Anmerkungen
3. Ergebnisse
3.2 Charakterisierung des PFP1-Gens
3.2.2 Expressionsstudien
3.2.2.2 Studien zur PFP1-Expression ex planta
Abbildung 3.18: Grafische Darstellung der relativen Expressionsraten von PFP1 und NIP1 bezogen auf GPD in planta.
Die Abbildungen a–c zeigen die relativen Expressionsraten der R. commune-Gene PFP1 und NIP1 bezogen auf das konstitutiv exprimierte Referenzgen GPD während der drei unterschiedlichen Pilz-Pflanze-Interaktionen (UK7-Ingrid [a], UK7-Atlas [b] und UK7-Atlas 46 [c]) über einen Zeitraum von 21 Tagen nach Inokulation.
CGTATCTTGGCTTCCCAAGCAAGAGCTTGAGCAGTCCAAGACTGGAGCA -1480 ATTCTGACAGCGTCCACACCTCATTTTTGAACAACATCTTGGGACAATA -1431 CGTTCTCAAGCCATCTTCCGGCTTACTGTATGTTCCGCTCTAGTTACCA -1382 TCGGTGCGTCTAAGCACCGGAAATGGCCCAGGATTGCCACCAACATCAC -1333 CCTCGATGCTGTTTACTATCCCACCCGTCACAAGCCTAGGTAGATACCT -1284 GGCAGCAGAGAGGAATAGTGCTCAGGCCTGTGCCCTTTCGAAGCTGTTG -1235 AATTGCCGGGACTAAGCGGGGTTTGAGAGTGTTGATACGTAGAGCCAAC -1186 AAACTGATGAATATTGTATGTCGCACTATTAGAAGGGAACTGTCAGGCG -1137 ATCAAGAAGATTCAGCGGCCTAGAACAGAAAAAAAGTTGATAAGCACTA -1088 ATCGGTTAGCTTCTAATAATCTTGATGGCAGTTCGGGTATTGCGTTATG -1039 GATTGACCAGAGTAAGTCTGCAACAGCAGTCAACAGATCAACACCATCT -990 TTCGAGATAAAGCACCATAAGAGACGCTGCGACAACCACTGTGGCTGAC -941 GGACTGGCAATTAGGTTTCCGCGATGCTGTGCAACCCAGGTCTCCGTCC -892 CATTAGAGTGGTCTGGAAAGTCAGTCTTTGAGATGTCTTTCCATGGGTA -843 AGACTTGGCATGCAGGTCATTTAACCCGTCCCGCAGGGCCGCAGCGAAA -794 GCTTACTTCTGGTTCCACATATTCAAGGGGATAATAATGGCCCACAGTT -745 CAAGCAGGTCTTCTCGCAAATTCAGACTAGGGTTCTTGCAATATAACCG -696 TGTTGGACAATGGATGTAATGACCATGGAAAGAACAGAGTACGAAGTAT -647 GTATCCCCTAAAATTGCCTCGTCAGTGATCTCATATAGATAAAGCGGAA -598 CTACTATAATTGCAACATGAGAAGTCGAAATACCTCTCACAAACAACAA -549 GATACTATGCCTCGAAGAGTGCCTCGAAGAGGCTCGAAGAGGATGTAAC -500 GCTAGTCGTGATTCGGGAAATAGAAGCCAGAAGTTTTGATGGATTACTC -451 CCGTAATACTAGATTGCAGAGACAGCGATGGAAATTTCAAGTGTCAATT -402 GAAAGAGACACCTGCACAGAGTATAAGCGGGCTCGCTTGCGTGAGCGAT -353 ACCTCATATCTGCCAAGCTTTTGCTATCATGTGATCTGCTTAGCAAGTT -304 ACATACCCCTGTCCCGGCTGTAGATGTTGGATCCTGAACGTCTCGCGAC -255 TGACTACAGAACGTTTGCTCATCAGTGGTACTGCGAGCTCATGTTCAGC -206 ACGTTGTTCGAGTAGACGGCTCAGATCAACTCGTCCTCAACCTGCGGTC -157 ACGCGTCAAGCGCGACAACTTCATCGGCTCCTTCCGATGCGCTTAACTC -108 AATACCCGGGCAGCGACCTTGCACCTCACCCCTAGGTCTCCACGCGCCG -59 AACCCCACTAGAATCCGTTCAACTTTCGACAGATTGCCCATACCGATTG -10 CAGAAGACGATG 1
Abbildung 3.19: 5‘-untranslatierter Bereich der PFP1-Gensequenz mit putativen regulatorischen Elementen.
