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C Ergebnisse

2 Lokalisation und Regulation der Dam-MTase

2.2 Regulation der Expression der Dam-MTase

Ergebnisse 99

Standard

Lamda-DNAdam+ Lambda-DNAdam- Lambda-DNAdam-+ SAH + DAM-MTaseMutante + DpnI

Lambda-DNAdam-+ DpnII

Lambda-DNAdam-+ DpnI Lambda-DNAdam-+ SAH + DAMGFP + DpnII

Lambda-DNAdam-+ SAH + DAMGFP + DpnI Lambda-DNAdam-+ SAH + DAM-MTaseMutante + DpnII Lambda-DNAdam-+ SAM + DAM-MTaseMutante + DpnI Lambda-DNAdam-+ SAM + DAM-MTaseMutante + DpnII

Lambda-DNAdam-+ SAM + DAMGFP + DpnII Lambda-DNAdam-+ SAM + DAMGFP + DpnI

Standard

Lamda-DNAdam+ Lambda-DNAdam- Lambda-DNAdam-+ SAH + DAM-MTaseMutante + DpnI

Lambda-DNAdam-+ DpnII

Lambda-DNAdam-+ DpnI Lambda-DNAdam-+ SAH + DAMGFP + DpnII

Lambda-DNAdam-+ SAH + DAMGFP + DpnI Lambda-DNAdam-+ SAH + DAM-MTaseMutante + DpnII Lambda-DNAdam-+ SAM + DAM-MTaseMutante + DpnI Lambda-DNAdam-+ SAM + DAM-MTaseMutante + DpnII

Lambda-DNAdam-+ SAM + DAMGFP + DpnII Lambda-DNAdam-+ SAM + DAMGFP + DpnI

Abb. 19:Agarosegelelektrophoretische Analyse des in vitro Aktivitätstest

Ergebnisse 100 verwendet, welcher diese Bedingungen erfüllt (besitzt eine Kanamycin Resistenz). Um diesen Vektor als Donorplasmid verwenden zu können, musste eine I-SceI Schnittstelle und eine zweite Region eingeführt werden, über die die Homologe Rekombination stattfinden kann. Als eine Rekombinatonsregion stand bereits der dam Teil des damGFP-Fusionsprotein Gens zur Verfügung. Um die Homologe Rekombination durchführen zu können, wurde am 3`- Ende des damGFP-Fusionsprotein Gens ein Teil der genomischen Sequenz von E.coli einkloniert, der 3`

auf das Gen für die Dam-MTase folgt (siehe Abb. 20 und B 10.4.1 und 2.2.1)).

Gen für das

damGFP-Fusionsprotein +

genomische Sequenz 3`

des dam-MTase Gens I-SceI

Schnittstelle

Gen für das damGFP-Fusionsprotein

I-SceI

Schnittstelle I-SceI Schnittstelle Gen für das

damGFP-Fusionsprotein Genomische Sequenz 3`

des dam-MTase Gens I-SceI Verdau

Gen für die dam-Mtase E.coliGenom

Gen für das damGFP-Fusionsprotein E.coliGenom

Homologe Rekombination durch die ? Red gene Gen für das

damGFP-Fusionsprotein Gen für das

damGFP-Fusionsprotein +

genomische Sequenz 3`

des dam-MTase Gens I-SceI

Schnittstelle

Gen für das damGFP-Fusionsprotein

+

genomische Sequenz 3`

des dam-MTase Gens I-SceI

Schnittstelle

Gen für das damGFP-Fusionsprotein

I-SceI

Schnittstelle I-SceI Schnittstelle Gen für das

damGFP-Fusionsprotein Genomische Sequenz 3`

des dam-MTase Gens I-SceI Verdau

Gen für die dam-Mtase E.coliGenom

Gen für die dam-Mtase Gen für die dam-Mtase E.coliGenom

Gen für das damGFP-Fusionsprotein E.coliGenom

Homologe Rekombination durch die ? Red gene

Abb. 20:Schema der Insertion des Gens für das DamGFP-Fusionsprotein in das E.coli Genom

