Präparative Anreicherung

Der größte Nachteil der NMR ist ihre Unempfindlichkeit. Um auswertbare ¹³ C-NMR-Spektren zu erhalten, sind in Abhängigkeit vom Meßgerät oftmals Substanzmengen im Bereich von 1-10 mg erforderlich. Ursache hierfür ist der geringe natürliche Anteil von ¹³ C-Atomen. Der Gehalt an natürlichem ¹³C-Kohlenstoff bildet die Grundlage für die Identifizierung des Kohlenstoffgerüstes organischer Moleküle. Weniger problematisch ist dagegen die ¹H-NMR-Spektroskopie, da Wasserstoff in der Natur fast vollständig in der ¹ H-Form vorliegt.

Ergebnisse und Diskussion

Um ein Isomer im Milligramm-Bereich zu isolieren, ist die Aufarbeitung von etwa 500 mg Trockensubstanz Glucopon 225 notwendig. Aus der quantitativen Analyse mittels RP-HPLC-MS war bekannt, daß die Trockenmasse dieser Probe etwa 15 % Diglucoside enthält. Da in Glucopon 225 zwei verschiedene Alkylketten mit einem Verhältnis von etwa 1:1 vorkommen, findet man in der Probe ca. 7 % Decyl-Diglucoside, die sich wiederum auf sechs (RP-C8) bzw. sieben (Hypercarb S) flüssigchromatographisch trennbare Isomere verteilen. Daraus läßt sich ein prozentualer Gehalt von ungefähr einem Prozent je Decyl-Diglucosid-Isomer abschätzen.

Die HPLC-Fraktionierung wurde mit einer analytischen RP-C8-Säule durchgeführt, da während der Durchführung der Experimente für die vorliegende Arbeit keine präparative HPLC-Säule zur Verfügung stand. Der hohe Anteil von monoglucosidischen Komponenten an der Trockensubstanz erfordert die Abtrennung der Monoglucoside vor der HPLC-Fraktionierung. Einerseits sollte die HPLC-Säule vor Überladung bewahrt werden, andererseits wird für eine Fraktionierung ohne Peaküberlappung die komplette Trennkapazität der HPLC-Säule benötigt. Eine "saubere" Fraktionierung ist besonders wichtig, da die Auswertung von NMR-Spektren von Gemischen isomerer Substanzen nahezu unmöglich ist.

Die Abtrennung von Alkylmonoglucosiden aus technischen APG-Gemischen beruht auf der stufenweisen Elution der APG in Abhängigkeit von ihrem Glucosidierungsgrad. Wie die Untersuchungen der verschiedenen Festphasenmaterialien auf ihr Adsorptionsvermögen gegenüber APG gezeigt haben, besitzt Methanol eine sehr hohe Elutionskraft. Die WF nach der Anreicherung aus wäßrigen Proben an ENV+ liegen im Bereich von ~ 85 %, mit Methanol werden demzufolge APG fast vollständig von der Sorbensoberfläche eluiert.

Andere Elutionsmittel wie Tetrahydrofuran, Ethylacetat oder Chloroform wurden deshalb auf eine mögliche Selektivität bei der Desorption von Alkylmonoglucosiden (C8-C12) und Alkyldiglucosiden (C8-C12) von der Oberfläche des ENV+ getestet. Das jeweilige Eluat wurde mittels FIA-MS untersucht. Dabei stellte sich heraus, daß ein Elutionsmittelgemisch aus Cyclohexan und Ethylacetat eine hervorragende Selektivität bezüglich der Trennung von APG nach dem Glucosidierungsgrad besitzt. Nach dem Trocknen der Festphase wurde in zwei Schritten eluiert. Zuerst erfolgte die Elution der Monoglucoside mit dem Gemisch aus Cyclohexan und Ethylacetat, anschließend wurden die Verbindungen höheren Glucosi-dierungsgrades mit reinem Methanol von der Festphase desorbiert. Gute Ergebnisse wurden erreicht, wenn das erste Elutionsmittel aus jeweils 50 % Cyclohexan und Ethylacetat bestand.

Wenn in beiden Elutionsschritten mit 5 ml eluiert wurde, belief sich die WF der

Monoglucoside in der ersten Fraktion auf etwa 60 %, in der zweiten Fraktion, der Methanol-Fraktion wurden etwa 90 % der dotierten Alkyldiglucoside gefunden.

Da der Anteil der Alkylmonoglucoside in der Methanol-Fraktion noch immer sehr hoch war, wurden weitergehende Optimierungsversuche unternommen. Eine deutliche Verbesse-rung konnte durch die erhöhung des Elutionsvolumens im ersten Schritt auf 15 ml erreicht werden (Abbildung 5-39). In der zweiten Fraktion waren dann in Abhängigkeit von der Alkylkettenlänge nur noch 10-17 % der Monoglucoside detektierbar, während die eingesetzten Diglucoside zu mehr als 85 % in dieser Fraktion gefunden werden konnten.

