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Modulation der inhibitorischen Aktivität durch die Einführung von N-Substituenten am

1 Einleitung

5.2 Diskussion der Struktur-Wirkungsbeziehungen unter Zuhilfenahme von computerchemischen

5.2.4 Modulation der inhibitorischen Aktivität durch die Einführung von N-Substituenten am

Neben der Variation der Phenylreste an Position 3 und 5 des Pyrazolgrundkörpers wurde auch der Einfluss der Einführung von unterschiedlichen Substituenten an Position 1 auf die Hemmaktivität gegenüber den Astacinproteasen untersucht. Beim Vergleich der inhibitorischen Aktivitäten zwischen Methyl- (126a), Phenyl- (121) und Benzylsubstitution (126b) wurde das benzylierte Pyrazolderivat (126b: Ki(app)

hMep =1 nM, Ki(app)

hMep =291 nM) am meisten für die Hemmung von Meprin  und  bevorzugt. Ausgehend vom benzylierten Pyrazolderivat (126b) wurden unterschiedliche substituierte Benzylsubstituenten (126c-n) eingeführt und hinsichtlich der inhibitorischen Aktivität evaluiert. Eine weitere Modifizierung der Benzylreste durch den Austausch des Methylenlinkers gegen einen Cyclobutyl- (131b,c), Oxetan- (131d,e) und iso-Propyl-Linker (131f) wurde zudem durchgeführt, um auch Derivate darzustellen, die weniger anfällig für eine mögliche Spaltung durch oxidative Dealkylierung sein könnten. Diese Einheiten führten jedoch zu einer zehnfachen Verschlechterung der inhibitorischen Aktivität (z. B. 131b:

Ki(app)

hMep =13 nM, Ki(app)

hMep =1086 nM), welche auf sterischen Gründen oder eingeschränkte Flexibilität des Linkers beruhen könnten. Generell zeigte die Variation der Benzylsubstituenten am Pyrazol für den Großteil der Verbindungen nur marginale Veränderungen in der inhibitorischen Aktivität. Auffällig war jedoch die Aktivitätssteigerung gegenüber Meprin  und  mit der Einführung von Benzylresten mit aciden funktionellen Gruppen (126i-l). Um den möglichen Bindungsmodus dieser Verbindungen vorhersagen zu können, wurde ein Docking mit flexiblen Seitenketten durchgeführt. Da die Pyrazolderivate im Verhältnis zu den anderen Derivaten durch die Einführung der verschiedenen substituierten Benzylreste ein größeres Molekül abbilden, führte die Durchführung der Dockingexperimente in das rigide Protein besonders bei Meprin  zu Kollisionen mit der Proteinoberfläche. Um die induzierte Anpassung (induced fit) bei der Bildung des Ligand-Protein-Komplexes zu berücksichtigen, waren die jeweiligen Aminosäuren in der S1- und S1‘-Bindetasche von Meprin  und  während des Dockings flexibel, da diese für die Bindung des Liganden relevant sein könnten. Die aktivste Verbindung gegenüber Meprin  in dieser Klasse war das Derivat 126k (Ki(app)

hMep =0,08 nM) mit einem Halogenphenolrest. In den Dockinglösungen in Meprin  ist der Benzylsubstituent von 126k zum Argininrest Arg242 in der S1‘-Bindetasche orientiert, was auf ionische Interaktionen hindeuten könnte (Abbildung 29). Auch innerhalb der 3,4,5-substituierten Pyrazole wurde bei der Substitution mit einem Halogenphenolrest (100m, siehe Abschnitt 5.2.3.1) vergleichbare Ergebnisse beobachtet, die ebenfalls auf eine Interaktion mit der S1‘-Bindetasche zurückgeführt werden könnte. Die Positionierung der Verbindung 126k in der Dockinglösung unterscheidet sich

jedoch von 100m, da das N-substituierte Pyrazol 126k mehr zur S1‘- und S2‘-Bindetasche orientiert ist. Dies könnte die Bildung von hydrophoben Kontakten zwischen dem Phenylrest und unpolaren Aminosäureseitenketten wie Ile152 ermöglichen. Aufgrund der lipophilen Umgebung der S2‘-Bindetasche durch Ile152 und Tyr149 könnte auch das Chloratom des Halogenphenols einen Beitrag zur Bindungsaffinität liefern. Zusätzlich könnte eine mögliche Cl-π-Interaktion mit Tyr149 in der S2‘-Bindetasche in Betracht gezogen werden.[141] Außerdem könnten π-π-Interaktionen des Phenylrestes mit dem Tyrosinrest Tyr187 der S1-Bindetasche einen positiven Einfluss auf die Bindung haben (Abbildung 29B).

Abbildung 29: A) Dockinglösung des N-substituierten Pyrazolderivats 126k (1/20, Docking mit flexiblen Seitenketten Y187 und R242) in Meprin ; B) schematische 2D-Darstellung des möglichen Bindungsmodus von 126k in Meprin .