2.2.1 Herstellung des Donorplasmides

Für das Donorplasmid wurde wie in B10.4.1 beschrieben ein Teil der genomischen Sequenz 3`des Dam-MTase Gens amplifiziert. Mit dem Antisense-primer wurde die I-SceI Schnittstelle und die XhoI Schnittstelle eingefügt. Mit dem Sense-Primer wurde die NotI Schnittstelle eingefügt. Anschließend wurde die amplifizierte Sequenz über die NotI und XhoI Schnittstellen in den Vektor pET28a damGFP am 3`-Ende des

Ergebnisse 101

damGFP Gens kloniert. Der Erfolg der Klonierung wurde durch eine Testspaltung mit XhoI und NotI bestätigt. Außerdem wurde eine erfolgreiche Testspaltung mit I-SceI durchgeführt. Damit konnte bestätigt werden, dass das Plasmid linerarisiert werden kann, was eine Vorraussetzung ist für eine erfolgreiche Homologe Rekombination.

Eine Sequenzierung des Donorplasmides ergab außerdem eine korrekte Sequenz.

2.2.2 Herstellung des Plasmides HR Kontrolle

Um zu überprüfen, ob die Homologe Rekombination mit dem verwendeten System funktioniert, wurde ein Kontrollplasmid hergestellt. Dazu wurde wie in B???

beschrieben durch zielgerichtete PCR-Mutagenese eine stille Mutation in das dam-MTase Gen auf dem Vektor pET28a dam WT eingeführt. Dadurch wurde die einzige BamHI Schnittstelle des Vektors zerstört. Bei einer erfolgreichen Mutation sollte demnach keine Linearisierung des Vektors mehr erfolgen. Durch den Sense-Primer wurde die Mutation (siehe B 10.4.1.2), durch den Antisense-Primer wurde die I-SceI Schnittstelle eingeführt. Um die Einführung der Mutation zu überprüfen wurde das dam-MTase Gen amplifiziert und anschließend mit BamHI gespalten. Als Kontrolle wurde das nicht mutierte Gen in der gleichen Weise behandelt. Aus den Kolonien die keine Linearisierung des Plasmides zeigten, wurde das Plasmid isoliert und mit I-SceI gespalten. Die Plasmide konnten erfolgreich gespalten werden. Eine Sequenzerung der positiven Plasmide bestätigte außerdem den Erfolg der Mutagenese.

2.2.3 Durchführung der Homologen Rekombination

Die Homologe Rekombination mit dem Donorplasmid wurde wie in B 10.4.2 beschrieben insgesamt sieben Mal durchgeführt. Es wurde sowohl der E. coli Stamm JM 109 (Versuche eins bis fünf), als auch K12 (Versuche sechs und sieben) für die Kotransformation des Plasmides pACBSR und des Donorplasmids bzw. des Plasmids HR Kontrolle verwendet. Eine der Kolonien, die beide Plasmide aufgenommen hat, wurde in LB-Medium resuspendiert und ein Teil dieser Resuspension wurde auf eine Cam-Agarplatte, eine Kan-Agarplatte, eine Cam/Kan-Agarplatte und eine LB-Agarplatte ohne AB ausplattiert. Diese Platten wurden ü/N bei 37°C inkubiert und am folgenden Tag ausgezählt. Dabei sollten auf der Agarplatte ohne AB und auf der

Ergebnisse 102 Agarplatte mit Cam und Kan gleich viele Kolonien gewachsen sein. Dadurch ist zu erkennen, wie viele Bakterienzellen beide Plasmide aufgenommen haben und stellt eine Kontrolle für die Kotransformationseffizienz dar. Es wurde auf den Platten bei allen Durchführungen des Versuchs immer zwischen 150 und 200 Kolonien gezählt.

