von HCV und auf den stimulatorischen Effekt der miR-122
2.4.2 Vergleich der Translationseffizienz in unterschiedlichen Zellzyklusphasen
Wie in Kapitel 2.4 erwähnt, beeinflusst HCV den Zellzyklus durch vermehrte Expression von TXNIP (Blackhamet al., 2010), wodurch die Zellen in der G0 -Phase arretieren. Aber hat der Zellzyklus selbst auch einen Einfluss auf die Translation der HCV-RNA? Um diese Frage zu beantworten, wurden die Zellen
Abb. 28 Reporterkonstrukte für Transfektionsexperimente in Huh7- und HeLa-Zellen
(A) HCV Reporterkonstrukt (HCV-CLX-CMV) bestehend aus der HCV-IRES, Core- und Ubiquitin-Sequenz, Firefly-Luziferase und der 3’-UTR von HCV. (B) Co-Reporter (phRL null) mit 5’-Cap, Renilla-Luziferase, SV40-Sequenz und Poly(A)-Schwanz.
Phasen G0, G0/G1, S und G2/M akkumuliert und mit nicht synchronisierten Zellen verglichen. Die Transfektionen wurden wie im Methoden-Teil beschrieben mit den Reporterkonstrukten für HCV und einem Co-Reporter (s.
Abb. 28) durchgeführt. Da die Normalisierung bei diesen Versuchen viele Parameter einbeziehen sollte, wurden neben der Co-Transfektion auch die metabolische Aktivität der Zellen durch eine WST-1 Messung einbezogen.
2.4.2.1 Die Effizienz der Cap- und IRES-abhängigen Translation in verschiedenen Zellzyklusphasen in Huh7-Zellen
Die Transfektionen in diesem Teil wurden in Huh7-Zellen in den jeweiligen Zellzyklusphasen durchgeführt. Dafür wurden die Zellen synchronisiert und in eine 24-well-Platte ausgesät. Nachdem sich die Zellen nach 2 Stunden abgesetzt haben, konnten sie transfiziert werden. Die Zellen für die G0-Phase wurden in der 24-well-Platte bis zur Kontaktinhibition wachsen gelassen und dann transfiziert. Die Transfektionskomplexe mit den RNAs wurden für 1,5 Stunden auf den Zellen belassen, von den Zellen aufgenommen und translatiert. Für die Normalisierung der daraus resultierenden Daten und für eine Bestätigung der metabolischen Aktivität der Zellen wurde anschließend das WST-1 Reagenz in farblosem DMEM (ohne Serum und FBS) auf die Zellen gegeben und für 30 min inkubiert. Durch die Umsetzung des Tetrazoliumsalzes zu Formazan und den damit entstandenen Farbumschlag konnte die Absorption bei 450 nm gemessen werden. Danach wurden die Zellen lysiert und die Luziferase-Aktivität im Luminometer gemessen. Die Ergebnisse der Translationseffizienz sind in Abbildung 29 zusammengefasst. Hier sind zum einen die Firefly-, Renilla- und WST-1 Daten einzeln dargestellt und zum anderen auf WST-1 oder den Co-Reporter RLuc normalisiert. Da die gemessenen Rohdaten zwischen den jeweiligen Versuchstagen (Messung einer Charge synchronisierter Zellen) stark schwanken können, wurden sie, um sie miteinander vergleichen zu können, pro Versuch prozentual zu unsynchronisierten Zellen berechnet, wobei diese dabei gleich 100 % gesetzt wurden.
Die Einzeldarstellung der FLuc- und RLuc-Daten zeigt deutlich, dass die Translation in G0-Phase-Zellen am besten funktioniert. Jedoch nimmt die Translationseffizienz über die G0/G1- und S-Phase zur G2/M-Phase hin stark ab (Abb. 29 A und B). Dies bedeutet, dass in diesen Phasen sowohl die cap-abhängige als auch die IRES-cap-abhängige Translation in den Zellen reduziert wird. Das wäre dadurch zu erklären, dass der Schwerpunkt in der S-Phase auf der DNA-Replikation und in der Mitose-Phase auf der Zellteilung liegt. Somit wird das Maß der Proteinbiosynthese möglicherweise herabgesetzt.
Der Rückgang der Translationseffizienz kann allerdings nicht unbedingt mit der jeweiligen Synchronisierungsmethode begründet werden, da zum Beispiel eine Nocodazol-Behandlung der Zellen schnell reversibel ist (Zieve et al., 1980).
Außerdem ist die metabolische Aktivität der Huh7-Zellen relativ stabil (Abb. 29 C). Damit ergibt eine Normalisierung auf WST-1 sehr ähnliche Ergebnisse wie bei der Einzeldarstellung von FLuc und RLuc (Abb. 29 D und E) gezeigt ist.
Allein die Normalisierung der FLuc-Werte auf den Co-Reporter (Abb. 29 F) zeigt eine höhere Translationseffizienz in der G0/G1-, S- und G2/M-Phase im Vergleich zu einer Normalisierung auf WST-1 (Abb. 29 E). Besonders in der S-Phase ist die Translation dadurch auf 150 % gestiegen, während in den übrigen Phasen die Steigerung maximal 25 % beträgt.
Abb. 29 Effizienz der Translation der RLuc- und HCV-FLuc-RNA in Huh7-Zellen
(A) bis (F) dargestellt sind die gemessenen Aktivitäten der transfizierten Reporter-RNAs sowie die metabolische Aktivität mittels WST-1 in Huh7-Zellen. (A) Renilla-Expression in den verschiedenen Zellzyklusphasen bezogen auf nicht synchronisierte Huh7-Zellen. (B) Firefly-Expression in den verschiedenen Zellzyklusphasen bezogen auf nicht synchronisierte Huh7-Zellen. (C) WST-1 Messungen in den unterschiedlichen Zellzyklusphasen. (D) und (E) Normalisierung von RLuc bzw.
