Anmerkungen
2. Material und Methoden
2.3 Methoden
2.3.3 DNA-Analysen und Klonierung
2.3.3.2 Polymerase-Kettenreaktionen
Kolonie-PCR
Sind nach einer E.-coli-Transformation Kolonien auf den LB-Selektionsplatten zu sehen, enthalten diese Zellen mit hoher Wahrscheinlichkeit einen Vektor mit dem gewünschten inserierten DNA-Fragment. Kann ein Blau-Weiß-Selektionssystem nicht angewandt werden, empfiehlt es sich auf die gewachsenen Zellen eine Kolonie-PCR durchzuführen, um positive Klone eindeutig zu identifizieren. Dazu wurde eine Vielzahl an Kolonien (zwischen 10 und 20) mit einer sterilen Pipettenspitze von der Platte gepickt, zunächst auf einer Masterplate erneut ausgestrichen und danach direkt in den vorpipettierten PCR-Ansatz gegeben.
Kolonie-PCR-Ansatz:
Kolonie von LB-Platte Template-DNA 2 µl (1x) 10x PCR-Puffer
2 µl (2,5 mM) 25 mM Magnesiumchlorid 1 µl (0,5 mM) 10 mM Desoxynukleotid-Mix
0,5 µl (0,25 µM) 10 µM Senseprimer (passend für eingesetzten Vektor) 0,5 µl (0,25 µM) 10 µM Antisenseprimer (passend für eingesetzten Vektor) 1 µl (~0,5 U) 0,5 U/µl Taq-DNA-Polymerase (rekombinant)
ad 20 µl steriles entionisiertes Wasser
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus 95°C 5 min Denaturieren
30 Zyklen 94°C 30 sec Denaturieren
45-65°C 30 sec Annealing (abhängig vom eingesetzten Primer-Paar) 72°C 30 sec-2 min Synthese (abhängig von der Länge des amplifizierten
DNA-Fragmentes) 1 Zyklus 72°C 5- 10 min Nachsynthese
14°C ∞
Gradienten-PCR
Um neu synthetisierte Oligonukleotide richtig einsetzen zu können, wurden diese zunächst in einer Gradienten-PCR getestet. Dazu wurde ein 15-facher PCR-Mastermix hergestellt, in 12 PCR-Reaktionsgefäße verteilt und danach die Template-DNA zugegeben. Der Gradienten-PCR-Block wurde nun so programmiert, dass während der PCR für jedes Reaktionsgefäß eine andere Annealing-Temperatur genutzt wurde. Die nachträgliche Auftrennung der PCR auf einem 1%igen Agarosegel ermöglichte die
Gradienten-PCR-Ansatz:
1 µl (20-100 ng) Template-DNA 2 µl (1x) 10x PCR-Puffer
2 µl (2,5 mM) 25 mM Magnesiumchlorid 1 µl (0,5 mM) 10 mM Desoxynukleotide 0,5 µl (0,25 µM) 10 µM Senseprimer 0,5 µl (0,25 µM) 10 µM Antisenseprimer
1 µl (~0,5 U) 0,5 U/µl Taq-DNA-Polymerase (rekombinant) ad 20 µl steriles entionisiertes Wasser
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus 95°C 2 min Denaturieren
30 Zyklen 94°C 30 sec Denaturieren
45-65°C 30 sec Annealing
72°C 30 sec-4 min Synthese (abhängig von der Länge des amplifizierten DNA-Fragmentes)
1 Zyklus 72°C 5-10 min Nachsynthese
14°C ∞
Touch-down-PCR
Ist trotz vorangegangener Gradienten-PCR das gewünschte DNA-Fragment in unzureichender Menge vorhanden oder ist die PCR zu unspezifisch, empfiehlt es sich eine Touch-down-PCR durchzuführen. Bei diesem Vorgang wird die Spezifität der Bindung der Oligonukleotide durch schrittweise Annährung der Annealing-Temperatur an die Schmelztemperatur derselben (pro Zyklus 1°C) erhöht. Wird die Annealing-Temperatur höher als die Schmelztemperatur der Oligonukleotide gewählt, binden diese hochspezifisch an die DNA. Damit werden Primer-Dimere und Artefakte verhindert und so die Menge des gewünschten Amplikons erhöht.
