Sequenzierung und Erschliessung des Intron III/ FcγRIIIb

vollständig vermeiden. Damit die Anzahl dieser unspezifischen DNA- Fragmente vergleichsweise klein blieb, wurde die XL- PCR im Hotstart- Verfahren durchgeführt.

Anschliessend konnte das PCR- Produkt auf 1.5%-igem Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt unter einer UV- Lampe sichtbar gemacht werden. Als molekularer Längenmarker diente der MWVI von Boeringer- Mannheim (Abb. 4.12).

1 2 3

2176

~3300

(Abb. 4.12:) Auftrennung des mit dem Primerpaar SSP1 und RP6 amplifizierten PCR- Produkts von Intron III. In Reihe 1 ist der molekulare Längenmarker VI von Boeringer- Mannheim zu sehen. In Reihen 2 und 3 ist das entsprechende PCR- Produkt des Intron III zu sehen.

4.6.1.2 Aufreinigung des PCR- Produktes

Unspezifische Produkte führen in der Sequenzierung zu Überlagerungsphänomenen mit dem Resultat einer schlechteren Lesbarkeit der Sequenz. Eine Möglichkeit unspezifische Produkte von dem gewünschten Produkt zu entfernen, ist die Aufreinigung der PCR- Amplifikate. Dazu wurde die Bande, die Berechnungen nach dem Intron III entspricht, zunächst auf 1%-igem Seakem Agarosegel aufgetrennt und anschliessend aus dem Gel exzidiert. Die Elution und Aufreinigung der DNA- Fragmente aus dem Gel erfolgte mit dem QIAquick Gel Extraction Kit nach Angaben des Herstellers. Nach Lösung des aufgereinigten Produktes in 30µl sterilem Aqua dest. wurde die Konzentration des DNA- Amplifikates durch optischen Vergleich bestimmt.

4.6.2 Sequenzierung des Intron III

Für die Sequenzierungs- PCR des Intron III wurde das aus dem Primerpaar SSP1 und RP6 gefertigte Template als Matrize verwendet. Für die erste Sequenzierung wurde der Vorwärtsprimer SSP1 benutzt. Danach wurden die Vorwärtsprimer in die jeweils neu erschlossenen Sequenz gelegt. Es zeigte sich, dass der Rückwärtsprimer RP6 für eine Sequenzanalyse ungeeignet ist und keine lesbaren Ergebnisse erbrachte. Vergleichbare, FcγRIIIb- spezifische Primer liegen jedoch zu weit von der zu analysierenden Sequenz entfernt, so dass auf einen Rückwärtsprimer verzichtet wurde (Tab. 4.17).

4.6.2.1 Für die Sequenzanalyse verwendete Primer

Die Wahl der Primer für die Sequenzierung richtete sich nach folgenden Kriterien. Zunächst sollte im Primer ein möglichst ausgewogenes Verhältnis zwischen den Basen Guanin, Cytosin, Adenin und Thymin vorhanden sein. Je höher der Gehalt an Guanin und Cytosin im Primer ist, desto höher ist auch seine Schmelztemperatur und folglich seine Spezifität. Weiterhin sollten sich Anfang und Ende des Primers nicht komplementär zueinander verhalten, um das Auftreten von Primer- Dimeren zu verhindern, die als mögliche Störfaktoren beim Ablesen der Sequenz auftreten könnten. Letzlich sollte die Länge des Primers eine Anzahl von mindestens 15bp nicht unterschreiten, um eine spezifische Bindung an die Matrize zu gewährleisten. Sämtliche Primer stammen von der Firma Oligo MWG, Ebersberg (Tab. 4.18).

Primer Nucleotidsequenz, 5´→3´ Position (bp) Spezifität Annealing VP Int. III-1 TCCATATCGGTGAGTTGATG Exon 3, 344-

Intron III, 12; FcγRIIIb

FcγRIIIb/

Intron 3

57.3°C

VP Int. III-2 CTGTCAGACAGTAGATATAG 178- 197 Intron III 53.2°C VP Int. III-3 TGACCTCAGGTGATTCGC 545- 571 Intron III 56.0°C VP Int. III-4 ACAATCTTACCACATAGGC 938- 953 Intron III 52.4°C VP Int. III-5 GAAGGCAGGGGTCTT 971- 982 Intron III 50.6°C VP Int. III-6 GCATAAGGAGGTGGATCT 1082- 1099 Intron III 53.7°C VP Int. III-7 TCACTCTCCAGAGCTACAA 1190- 1209 Intron III 54.5°C VP Int. III-8 TAAACTTCTGAGCAT 1423- 1437 Intron III 39.6°C VP Int. III-9 AGACAGGGTTTCACGGCATT 1701- 1720 Intron III 57.3°C VP Int. III-10 GCTTGATGAAATATCAC 2029- 2045 Intron III 45.5°C VP Int. III-11 GATATCTCTTAATAGGTAAT 2221- 2240 Intron III 47.1°C

(Tab. 4.18:) Für die Sequenzierung des Intron III verwendetet Vorwärtsprimer. Basen, die einen HNA- Polymorphismus ausdrücken, sind unterstrichen. Die angegebenen Annealing- Temperaturen sind von den Herstellern übernommen worden.

