Modulation der inhibitorischen Aktivität durch die Variation eines Arylrestes

anellierten Heteroaromaten mit Tyr²¹¹ beruhen, sondern auch durch potenzielle Interaktionen ausgehend vom Fünfring moduliert werden könnte.

Mittels der Untersuchung der molekularen elektrostatischen Potentiale konnte ein möglicher Zusammenhang zwischen der Ladungsverteilung und der Aktivität der Verbindungen festgestellt werden, während die Dockingexperimente zu keiner eindeutigen Abbildung der Struktur-Wirkungsbeziehungen führte. Ausgewählte Verbindungen, die hinsichtlich der Aktivität gegenüber Ovastacin evaluiert wurden, zeigten teilweise einen ähnlichen Trend, welcher auch bei Meprin  und  festgestellt wurde. Demnach könnte ebenfalls davon ausgegangen werden, dass die in den Dockingergebnissen gezeigte π-π-Interaktionen mit Phe²⁴³ und Tyr²³⁸ durch die elektrostatischen Eigenschaften des Heteroaromaten maßgeblich beeinflusst werden. Die formale Zyklisierung des Grundkörpers sowie das anschließende Austauschen der Heteroatome innerhalb des Heteroaromaten im Zusammenhang des Scaffold Hoppings ermöglichte die Identifizierung von vielen neuartigen Grundkörpern. Die Anwendung dieser beiden Konzepte führte zu einer beeindruckenden Aktivitätssteigerung gegenüber Meprin  und . Da keine ausgeprägte Inhibierung der off-target-Metalloproteasen und keine Zytotoxizität (Anhang 9.3) festgestellt wurde, eignen sich die neuartigen heteroaromatischen Grundkörper als Ausgangspunkte für weitere Optimierungen. Zudem zeigten einige Derivate auch ohne jegliche Funktionalisierungen bereits eine hohe inhibitorische Potenz gegenüber Meprin  sowie eine gute Selektivität gegenüber Meprin .

5.2.3 Einfluss der Substituenten in 3- und 5-Position der 3,4,5-substituierten Pyrazole auf

einer Reduktion der Hemmaktivität gegenüber Meprin  und  führen. Im Gegensatz dazu könnte die Aktivitätsverringerung bei Einführung eines Benzylsubstituenten (100b: Ki(app)

hMep =70 nM, Ki(app)

hMep =1733 nM) durch eine ungünstigere Positionierung des Restes oder durch eine sterische Behinderung im aktiven Zentrum erklärt werden. Mit dem Austausch des Phenylrestes gegen einen gesättigten Cyclopentanrest (100c: Ki(app)

hMep =6 nM, Ki(app)

hMep =320 nM) wurden vergleichbare Aktivitäten bestimmt, was auf eine ähnliche Positionierung des Cyclopentanrestes in S1‘ wie des Phenylrestes bei 5c hinweisen könnte. Die Positionierung eines lipophilen Restes direkt am Pyrazolgrundgerüst wird demzufolge für die Hemmung von Meprin  und  bevorzugt.

Die Einführung von substituierten Phenylresten (100d-g), die einen +M-Effekt aufweisen und Wasserstoffbrückenakzeptoren darstellen, hatte keinen großen Einfluss auf die inhibitorischen Aktivitäten gegenüber Meprin  und . Die Hemmaktivitäten dieser Derivate sind im Vergleich zum Diphenylpyrazolderivat 5c unverändert, was gegensätzlich zu den tertiären Aminen ist, bei denen die Einführung von Wasserstoffbrückenakzeptoren sich positiv auf die Meprin -Aktivität auswirkte.^[16] Die Dockinglösung von 100e (Ki(app)

hMep =1 nM) lässt eine Orientierung des para-Methoxyphenylrestes in Richtung S1’-Bindetasche vermuten, wodurch die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen dem Methoxyrest und dem Argininrest Arg²⁴² oder einer Kation--Wechselwirkungen zwischen dem elektronenreichen Aromaten und dem Arigininrest Arg²⁴² in Meprin  möglich wäre (Abbildung 23).

Abbildung 23: A) Dockinglösung des monosubstituierten Pyrazolderivats 100e (1/20, blau) in Meprin  (Homologie Modell);

B) schematische 2D-Darstellung des möglichen Bindungsmodus von 100e in Meprin .

