU/C-Trakts;
dVUC = Deletion der variablen Region und des PolyU/C-Trakts; dSL1-3 = Deletion der 3’X Region, stem-loops 1-3.
Die Deletionen innerhalb der HCV 3’-UTR bewirken in Kombination mit beiden IRES-Elementen (HCV und PTV IRES) in beiden Zelllinien eine Reduktion des translationsstimulierenden Effekts (siehe Abbildung 3.10). Der stärkste Verlust an Stimulation ist durch die Deletion der 3’X-Region zu beobachten. Diese führt zu einer Reduktion der Stimulation von ungefähr 70 % bei der HCV IRES und 50 % bei der PTV IRES. Einen vergleichsweise geringen Effekt zeigt die Deletion der variablen Region, was schließen lässt, dass diese bei der Translationsstimulation nur einen geringen Einfluss hat. Einen etwas stärkeren Effekt zeigt die Mutation des PolyU/C-Trakt, gefolgt von der Kombination aus
A
B
Diskussion
Alle vier Deletionen bewirken eine Reduktion der Translationsstimulation durch die HCV 3’-UTR, allerdings in unterschiedlicher Ausprägung. Ähnliche Versuche für die Stimulation der HCV IRES in Huh7-Zellen wurden auch schon von Song et al. durchgeführt. Dort konnte ebenfalls eine deutliche Reduktion der Stimulation nachgewiesen werden, die jedoch höher ausfällt als in den hier durchgeführten Versuchreihen. Alle oben aufgeführten Mutanten zeigten in der Studie von Song nur noch eine Stimulation von 12 - 17 % im Vergleich zum HCV 3’-UTR Wildtyp, wobei auch dort die Deletion der 3’-X Region die deutlichste Reduktion zeigte. Wie auch hier der quantitative Unterschied zwischen beiden Studien zu erklären ist, konnte nicht gezeigt werden.
Da die hier verwendeten 3’-UTR-Mutanten auch zum Teil eine Änderung der Sekundärstruktur am 3’-Ende beinhalten, ist eine erleichterte Degradation durch Exonukleasen eine mögliche Erklärung für die Reduktion der Translation, da sich eventuell vor exonukleolytischem Abbau schützende Sekundärstrukturen durch die Mutationen verändert haben. Song et al. konnten jedoch durch RNA-Reextraktion und anschließenden
„RNase-Protection Assay“ zeigen, dass die Unterschiede in der Translationseffizienz der Mutationen nicht mit Unterschieden in der RNA-Stabilität erklärt werden können. Da außerdem hier auch die Deletionen von internen Regionen der HCV 3’-UTR einen deutlichen Verlust an Translationsstimulation zeigen, lässt sich vermuten, dass nicht die veränderten Bedingungen am 3’-Ende der RNA für 3’-Exonukleasen die Reduktion der Translation auslösen.
Zusätzlich wurden auch hier die Transfektionen, die mit Hilfe von Lipofektion durchgeführt wurden, durch Elektroporationen bestätigt, so dass auch hier Unterschiede zwischen den Reporter-RNAs ausgeschlossen werden können.
Die oben gezeigten Daten weisen also darauf hin, dass alle drei Bereiche der HCV 3’-UTR an der Stimulation der Aktivität der IRES-Elemente beteiligt sind, jedoch in unterschiedlich starkem Ausmaß. Eine mögliche Erklärung für diesen Effekt kann die Bindung von verschiedenen Proteinen an die HCV 3’-UTR sein, die eine 5’-3’-Interaktion vermitteln. Da sowohl die HCV IRES als auch die HCV 3’-UTR eine Vielzahl unterschiedlicher Proteine binden, kann es im Falle einer Deletion einer bestimmten Region zu einer geschwächten Interaktion der RNA-Enden durch eine fehlende Proteinbindung kommen. Da die ermittelten Daten ähnliche Muster in Leber- und Nicht Leberzellen zeigen, liegt der Verdacht nahe, dass es sich hierbei um eine ubiquitäre Interaktion handelt.
Fazit
Die HCV 3’-UTR stimuliert die Translation sowohl der HCV- als auch der ihr strukturell und funktional ähnlichen PTV IRES. Diese Stimulation findet in allen getesteten Zelltypen statt, was darauf hinweist, dass die HCV 3’-UTR nicht an der Leberspezifität des Virus beteiligt ist.
Die Translationsstimulation konnte allerdings ausschließlich in vivo gezeigt werden. Im
Retikulozytenlysat werden die Reporter-RNAs zwar sehr effektiv translatiert, möglicherweise fehlen in diesem Translationssystem jedoch eventuelle Faktoren, die an der Stimulation der Translation durch die HCV 3’-UTR beteiligt sind. Des Weiteren zeigen Deletion innerhalb der HCV 3’-UTR, dass alle Regionen der HCV 3’-UTR an der Stimulation der Aktivität der IRES in unterschiedlichem Ausmaße beteiligt sind.