Die Abbildung zeigt die 1528 bp lange Promotorsequenz des PFP1-Gens. Das erste translatierte Basentriplett ist mit 1 bezeichnet (ATG – rot markiert). Die Basen -1 bis -1528bp umfassen den 5‘-untranslatierten Bereich des Gens. Farbig unterlegt sind durch in silico-Analysen identifizierte putative Promotorelemente (Erklärung siehe Tabelle 3.1).
Promotor-(cis-) Element (Erkennungssequenz)
Funktion in anderen Pilzen Literatur
PRE- (Pisatin responsive element) ähnliches Motiv ( 3x CCG Tripletts)
Pisatin-Detoxifizierung in Fusarium solani
Khan et al,. 2003
TATA-Box (TATAA) Core-Promotorelement;
Aflatoxin-Biosynthese in Aspergillus parasiticus;
Hyphenentwicklung in Candida albicans
Leng et al., 1998 Miller et al., 2005
CREA-Consensus-Sequenz (SYGGGG; S = C/G, Y = C/T)
Kohlenstoff-Sekundärstoffwechsel artenübergreifend
Cubero & Scazzocchio, 1994 Mathieu & Felenbok, 1994 Mathieu et al., 2000 Palindrom-Sequenz
(TCG(N5)CGA);
abgewandelte CGG-Triplett-Sequenz (CGG(Nx)CCG
Mykotoxin-Biosynthese Aspergillus nidulans
Fernandes et al., 1998
GATA-Box ([TA]GATA)
Stickstoff-Sekundärstoffwechsel artenübergreifend
Marzluf, 1997 Haas et al., 1999 Feng et al., 2000
Pérez-Garcia et al., 2001 Soanes et al., 2002 Snoeijers et al., 2003 Mihlan et al., 2003 (CAAT-Box ([C]CAAT) Core-Promotorelement;
Penicillin-Biosynthese Aspergillus nidulans
Brakhage et al., 1999, 2005
Bristle response element BRE (MRAGGGR; M=C/A, R=G/A)
Entwicklung
Regulierung der Sporulation Magnaporthe grisea
Chang & Timberlake, 1992 Soanes et al., 2002
Stress-responsive element STRE (CCCCT)
Stressantwort Neurospora crassa
Girvitz et al., 2000
Hexanukleotidsequenz (GCCAAG), PacC-Consensus = GCCARG;
R = G/A
pH-Regulation Aspergillus nidulans;
Cephalosporin-Synthese und pH-Regulation Acremonium chrysogenum
Tilburn et al., 1995 Espeso et al., 1997 Schmitt et al., 2001
Tabelle 3.1: Zusammenstellung und Position der in silico identifizierten putativen Promotorelemente des 5‘-untranslatierten Bereiches der PFP1-Gensequenz.
Abbildung 3.20a
Abbildung 3.20b
Abbildung 3.20: Schematische Darstellungen der PFP1-Genstruktur und der für die Promotorfusion verwendeten Oligonukleotide sowie des Promotorfusionskonstrukts pJET1.2/blunt-PPFP1::eGfp.
Abbildung 3.20a zeigt schematisch die gesamte bekannte genomische PFP1-Sequenz (5977 bp) sowie die Bindestellen der für die Amplifikation des 5‘-untranslatierten Bereiches (1528 bp) verwendeten Oligonukleotide O1s und O2as (PFP43s und PFP44as).