In Abhängigkeit von Solvatationseffekten kann der Beitrag einer Wasserstoffbrücke die Bindungsaffiniät unterschiedlich verändern. Die gleichbleibenden Hemmaktivitäten dieser monosubstituierten Pyrazole (100d-g) könnten auf ungünstige Solvatationseffekte und andere Faktoren wie enthalpische und entropische Einflüsse hinweisen, bei der eine zusätzliche Wasserstoffbrückenbindung nicht zur Aktivitätserhöhung beiträgt.^[62,136] Ein positiver mesomerer Effekt ist dennoch bestimmend für die Aktivität gegenüber Meprin  und , da im Gegensatz dazu die Substitution durch Benzonitrilresten (100h: Ki(app)

hMep =5 nM, Ki(app)

hMep =335 nM, 100i: Ki(app)

hMep =14 nM, Ki(app)

hMep =995 nM), die einen –M-Effekt aufweisen, zu einer

Aktivitätsverringerung führte. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese einer möglichen Ausbildung von Kation--Wechselwirkungen zwischen den elektronenreichen Phenylresten und den Argininresten Arg²⁴² in Meprin  und Arg²³⁸ in Meprin .

Mit der Erhöhung der Acidität durch Einführung von aciden funktionellen Gruppen (100j-100p) konnte eine Verschiebung der Selektivität in Richtung Meprin  verzeichnet werden, die zum Teil zu einer äquipotenten Hemmung von Meprin  und  führte. Der Austausch des Phenylrestes (5c) gegen einen Chlor-Fluorphenolrest (100m: Ki(app)

hMep=0,1 nM, Ki(app)

hMep =0,4 nM) mit der phenolischen Funktion in para-Position führte sowohl für Meprin  als auch Meprin  zu einer deutlichen Aktivitätssteigerung in den picomolaren Bereich. Durch die elektronenziehenden Halogenatome wird der pKS-Wert des sonst schwach aciden Phenols abgesenkt, sodass Halogenphenole als lipophile Carbonsäurebioisostere eingesetzt werden können.^[137] Der Einsatz von Carbonsäurebioisosteren findet häufig Anwendung in der medizinischen Chemie, um Nachteile der Carbonsäure als funktionelle Gruppe wie z.B. begrenzte passive Diffusion durch biologische Membranen oder metabolische Instabilität, zu vermeiden.^[137,138] Die Positionierung der aciden Funktion von 100m in den Dockingergebnissen könnte auf eine ionische Wechselwirkungen oder eine ladungsunterstützte Wasserstoffbrücke mit dem Argininrest in der S1‘-Bindetasche von Meprin  (Arg²⁴²) hindeuten (Abbildung 24A und B).

Abbildung 24: Dockinglösung des monosubstituierten Pyrazolderivats 100m in A) Meprin  (1/20) und in C) Meprin  (3/20, PDB: 7AQ1); schematische 2D-Darstellung des möglichen Bindungsmodus von 100m in B) Meprin  und D) Meprin .

In Meprin  kann ebenfalls eine ionische Wechselwirkung zwischen dem Phenolat und dem Argininrest (Arg²³⁸) diskutiert werden. Eine Wasserstoffbrückenbindung mit dem Rückgrat der benachbarten Aminosäure Ser²¹² in Meprin  ist ebenfalls nicht auszuschließen. Zudem könnte die

Reduktion der Acidität und die gesteigerte Lipophilie durch die Halogenatome des Halophenols auch zu der Aktivitätssteigerung gegenüber Meprin  beitragen. Die meta-Position der aciden Phenolfunktion (100l: Ki(app)

hMep =2 nM, Ki(app)

hMep =61 nM) wurde hingegen weniger für die Hemmung von Meprin  und  bevorzugt, was auf eine ungünstigere Positionierung der aciden Funktion für die Ausbildung von Wechselwirkungen vermuten lässt. Die Einführung von aciden Carboxyphenylresten (100j: Ki(app)

hMep =8 nM, Ki(app)

hMep =48 nM; 100k: Ki(app)

hMep =17 nM, Ki(app)

hMep =116 nM) hatte auf die Inhibierung von Meprin  einen marginalen positiven Effekt.

Die andere Positionierung der Carboxylgruppe im Vergleich zur Hydroxyfunktion des Halogenphenols könnte für die Ausbildung der oben beschriebenen Wechselwirkungen ungünstig sein. Die beiden Derivate 100j und 100k wurden für die Hemmung von Meprin  im Vergleich zum Diphenylpyrazolderivat 5c weniger bevorzugt, was den Struktur-Wirkungsbeziehungen der tertiären Amine ähnelt.

In Analogie zu Meprin  und  konnte bei der Evaluierung von ausgewählten monosubstituierten Pyrazolen gegenüber murinem Ovastacin für die Derivate mit einem para-Methoxyphenyl- (100e) und para-Carboxyphenylrest (100k) nur ein marginaler Einfluss auf die inhibitorische Aktivität beobachtet werden. Im Gegensatz dazu wurde wiederholt bei der Einführung des Halophenols (100m: Ki(app)

mOva=0,7 nM) eine deutliche Aktivitätssteigerung in den picomolaren Bereich erzielt.

