Anmerkungen
2. Material und Methoden
2.3 Methoden
2.3.1 Arbeiten mit Organismen
2.3.1.9 Transfektions- und Transformationsmethoden
Agrobakterien-vermittelte Transfektion von Rhynchosporium commune
Für die Agrobakterien-vermittelte Transfektion von R. commune wurden zunächst Zellen des Agrobacterium-tumefaciens-Stammes AGL0, welche den gewünschten binären Vektor enthielten, in 5 ml LB zwei Tage bei 30°C angezogen. Dem Medium wurde zuvor Rifampicin und das auf das Plasmid selektierende Antibiotikum zugesetzt. Am Tag der Transfektion wurden 1:5-, 1:10- und 1:20-Verdünnungen der Bakterien-Suspension mit 1x Induktionsmedium/50 mM Acetosyringon hergestellt und die OD bei 660 nm bestimmt. Die Original-Kultur wurde mit 1x IM-Acetosyringon auf eine OD660 von 0,15 verdünnt und die Zellen weitere sechs Stunden bei 28°C schüttelnd inkubiert.
Zur Transfektion wurden sterile 0,45 µm-Filter auf zehn frisch gegossenen 1x IM-Platten ausgelegt. 100 µl einer konzentrierten R. commune-Sporenlösung (5x106 Sporen) wurden mit 100 µl der Agrobakterien-Suspension gemischt und auf dem Filter ausplattiert. Die IM-Platten wurden zwei Tage bei 19-25°C in Dunkelheit inkubiert.
Nach diesem Zeitraum wurden die Filter mittels einer sterilen Pinzette auf Limabohnenagarplatten umgesetzt, welche das auf positive Transformanden selektierende Antibiotikum, sowie Cefotaxim zum Abtöten der Agrobakterien enthielten (Mullins et al., 2001). Diese Platten wurden bei 17°C im Dunkeln inkubiert, bis Pilzkolonien zu sehen waren. Die pilzlichen Transformanden wurden dann auf neue Limabohnenagarplatten umgesetzt, welche nur noch das auf das eingesetzte Plasmid selektierende Antibiotikum enthielten.
Protoplastentransfektion von Rhynchosporium commune
Für die Protoplastentransfektion von R. commune musste zunächst Myzel des zu transfizierenden Pilzes angezogen werden. Dies geschah zehn Tage vor der Protoplastierung in großen sterilen Petrischalen, welche bei 17°C geschwenkt wurden.
Am Tag der Transfektion wurde das Myzel mit Hilfe steriler Einmal-Pipetten in 50 ml-Reaktionsröhrchen überführt, fünf Minuten bei 5000 rpm abzentrifugiert und gewogen.
Pro Protoplastierung sollten nicht mehr als 2-3 g Myzel eingesetzt werden. Das Myzel wurde in 20 ml Protoplastenpuffer 1 (B1) aufgenommen und bei 5000 rpm fünf Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment in 5 ml B1 resuspendiert.
Mit einem Ultraturrax wurde das Myzel fünf Sekunden bei voller Leistung homogenisiert und erneut bei 5000 rpm fünf Minuten abzentrifugiert. 125 mg des, pilzliche Zellwände abbauenden, Lysing Enzyme aus Trichoderma harzianum wurden steril abgewogen und in 10 ml B1 gelöst. Das homogenisierte Myzel wurde in 15 ml B1 aufgenommen, die, das Enzym enthaltende, Lösung zugegeben und selbige sechs Stunden bei 29°C und 40 rpm auf einem Schüttler inkubiert.
Nach der Protoplastierung wurde die gesamte Lösung durch einen sterilen Filter mit Glaswolle gegeben und mit 25 ml B1 nachgespült. Die Pilzprotoplasten wurden fünf Minuten bei 4800 rpm sedimentiert, danach vorsichtig in 30 ml B1 gelöst und erneut zentrifugiert (4800 rpm, 5 min). Der Überstand wurde verworfen und die Protoplasten in 0,5-2 ml (je nach Größe des Sediments) B1 resuspensiert. Der Titer der Lösung wurde mit einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer bestimmt und die Menge an erhaltenen Protoplasten wie bei einer Sporenlösung berechnet (s. Formel 2.1). Die Protoplasten wurden mit B1 auf eine Konzentration von 5x107 Protoplasten/ml eingestellt und für die Transformation eingesetzt.