Touch-down-PCR-Ansatz:
1 µl (20-100 ng) Template-DNA 2 µl (1x) 10x PCR-Puffer
2 µl (2,5 mM) 25 mM Magnesiumchlorid 1 µl (0,5 mM) 10 mM Desoxynukleotide 0,5 µl (0,25 µM) 10 µM Senseprimer 0,5 µl (0,25 µM) 10 µM Antisenseprimer
1 µl (~0,5 U) 0,5 U/µl Taq-DNA-Polymerase (rekombinant) ad 20 µl steriles entionisiertes Wasser
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus 95°C 2 min Denaturieren
11 Zyklen 94°C 30 sec Denaturieren
60°C 30 sec Annealing (die Temperatur wird je Zyklus um 1°C verringert)
68°C 30 sec-5 min Synthese
32 Zyklen 94°C 30 sec Denaturieren
50°C 30 sec Annealing
68°C 30 sec-5 min Synthese
1 Zyklus 68°C 5-10 min Nachsynthese
14°C ∞
Multiplex-PCR
Um in einer PCR mehr als ein DNA-Fragment nachzuweisen, wurden Multiplex-PCR-Ansätze durchgeführt. Dabei wurden zwei Oligonukleotid-Paare im 1:1-Mix eingesetzt.
Die Reaktion wurde bevorzugt auf die Amplifikation von cDNA angewandt, um die Expression zweier Gene semiquantitativ in einem Ansatz nachzuweisen und zu vergleichen. Die Annealing-Temperatur der Oligonukleotid-Paare wurde zuvor mittels Gradienten-PCR auf genomische DNA bestimmt.
Multiplex-PCR-Ansatz:
1 µl (20-100 ng) Template-cDNA 2 µl (1x) 10x PCR-Puffer
2 µl (2,5mM) 25 mM Magnesiumchlorid 1 µl (0,5mM) 10 mM Desoxynukleotide
1 µl (0,5 µM) 10 µM Primermix (Mix aus vier Oligonukleotiden im Verhältnis 1:1:1:1) 1 µl (~0,5 U) 0,5 U/µl Taq-DNA-Polymerase (rekombinant)
ad 20 µl steriles entionisiertes Wasser
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus 95°C 2 min Denaturieren
30 Zyklen 94°C 30 sec Denaturieren
45-65°C 30 sec Annealing (abhängig von den eingesetzten Primer-Paaren)
72°C 30 sec-4 min Synthese (abhängig von der Länge des amplifizierten DNA-Fragmentes)
1 Zyklus 72°C 5-10 min Nachsynthese
14°C ∞
High Fidelity-PCR
Zur Amplifikation besonders langer DNA-Fragmente wurde der „High Fidelity PCR Enzyme Mix“ der Firma MBI Fermentas genutzt, welcher sowohl Taq-DNA-Polymerase als auch eine ebenfalls thermostabile Pfu-DNA-Polymerase mit Korrekturlese-Funktion (proofreading) enthält. Der Enzym-Mix ermöglicht die Amplifizierung genomischer DNA-Fragmente einer Größe von bis zu 10 kb.
High Fidelity-PCR-Ansatz:
1 µl (50 pg-1 µg) Template-DNA
2 µl (1x) 10x High Fidelity-PCR-Puffer 2 µl (2,5 mM) 25 mM Magnesiumchlorid 0,4 µl (0,2 mM) 10 mM Desoxynukleotide 1 µl (0,5 µM) 10 µM Senseprimer 1 µl (0,5 µM 10 µM Antisenseprimer
0,4 µl (2 U) 5 U/µl High Fidelity Enzym Mix ad 20 µl steriles entionisiertes Wasser
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus 95°C 2 min Denaturieren
30 Zyklen 94°C 30 sec Denaturieren
45-65°C 30 sec Annealing (abhängig von den eingesetzten Primer-Paaren)
68°C 30 sec-4 min Synthese (abhängig von der Länge des amplifizierten DNA-Fragmentes)
1 Zyklus 72°C 5-10 min Nachsynthese
14°C ∞
Semiquantitative RT-PCR
Um die Expression verschiedener Gene zu überprüfen, konnte nach der cDNA-Synthese eine semiquantitative RT-PCR durchgeführt werden. Dafür wurde die einzelsträngige cDNA als Template eingesetzt und mit spezifischen Oligonukleotiden das Gen von Interesse, sowie ein konstitutiv exprimiertes Gen zum Vergleich nachgewiesen werden.