Der Einfluß der Alkylkettenlänge auf die WF war bei den Monoglucosiden stärker als bei den Diglucosiden. Der Abreicherungsgrad sinkt mit abnehmender Länge des Alkylrestes.

Kürzerkettige Alkylmonoglucoside sind polarer als langkettige Verbindungen, damit sinkt ihre Löslichkeit im Elutionsgemisch Cyclohexan/Ethylacetat und die WF in der Methanol-Fraktion steigt.

0 20 40 60 80 100 120

5 10 15 ml

% der Gesamtfläche

Alkylmonoglucoside Alkyldiglucoside

C8

C10 C12 C8

C10 C12

Elutionsmittel Cyclohexan/Ethylacetat (50+50, v/v)

Abbildung 5-39: Desorption von APG in Abhängigkeit vom Elutionsvolumen -Wiederfindung von APG in der Methanolfraktion nach Elution mit verschiedenen Mengen Cyclohexan/Ethylacetat

Probe: Standardgemisch von C8-C12G1 und C8-C12G2 (200 µg/10 ml Wasser).

SPE: 200 mg ENV+ (6 ml-Kartusche).

Elution: 1. Cyclohexan/Ethylacetat (50+50, v/v); 2. 2,5 ml Methanol.

Ergebnisse und Diskussion

Unter Mitarbeit von Frau Orodovskaia im Rahmen einer Praktikumsarbeit wurde schließlich eine Art Doppel-SPE entwickelt, d.h. die Probe wurde unter den gleichen Bedingungen ein zweites Mal extrahiert. Die Methanol-Fraktion der ersten Aufarbeitung wurde nach dem Trocknen mit 5 ml Wasser aufgenommen und erneut an ENV+ "gereinigt".

Damit konnte insgesamt eine Abreicherung der drei Alkylmonoglucoside des Standardgemisches von mehr als 97 % erreicht werden, während von den Alkyldiglucosiden nur etwa 15-20 % "verloren" wurden. "Verloren" heißt, daß die Diglucoside schon im ersten Elutionsschritt vom Sorbensmaterial ENV+ eluiert wurden und somit für die weitere Strukturaufklärung nicht zur Verfügung standen.

Die Leistungsfähigkeit der entwickelten Doppel-SPE wird in Abbildung 5-40 demonstriert. Gegenübergestellt sind die TIC von originalem Glucopon 225 sowie der aufgereinigten Probe. Die HPLC-Trennung wurde dabei an Hypercarb S durchgeführt.

Während in der Originalprobe die Anomeren der beiden Monoglucoside C8 und C10 das HPLC-Chromatogramm eindeutig dominieren, enthält das TIC der aufgearbeiteten Probe zahlreiche Peaks. Neben den Resten von Monoglucosiden handelt es sich in der Hauptsache um Diglucoside, wie die Extraktion der Molekülionen m/z = 453 und 481 aus dem TIC bestätigte (ohne Abbildung). Die zuvor alles überdeckenden Monoglucoside stellen in der gereinigten Probe nur noch einen kleinen Anteil dar.

Insgesamt wurden 500 mg Trockensubstanz des Gemisches Glucopon 225 mittels Doppel-SPE an ENV+ aufgearbeitet. Um Überladungen der Festphase zu vermeiden, wurden fünf Ansätze zu je 100 mg analog aufgearbeitet. Die fünf resultierenden Methanol-Eluate der zweiten SPE wurden schließlich vereinigt und zur Trockne eingeengt. Zur Fortführung der Untersuchungen wurde der verbliebene Rückstand in 4 ml HPLC-Laufmittel aufgenommen.

Damit betrug die Konzentration der diglucosidischen APG-Isomere je Analyt etwa 1 mg/ml.

2.00 6.00 10.00 14.00 18.00 min A 1

2 3

4

1 B

2 3

Abbildung 5-40: Glucopon 225 vor und nach Aufreinigung mittels Doppel-SPE

HPLC-Trennung an Hypercarb S. Eluent: CH3OH, 0,4 ml/min.

Detektion: APCI- (Full-Scan, m/z = 285-500).

A: Glucopon 225 (Originalprobe).

B: Glucopon 225 nach Doppel-SPE an ENV+.

1 = Octyl-α-Monoglucosid, 2 = Octyl-ß-Monoglucosid 3 = Decyl-α-Monoglucosid, 4 = Decyl-ß-Monoglucosid.