200 µl der Protoplasten-Lösung wurden mit 1-2 µl des einzusetzenden Plasmids gemischt. Danach wurden 500 µl einer 50%igen PEG 6000-Lösung in Protoplastenpuffer 2 (B2) zugegeben und vorsichtig gemischt. Der Ansatz wurde in 140 µl-Aliquots auf zuvor gegossene Limabohnenagarplatten mit 0,6 M Saccharose gegeben und mit zusätzlichen 300 µl B2 verteilt. Die Platten wurden steril getrocknet, mit Parafilm verschlossen und bei 17°C inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das für die Selektion positiver Transformanden erforderliche Antibiotikum in einer Lösung mit 1x FRIES-Medium auf den Platten verteilt und diese 10-14 Tage bei 17°C und Dunkelheit stehen gelassen. Die nach dieser Zeit gewachsenen Pilztransformanden wurden auf neue Limabohnenagarplatten mit Antibiotikum umgesetzt und angezogen.
Verbleibende Protoplasten, welche nicht zur Transfektion eingesetzt wurden, konnten bei 4800 rpm vier Minuten sedimentiert und in einem je nach Sedimentgröße ermittelten Volumen 15%iger Glycerinlösung aufgenommen werden. Die Lösung wurde in 200 µl-Aliquots in mehrere 1,5 ml-Reaktionsgefäßen aufgeteilt und in einem
Isopropanol-Kryo-Gefäß langsam eingefroren. Die Pilzprotoplasten waren so bei -80°C noch einige Wochen haltbar und konnten für noch folgende Transfektionen eingesetzt werden.
Transformation von elektrokompetenten Escherichia-coli-Zellen
Elektrokompetente E.-coli-Zellen wurden mittels Elektroporation transformiert. Dazu wurden zunächst Quarzküvetten auf Eis abgekühlt. Die elektrokompetenten XL1-blue-Zellen wurden auf Eis aufgetaut. Zu transformierende Ligationsansätze wurden vorher bei 65°C im Heizblock fünf bis sieben Minuten abgestoppt. Plasmide konnten direkt zur Transformation eingesetzt werden. 30 µl der aufgetauten Zellsuspension wurden in eine Küvette pipettiert und 1 µl des Ligationsansatzes bzw. 0,5 µl einer Plasmidpräparation zugegeben. Die Küvette wurde in den Elektroporator gestellt und bei 2,5 kV und 25 µF geschockt. Danach wurden die Zellen sofort in 500 µl LB-Medium gegeben und bei 37°C im Heizblock eine Stunde geschüttelt. 50-100 µl des Transformationsansatzes wurden dann auf LB-Platten mit Antibiotika ausplattiert. Handelte es sich um einen Transformationsansatz mit Blau-Weiß-Selektion wurden zuvor auf den Platten noch IPTG sowie X-Gal ausgestrichen. Die Platten wurden 16 Stunden bei 37°C inkubiert.
Transformation von chemisch kompetenten Escherichia-coli-Zellen
Zu den auf Eis stehenden kompetenten DH5α-Zellen wurden 5 µl des Ligationsansatzes bzw. 1 µl einer Plasmidpräparation gegeben. Die Zellen wurden nun 20 Minuten im Eisbad aufgetaut und dabei einmal sehr sanft gemischt. Um den Transformationsansatz mit Hitze zu schocken, wurden die Zellen exakt eine Minute bei 41°C im Heizblock inkubiert. Danach stellte man die Zellen sofort auf Eis für zwei Minuten. Nachdem 650 µl raumtemperiertes LB-Medium zugegeben wurde, inkubierte man die Zellen eine Stunde bei 37°C schüttelnd im Heizblock. 100-200 µl des Transformationsansatzes wurden dann auf LB-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Transformation von chemisch kompetenten Agrobacterium-tumefaciens-Zellen
Kompetente Agrobacterium-tumefaciens-Zellen des Stammes AGL0 wurden auf Eis langsam aufgetaut. Circa 6 µg der Plasmid-DNA wurden zugegeben und der gesamte Ansatz in flüssigem Stickstoff für eine Minute schockgefroren. Ein Hitzeschock der Zellen erfolgte danach für sechs Minuten im 37°C-Heizblock. Nach Zugabe von 800 µl LB-Medium wurden die Zellen zwei Stunden bei 30°C geschüttelt. Danach konnten 100-200 µl des Transformationsansatzes auf LB-Platten mit Rifampicin sowie der transformierten Plasmid-DNA entsprechenden Antibiotika ausplattiert werden.