Diese konnten getrennt voneinander, aber auch als Multiplex-PCR in einem Ansatz amplifiziert werden. Der Nachweis der amplifizierten, also auch exprimierten Gene, erfolgte durch Auftrennung der PCR-Reaktionen auf einem 1%igen Agarosegel.
Ansatz semiquantitative RT-PCR:
1 µl (20-100 ng) Template-cDNA 2 µl (1x) 10x PCR-Puffer
2 µl (2,5 mM) 25 mM Magnesiumchlorid 1 µl (0,5 mM) 10 mM Desoxynukleotide 0,5 µl (0,25 µM) 10 µM Senseprimer 0,5 µl (0,25 µM) 10 µM Antisenseprimer
1 µl (~0,5 U) 0,5 U/µl Taq-DNA-Polymerase (rekombinant) ad 20 µl steriles entionisiertes Wasser
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus 95°C 2 min Denaturieren
30 Zyklen 94°C 30 sec Denaturieren
45-65°C 30 sec Annealing (abhängig von den eingesetzten Primer-Paaren)
72°C 30 sec-4 min Synthese (abhängig von der Länge des amplifizierten DNA-Fragmentes)
1 Zyklus 72°C 5-10 min Nachsynthese
14°C ∞
Quantitative Real-Time-PCR
Da bei der semiquantitativen RT-PCR eine Identifizierung der Menge der gebildeten PCR-Produkte erst nach des gesamten Laufs durch gelelektrophoretische Auftrennung möglich ist, kann eine genaue Bestimmung hier nicht erreicht werden. Für eine korrekte Quantifizierung der gebildeten Amplikons wurde die Real-Time-PCR-Technik eingesetzt.
Hierbei wurde die Menge der gebildeten PCR-Produkte in der exponentiellen Phase der PCR durch Messung von, vorher zugegebenen in die DNA interkalierenden, Fluoreszenzfarbstoffen ermittelt. In dieser Arbeit wurde ausschließlich SYBR Green I der Firmen Applied Biosystems sowie MBI Fermentas als Farbstoff genutzt.
Real-Time-PCR-Ansatz:
1 µl (20-100 ng) Template-DNA bzw. –cDNA 5 µl (1x) 2x SYBR Green I Master Mix
1 µl (je 25 nM) 1 µM Primermix (Sense- und Antisenseprimer) ad 10 µl steriles, entionisiertes Wasser
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus 95°C 10 min Denaturieren
60 Zyklen 95°C 30 sec Denaturieren
60°C 30 sec Annealing
72°C 30 sec Synthese
1 Zyklus 95°C 1 min Denaturieren
60°C 30 sec Annealing
95°C 1 min Denaturieren
25°C Plateau
5‘-/3‘-RACE-PCR
Die „RACE-PCR“ (rapid amplification of cDNA-ends) stellt ein Verfahren zur Amplifikation bzw. Verlängerung von cDNA-Enden dar. Diese Methode ermöglicht durch reverse Transkription und Verwendung von speziellen Adapter-Oligonukleotiden die Identifizierung von 5‘- bzw. 3‘-Enden bestimmter Gene. Für die Durchführung von RACE-PCR in der vorliegenden Dissertationsarbeit wurde ein „SMART™ RACE cDNA Amplification Kit“ der Firma Clontech Laboratories, Inc verwendet und nach Herstellerangaben verfahren.