E1 und E2 – Exon 1 und 2; I – Intron.
Das Promotorfusionskonstrukt pJET1.2/blunt-PPFP1::eGfp ist in Abbildung 3.20b dargestellt. Der gesamte 5‘-untranslatierte Bereich des PFP1-Gens (P5’UTR1-1528 bp) wurde vor die kodierende Sequenz des AvEGFP-Gens (G) kloniert, welche zuvor zusammen mit der Hygromycin-B-Resistenzkassette (H) in den Klonierungsvektor pJET1.2/blunt ligiert wurde.
T – Terminatorsequenz des TRPC-Gens aus Aspergillus nidulans (TtrpC),, P – Promotorsequenz PgpdA des Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenasegens aus Aspergillus nidulans, A – Ampicillin-Resistenzkassette
R
Die Abbildung 3.21 zeigt Hellfeld- und fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Pilzstrukturen die die Promotorfusion pJET1.2/blunt-PPFP1::eGfp exprimieren sowie der Positivkontrolle UK7-Pgpd::eGfp (Vektor pRcEGFP1). Alle untersuchten Transformanden zeigten vergleichbare Resultate, so dass hier stellvertretend nur die Aufnahmen der Transformande #49 dargestellt sind. Wie man erkennen kann, wird EGFP über den gesamten Versuchszeitraum in den Pilzzellen der Positivkontrolle auf nahezu gleichem Niveau exprimiert. Betrachtet man im Vergleich dazu die Transformande #49, kann man eine starke Fluoreszenz zunächst in den Sporen erkennen, welche sich auch in den folgenden drei Zeitpunkten nachweisen lässt (Abb. 3.21a, A-D), jedoch im weiteren Versuchsverlauf bis zum Tag 21 abnimmt (E-G). Die Pilzhyphen zeigen nur noch eine schwache EGFP-Fluoreszenz unter UV-Licht, was zunächst auf eine abnehmende Promotoraktivität hinweist. Im Vergleich zur Positivkontrolle wird EGFP in der Transformande also offenbar nicht über den gesamten Versuchszeitraum in gleichbleibender Rate exprimiert.
Die mikroskopischen Aufnahmen zeigen, dass der 5‘-untranslatierte Bereich des PFP1-Gens als Promotor fungiert und auch unter Kulturbedingungen die Genexpression reguliert. Daraus lässt sich schließen, dass PFP1 auch ex planta exprimiert wird. Dies allerdings auf einem sehr geringen Niveau, was wiederum auf eine regulatorische Funktion des Pfp1-Proteins im Lebenszyklus des Pilzes schließen lässt, die unabhängig von der Interaktion mit der Wirtspflanze zu sein scheint.
Abbildung 3.21a
Abbildung 3.21b
Abbildung 3.21: Hellfeld- sowie fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Transformande UK7-pJET1.2/blunt-PPFP1::eGfp #49 und der Positivkontrolle UK7-Pgpd::eGfp ex planta.
Die Abbildungen zeigen die mikroskopischen Aufnahmen der die PFP1-Promotorfusion tragenden Transformande #49 (Abb. 3.21a) sowie der Positivkontrolle UK7-Pgpd::eGfp (Abb. 3.21b) sowohl im Hellfeld als auch unter UV-Licht (Ex450-490nm, Em515nm; Filterset 9; Axio Imager). A-G entsprechen den jeweils gewählten Zeitpunkten von 0 bis 21 Tagen nach Beimpfung des Flüssigmediums.