FLuc auf die metabolische Aktivität. (F) Normalisierung der FLuc-Daten auf den Co-Reporter RLuc.
Alle Werte beziehen sich jeweils auf nicht synchronisierte Zellen (n.s.), die auf 100 % gesetzt sind.
Durch Arbeiten mit der Kollegin C. Bung wurde gezeigt, dass sich die Renilla-Luziferase-Aktivität nicht in allen Experimenten unabhängig zur FLuc-Aktivität verhält, eventuell wegen einer gegenseitigen Beeinflussung der RNAs in trans.
Dadurch entstehen bei einer Normalisierung möglicherweise verfälschte Werte.
Da allerdings bei den Zellzyklus-Experimenten viele Faktoren zu berücksichtigen sind, wurde bei dieser Arbeit nicht auf eine Co-Transfektion verzichtet und die Daten jeweils einzeln betrachtet beziehungsweise nach unterschiedlichen Normalisierungen dargestellt.
Fazit: Die Translationseffizienz sowohl des HCV-Reporterkonstrukts als auch des Co-Reporters sind in der G0-Phase am höchsten und nehmen stark in der S- und G2/M-Phase ab, obwohl die metabolische Aktivität der Zellen deutlich geringere Schwankungen unterworfen ist. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass unterschiedliche Vorgänge während diesen beiden Phasen in der Zelle ablaufen. So liegt der Fokus in der S-Phase hauptsächlich auf der DNA-Replikation, während die Zellen in der G2/M-Phase die Zytokinese einleiten.
2.4.2.2 Die Effizienz der Cap- und IRES-abhängigen Translation in verschiedenen Zellzyklusphasen in HeLa-Zellen
Um die Effizienz der Translation der HCV-RNA in HeLa-Zellen zu überprüfen, wurden die Transfektionen wie bei den Huh7-Zellen beschrieben durchgeführt.
Die HeLa-Zelllinie wurde als Kontrolle verwendet, da diese keine endogene microRNA-122 exprimiert und somit die Translation des HCV-Konstrukts dadurch nicht beeinflusst werden kann. Zudem können eventuelle leberspezifische Faktoren ausgeschlossen werden.
In Abbildung 30 Teil A ist die Verteilung der Expression der Renilla-Luziferase gezeigt. Sie ist in den einzelnen Zellzyklusphasen ähnlich zu der Verteilung in Huh7-Zellen. Auch in HeLa-Zellen ist die Translationseffizienz in der G0–Phase am höchsten und nimmt zur G2/M-Phase hin drastisch ab. Betrachtet man die FLuc-Daten, ist ein deutlicher Unterschied zu Huh7-Zellen sichtbar. Die Translationseffizienz liegt hier sowohl in der G0- als auch in der G0/G1-Phase zwischen 38 - 52 %, wohingegen sie in der S-Phase bei 84 % liegt und zur G2/M-Phase wieder drastisch sinkt. Wie in Abbildung 30 Teil C ersichtlich ist, schwanken hier die WST-1 Messungen deutlich innerhalb des Zellzyklus.
Werden die RLuc- und FLuc-Werte auf WST-1 normalisiert, erkennt man, dass in Abb. 30 Teil D und E die Translationseffizienz in der G0- sowie in der S-Phase, im Vergleich zu den jeweiligen nicht normalisierten Werten (Abb. 30 A und B), stark sinkt. Die RLuc-Werte sinken in G0 auf 81 %, in der S-Phase auf 26 %. Die FLuc-Werte sinken in G0 auf 29 % und in der S-Phase sogar auf 19 %. Allerdings verändert eine Normalisierung der FLuc-Werte auf den co-transfizierten RLuc-Reporter die Translationseffizienz in eine andere Richtung (Abb. 30 F). Werden die Messungen auf diese Weise miteinander verglichen, steigt die Translation von FLuc in der S-Phase auf das Doppelte des Wertes in nicht synchronisierten Zellen an. Allerdings kommt dieser hohe Wert in der S-Phase hauptsächlich auch durch den starken Unterschied zwischen dem FLuc- und RLuc-Wert in der S-Phase zustande.
Fazit: Die Transfektionsergebnisse in HeLa-Zellen sind schwer zu interpretieren, da die WST-1 Messungen zwar schwanken, jedoch diesen Werten eher vertraut werden kann als dem co-transfizierten RLuc-Reporter, der anscheinend einen Einfluss auf die Translation der HCV-RNA hat. Somit ist eine Aussage der Normalisierung auf WST-1 glaubwürdiger.
Abb. 30 Effizienz der Translation der RLuc- und HCV-FLuc-RNA in HeLa-Zellen
(A) bis (F) dargestellt sind die gemessene Aktivitäten der transfizierten Reporter-RNAs sowie die metabolische Aktivität mittels WST-1 in HeLa-Zellen. (A) Renilla-Expression in den verschiedenen Zellzyklusphasen bezogen auf nicht synchronisierte HeLa-Zellen. (B) Firefly-Expression in den verschiedenen Zellzyklusphasen bezogen auf nicht synchronisierte HeLa-Zellen. (C) WST-1 Messungen in den unterschiedlichen Zellzyklusphasen. (D) und (E) Normalisierung von RLuc bzw.
FLuc auf die metabolische Aktivität. (F) Normalisierung der FLuc-Daten auf den Co-Reporter RLuc.
Alle Werte beziehen sich jeweils auf nicht synchronisierte Zellen (n.s.), die auf 100 % gesetzt sind.