Die Wechselwirkung des Phenolats mit der NH-Funktion der benachbarten Aminosäure Gly²³⁹ könnte zur hohen Bindungsaffinität der Verbindung 100m beitragen (Abbildung 25). Zudem könnten ionische Wechselwirkungen des Phenolats mit dem positiv geladenen Arg²⁶⁴ in der S1‘-Bindetasche diskutiert werden. Mit der Chlor-Fluorphenolsubstitution des Pyrazolderivats (100m) wurde ein pan-spezifischer Astacininhibitor dargestellt, welcher aufgrund der Lipophilie und reduzierten Acidität des Substituenten Interaktionen mit der S1‘-Bindetasche in Meprin  und  sowie Ovastacin ausbilden könnte.

Abbildung 25: A) Dockinglösung des monosubstituierten Pyrazolderivats 100m in mOvastacin (1/20, Homologie Modell);

B) schematische 2D-Darstellung des möglichen Bindungsmodus von 100m in mOvastacin.

Die Untersuchung weiterer Carbonsäurebioisostere (100n-p) zeigte grundsätzlich auch eine Verschiebung der Selektivität in Richtung Meprin  (Abschnitt 5.1.3.1, Tabelle 17). Innerhalb der

dargestellten Carbonsäurebioisostere stellt das Tetrazol (100p) die acideste Gruppe dar (Abbildung 26C). Aufgrund der Stabilisierung der negativen Ladung durch Elektronen-delokalisation weist das Tetrazol einen vergleichbaren pKS-Wert auf wie die Carbonsäure und ist aber im Unterschied dazu lipophiler als das korrespondierende Carboxylat.^[139] Dieser Unterschied geht mit einer zehnfach höheren Inhibierung von Meprin  und  durch Phenyltetrazolderivat 100p im Vergleich zum Carboxyphenylanalogon 100j einher (100j: Ki(app)

hMep =8 nM, Ki(app)

hMep =48 nM; 100p: Ki(app)

hMep =0,7 nM, Ki(app)

hMep =7 nM). Mit den Dockingexperimenten in Meprin  könnte für das Pyrazol mit einem Phenyltetrazolrest (100p) ein Bindungsmodus vermutet werden, die eine Interaktion mit Arg¹⁴⁶ in der S2‘-Bindetasche aufweist (Abbildung 26B).

Durch die Größe des Tetrazols wird der Abstand zwischen dem Phenylrest und der aciden Funktionalität im Vergleich zum Carbonsäureanalogon verlängert.^[139,140] Dadurch könnte die Adressierung der S2‘-Bindetasche für das Phenyltetrazolderivat (100p) möglich sein. Die S2‘-Bindetasche wird in Meprin  durch einen Tyrosinrest (Tyr¹⁴⁹) geformt, und wird in der Dockinglösung nicht vom Tetrazolrest adressiert. Das Docking lässt auf Wechselwirkungen mit Arg²⁴² in der S1‘-Bindetasche vermuten (Abbildung 26A).

Abbildung 26: Dockinglösung des monosubstituierten Pyrazolderivats 100p in Meprin  (A, 1/20) und Meprin  (B, 1/20);

C) Berechnete pKS-Werte der aciden Funktionalitäten (mittels MarvinSketch 6.2.2 der Firma ChemAxon).

Die äquipotente Hemmung des 3-Hydroxyisoxazolderivats (100n: Ki(app)

hMep =16 nM, Ki(app)

hMep =14 nM) im nanomolaren Bereich könnte auf eine ähnliche Positionierung in der S1‘-Bindetasche wie beim Halophenolderivat 100m hindeuten, bei der Wechselwirkungen mit den jeweiligen Argininresten in Meprin  (Arg²⁴²) und  (Arg¹⁴⁶) möglich sind. Mit einem pKS-Wert von 6 (Abbildung 26C) ist die Hydroxyfunktionalität des 3-Hydroxyisoxazols etwas acider im Vergleich zum Halogenphenol. Die gesteigerte Polarität des 3-Hydroxyisoxazols (100n) durch die Einführung von Heteroatomen und das Fehlen der Halogenatome im Vergleich zum

Halogenphenol könnten Einfluss auf die inhibitorische Aktivität haben und zu einer verringerten Inhibierung im Vergleich zu 100m führen. Die Hemmaktivitäten des Pyrazolderivats mit einem Trifluoromethylpyrazolrest (100o: Ki(app)

hMep =2 nM, Ki(app)

hMep =88 nM) liegen im ähnlichen Bereich wie die des Diphenylpyrazols 5c. Die Einführung einer elektronenziehenden Trifluoromethylgruppe am Pyrazol erhöht die Acidität der NH-Funktion des Pyrazols auf einen pKS-Wert von ca. zehn (Abbildung 26C). Die verminderte Aktivität von 100o gegenüber Meprin  könnte auf die geringere Acidität verglichen mit den anderen Bioisosteren zurückzuführen sein, sodass die basischen Bindetaschen im aktiven Zentrum von Meprin  nicht adressiert werden.