Maßstabsbalken – 50 µm
Um die Mutanten sowie die Positivkontrolle neben den mikroskopischen Untersuchungen auch quantitativ analysieren zu können, wurden EGFP-Fluoreszenz-Messungen durchgeführt. Dafür wurden drei der Transformanden (Promotorfusionen UK7-pJET1.2/blunt-PPFP1::eGfp #22, #49, #67) und die Kontrolle UK7-Pgpd::eGfp in einer Multiwell-Zellkulturplatte im Flüssigmedium über 21 Tage angezogen. Pro Well wurden 1x104 Konidiosporen angeimpft und die Platte bei 17°C und Dunkelheit inkubiert. Pro Transformande wurden sechs technische Replikate angesetzt. Mit der Positivkontrolle wurde ebenso verfahren. Die EGFP-Fluoreszenz des gewachsenen Pilzmyzels wurde mit einem CytoFluor™II Fluoreszenz-Messgerät (PerSeptive Biosystems) bestimmt. Als Kontrollwert diente bei jeder Messung steriles Flüssigmedium. Alle gemessenen Werte der Einzelreplikate wurden schließlich zu jedem Zeitpunkt gemittelt und die für das Flüssigmedium bestimmte Eigenfluoreszenz davon abgezogen. Der zeitliche Verlauf der Messungen ist in Abbildung 3.22 grafisch dargestellt. Über den gesamten Zeitraum steigen die Fluoreszenz-Werte stetig an. Dabei zeigt die Positivkontrolle UK7-Pgpd::eGfp den höchsten Anstieg. EGFP wird über den gesamten Versuchsverlauf mit steigender Biomasse des Pilzes konstitutiv exprimiert. Erst nach 21 Tagen ist ein leichter Abfall der Werte zu verzeichnen. Dies liegt höchstwahrscheinlich an dem langen Untersuchungszeitraum, in welchem der Pilz stetig wächst und demzufolge die Nährstoffe des Mediums nahezu verbraucht hat. Dies schränkt das Wachstum und schließlich auch die Genexpression ein. Die Transformanden zeigen ähnlich der Positivkontrolle auch einen stetigen Anstieg der gemessenen EGFP-Fluoreszenz. Die Werte sind aber geringer als bei der Kontrolle und deren Anstieg flacher. Anders als nach den Mikroskopie-Aufnahmen zunächst vermutet, ist der PFP1-Promotor demzufolge auch ex planta konstitutiv aktiv, exprimiert jedoch auf einem geringeren Niveau als der GPD-Promotor. Die ansteigenden Kurven reflektieren zudem das Wachstum der untersuchten Pilze. Die Expressionsrate bleibt damit unter Einbeziehung der sich sehr wahrscheinlich erhöhenden Biomasse zu jedem Zeitpunkt nahezu gleich. Die EGFP-Expression unter Kontrolle des PFP1-Promotors nimmt also nicht ab, wie zunächst angenommen wurde. Eine Erklärung dafür könnte die Tatsache sein, dass in der Multiwell-Platte die EGFP-Fluoreszenz des gesamten zu diesem Zeitpunkt vorhandenen Myzels gemessen wird. Unter dem Mikroskop jedoch nur ein Teil einer Hyphe betrachtet wird, deren Fluoreszenz bei geringerem Expressionsniveau häufig schwächer erscheint.
Abbildung 3.22: Grafische Darstellung der EGFP-Fluoreszenz der die Promotorfusion exprimierenden Transformanden UK7-pJET1.2/blunt-PPFP1::eGfp #22, #49 und #67 sowie der Positivkontrolle UK7-Pgpd::eGfp.
Die Abbildung zeigt grafisch die Entwicklung der relativen EGFP-Fluoreszenz ([au] – absorbance units) über einen Zeitraum von 21 Tagen nach Beimpfung des Flüssigmediums. Dargestellt sind die Promotorfusionen UK7-PPFP1::eGfp #22, #49 und #67, sowie die Positivkontrolle UK7-Pgpd::eGfp, welche das EGFP-Gen unter Kontrolle des GPD-Promotors aus A. nidulans exprimiert. Die Werte wurden jeweils aus sechs Einzelreplikaten gemittelt. Das Diagramm zeigt die Ergebnisse aus einem biologischen Experiment, da nur Sporen einer Isolierung zum Animpfen zur Verfügung standen.