Die Positionsangaben beziehen sich auf den FcγRIIIb und die weiter unten aufgeführte Sequenz des Intron III.

4.6.2.2 Sequenz des Intron III

Die durch eigene Sequenzierungsarbeit erschlossene Sequenz des Intron III ist in (Abb 4.13) aufgeführt.

BP ←Exon 3 bp351↓ ↓1bp Intron III→ BP

GAAGTCCATATC ggtgagttga tgaaggggaa gaggaaaatc accaataaag 40 41 ggtgaaacaa agggtcctga aatacttggt aagagccaga gatgatattc ttagagataa 100 101 aagctaagat gagatgatgt gtggcccact gaatggtatc agagttgtag tcctagctct 160 161 aagtaggtct tggcaaaatg tcaaagcctg tcagacagta gatataggac tgctgcattg 220 221 acaattccaa gaatcccata tggagtgcat acaatgtgaa tgtgtcatgt gaagttaggc 280 281 catggcatag atgctcaata atagttattt atttatttat tttcattttt cttaatttta 340 341 ttttttgaga cagagtatca ctctctcacc caggctggag ttgcaatgcc ggcaatctca 400 401 gcttacttgc aaccttctgc ccccttgggt ttgaaggtga ttctcctgcc ttaagcctcc 460

401 gcttacttgc aaccttctgc ccccttgggt ttgaaggtga ttctcctgcc ttaagcctcc 460 461 cgagtagctg agattacagg cacccgccac cacgcccagc taattttgta tttttagtag 520 521 agacagggtt tcaccatgtt ggtcaagtct ggtctcaaac tcctgacctc aggtgattcg 580 581 cccggccttg gcttcccaaa gtgctgggcc tacaggcgtg agccaccaca cctggggcca 640 641 ataattttta taggaataaa ttaatgaatt tggtgttagg gacctcaatc tccttctcgc 700 701 tctcagacat gtaatgccct aagccacctc ccaaagcaat cctagtggcc tagaatcata 760 761 tctttctgtc tcctcatcaa tgctatactc aaacctataa ttaagcataa atttgggtaa 820 821 tgtgatagct cttcccatag aggcagatac atgttcagcc tgcacattaa tcatgacatg 880 881 aaagtccttg gtgtactatt taacagaatt attaggacat cagaccacca ggtaggaaga 940 941 aatattttga aggcaggggt ctttcctggg tctgtgcctc atcttaccca tagcctggtc 1000 1001 cctgcagtgt cgccctgcaa acctaattct acttccacgg ctgttccatt catacaatgt 1060 1061 ttatgggtgg aacaagcttt gggggaagaa gggcataagg aggtggatct gcaagagagc 1120 1121 tccatggaat tgggcctctg aaactgattt ttgtgggctc tttgggcctc tgacagtacc 1180 1181 actcaactgg acatgggtct tcactctcca gagctacaag aagggtatgt ccatttctag 1240 1241 ctaggtaaga gatgccacct acaaccaaat aataatcgag cacggattac caagcagaaa 1300 1301 gcagtagcat aatatcagct ctaggagtta gctacgttta gccttgaact tggcatctag 1360 1361 aaactggctt tagaagtcta gccaatcaag gctatattaa actgtgacca tgagaattag 1420 1421 cttcaccagt gtaaacttct gagcatcact ttattccttt aggacccatt tgacttatgt 1480 1481 cctcctctga gaagcacttt ttacttcttt gtttgtttgt ttgtttttgt ttttgttttt 1540 1541 gagacagagt ttctctctgt cacccaagct ggagtgcagt ggcgcaatct tggttcactg 1600 1601 caacctccac ctcccgggtt ccagcgattc tcctgcttca gcctcccaac tagctgggac 1660 1661 tacaggtgca tgccaccacg cccggctaat tttttgtatt tttagtagag acagggtttc 1720 1721 acggcattag ccaggatggt cttgatctcc tgactcgcga tctgctactt catcctcccc 1780 1781 aagtactagg attacagatg tgagccaccg cgcccagcct gcatttttta cttctttcag 1840 1841 gcagaatttc tttattccaa tctagtcggc cccgcagtcc tttattctta gcctgttgta 1900 1901 gcactcgtca tattgtattg tgattatttc tgaatattta tgtttctatg tctaggctgt 1960 1961 agattctttg aggctgagaa ctatatgtcc catcatctgg gtatctccag tccacagtgt 2020 2021 gtcatacata gtgagtgctt gatgaaatat cacttgaagg aatatacaca tgggcattca 2080 2081 ctgagtccat gacaggacag attcgaacaa gaatgttcct ccaaaggcca ccagactata 2140 2141 tactaaccat gactttatgc taataatgat tcatctcttt gctgaaaaag taagtggata 2200 2201 gataggcaca tggcttcttt tgataaatga tatctcttaa taggtaatga agattacttt 2260 2261 ctgtttggca aatctttgtg ttagagaatc atgaccaaca cacgtcctac caattttgtt 2320

2321 tagcatca 2380

(Abb. 4.13:) Sequenz des Intron III. Die zum Exon 3 gehörigen Basen sind GROSS-, die Basen des Intron III sind kleingeschrieben. Die Basen sind jeweils in Blöcken von 10bp angeordnet. Die eigene Sequenz befindet sich in den mit Positionsangaben markierten Spalten.