Was bedeutet, dass die meisten Zellen beide Plasmide aufgenommen haben. Die Induktion der I-SceI Homingendonuklease und der λ Red Gene erfolgte mit Arabinose für 7 Stunden (Versuch eins bis drei und fünf bis sieben), 11 Stunden (Versuche vier und sieben) bzw. 12 Stunden (Versuche fünf und sechs). Die Kultur wurde anschleißend 1:10000 verdünnt und auf verschiedene Agarplatten ausplattiert. Von den LB-Agarplatten ohne AB jeden Versuchs wurden bis zu 100 Kolonien gepickt und auf eine Insertion des Gens für das DamGFP-Fusionsprotein getestet. Sollte das Gen für das DamGFP-Fusionsprotein sich in das Genom integriert haben würde man ein Amplifikat der Länge 2297 bp erwarten. Falls das Gen für das Fusionsprotein nicht integriert wurde, würde man ein Amplifikat der Länge 1574 bp erwarten. Es zeigte sich in allen Fällen ein Amplifikat der Länge 1574 bp. Das bedeutet, dass das Gen für das DamGFP-Fusionsprotein nicht in das Genom integriert werden konnte. Ein möglicher Grund für das Scheitern der Integration des Gens für das DamGFP-Fusionsproteins könnte die Größe der zu insertierenden Sequenz gewesen sein. Um zu überprüfen, ob dieses System funbktioniert wurde die Homologe Rekombination mit einem anderen Donorplasmid durchgeführt (HR Kontrolle), welches eine stille Mutation innerhalb des Gens für die Dam-MTase trägt, wodurch die BamHI Schnittstelle innerhalb des Gen entfernt wurde.

Die Homologe Rekombination mit dem Mutageneseplasmid und dem Plasmid HR Kontrolle als Donorplasmid wurde ein Mal in dem Stamm E.coli K12 durchgeführt. Die Agarplatten t=0 konnten nicht ausgezählt werden, da ein dichter Bakterienrasen gewachsen war. Die Induktion der I-SceI Homingendonuklease und der λ Red Gene erfolgte für sieben Stunden. Anschließend wurde wie in B.?? beschrieben, die Kultur in 1: 10000 Verdünnung auf verschiedene Agarplatten ausplattiert. Es wurden von der LB-Agarplatte ohne AB 100 Kolonien gepickt und auf eine Agarplatte mit und ohne Kan ausplattiert, um zu überprüfen, welche der Kolonien das Donorplasmid verloren hatte. Diese Kontrolle war notwendig, da zur Überprüfung ob die Homologe Rekombination durchgeführt wurde, das Gen für die Dam-MTase amplifiziert und anschließend mit BamHI gespalten wurde. Hätten die Zellen das Donorplasmid noch in sich getragen, könnte man nicht sicher sein, ob das Amplifikat von dem

Ergebnisse 103 Donorplasmid oder dem Genom stammt. Von den Kolonien, die nicht auf der Kan-Agarplatte gewachsen waren und somit das Donorplasmid nicht mehr in sich trugen, wurde das dam-MTase Gen amplifiziert und anschließend mit BamHI gespalten.

Wenn die Homologe Rekombination erfolgreich verlaufen wäre, würde man keine Spaltung des PCR-Produktes sehen, da durch die stille Mutation die BamHI Schnittstelle entfernt wurde. Bei allen untersuchten Kolonien und der Negativkontrolle war allerdings eine Spaltung des PCR-Produktes zu sehen, was bedeutet, dass die BamHI Schnittstelle noch vorhanden war und die Homologe Rekombination nicht stattgefunden hat. Dass die Homologe Rekombination auch in diesem Falle nicht funktioniert hat, legt den Schluss nahe, dass das Scheitern der Integration des Gens für das DamGFP-Fusionsprotein nicht an der Größe der zu insertierenden Sequenz lag, sondern anscheindend das System an sich in meinem Falle nicht funktioniert hat.

Da die Sequenzierung der Donorplasmide eine korrekte Sequenz bestätigte und sich die Donorplasmide auch mit der Homingendonuklease I-SceI in vitro spalten ließen, kann ein Fehler auf Seiten der Donorplasmide ausgeschlossen werden. Ein möglicher Grund für das Scheitern könnte das Mutageneseplasmid sein. Es wurde mir von Prof.

F.R. Blattner zur Verfügung gestellt. Möglicherweise wurde ein fehlerhaftes oder falsches Plasmid zugesandt.