Eine Veränderung der Hydroxyfunktion in die para-Position (126l: Ki(app)

hMep =0,4 nM) führte zu einer fünffachen Verschlechterung der Aktivität, da die Positionierung der aciden Funktion ungünstiger für die Ausbildung einer Wechselwirkung mit Arg242 in S1‘ sein könnte. Vergleichbare Aktivitäten wurden auch für Derivate mit aromatischen Carbonsäuren (126i: Ki(app)

hMep =0,3 nM, 126j: Ki(app)

hMep =0,4 nM) erzielt. Die verringerte inhibitorische Aktivität der Pyrazole mit Carboxybenzylresten (126i,j) könnte auf die Relevanz der erhöhten Lipophilie des Halogenphenolrestes für eine hohe Bindungsaffinität hindeuten.

Die Einführung der aciden Reste hatte einen größeren Effekt auf die Hemmung von Meprin , bei der eine Aktivitätssteigerung mit bis zu Faktor 30 bestimmt wurde (126i: Ki(app)

hMep =11 nM, 126k: Ki(app)

hMep =9 nM). Eine Interaktion mit einem Argininrest im aktiven Zentrum von Meprin  könnte demzufolge auch vermutet werden. Jedoch wird in der Dockinglösung der Verbindung 126i keine Wechselwirkung mit dem entsprechenden Argininrest Arg238 in der S1‘-Bindetasche gezeigt (Abbildung 30). Der Carboxybenzylsubstituent von 126i ist stattdessen zu den Seitenketten der Aminosäuren Ser212 und Thr214 benachbart zur S1‘-Bindetasche gerichtet und könnte somit an Wasserstoffbrückenbindungen beteiligt sein. Ähnliche Interaktionen konnten auch bei der Kokristallisation des Aminderivats 2a im aktivem Zentrum von Meprin  festgetellt werden.[61] Weitere Interaktionen wie Kationen-π-Wechselwirkungen zwischen Arg238 und dem

Phenylrest oder π-π-Interaktionen zwischen Tyr211 und dem Heteroaromaten sowie zwischen Phe216 und dem anderen Phenylrest können auch aus der Dockinglösung geschlussfolgert werden.

Abbildung 30: A) Dockinglösung des N-substituierten Pyrazolderivats 126i (1/20, Docking mit flexiblen Seitenketten R184 und R238) in Meprin ; B) schematische 2D-Darstellung des möglichen Bindungsmodus von 126i in Meprin .

Der unterschiedliche Bindungsmodus der N-substituierten Pyrazole in Meprin  im Vergleich zu Meprin  könnte aus den voluminösen Seitenketten des Tyrosinrestes Tyr187 in der S1-Bindetasche und auch des Glutaminrestes Gln215 benachbart zur S1‘-Bindetasche in Meprin  resultieren, die den Benzylrest in Richtung S1‘-Bindetasche lenken. Eine ionische Wechselwirkung zu einem basischen Argininrest im aktiven Zentrum ist dennoch nicht auszuschließen, da bei Einführung der aciden Benzylsubstituenten (126i-l) eindeutig eine Erhöhung der Hemmaktivität gegenüber Meprin  festzustellen ist.

Ausgewählte Verbindungen wurden auch hinsichtlich der Hemmaktivität gegenüber Ovastacin evaluiert. Für die Hemmung von Ovastacin wird sowohl die Einführung eines Phenyl- (121: Ki(app)

mOva=33 nM) als auch Benzylrestes (126b: Ki(app)

mOva=48 nM) als lipophile Substituenten bevorzugt. Dies könnte durch die lipophile Umgebung im aktiven Zentrum von Ovastacin begründet sein, die durch die Seitenketten der Aminosäuren Phe214 und Phe243 in der S1-Bindetasche und durch Gly239 benachbart zu S1‘ gebildet wird. Die Einführung von aciden Substituenten bewirkte ebenfalls eine Aktivitätssteigerung und ist vergleichbar mit der Aktivität gegenüber Meprin . Bei Betrachtung der Dockingergebnisse ist der Halophenolsubstituent von 126k (Ki(app)

mOva=9 nM) zur S1‘-Bindetasche orientiert. Ähnlich wie bei Meprin  könnte eine ionische Wechselwirkung mit dem Argininrest Arg264 in der S1‘-Bindetasche diskutiert werden (Abbildung 31). Des Weiteren lassen sich ähnlich wie bei Meprin  π-π-Interaktionen zwischen Tyr238 und dem Heteroaromaten sowie zwischen Phe243 und dem Phenylrest vermuten, die ebenfalls zur inhibitorischen Aktivität beitragen könnten. Die Seitenkette des zweiten Phenylalanins Phe214, die die S1-Bindetasche formt, weist eine zu große Distanz zu den Derivaten auf und ist wohlmöglich nicht mit an der Bindung beteiligt.

Abbildung 31: A) Dockinglösung des N-substituierten Pyrazolderivats 126k (2/20, Docking mit flexiblen Seitenketten F214 und R264) in murinen Ovastacin; B) schematische 2D-Darstellung des möglichen Bindungsmodus von 126k in Ovastacin.

Die Verlängerung der Spacerlänge hatte für die meisten N-substituierten Pyrazolderivate eine Aktivitätsverringerung zur Folge. Eine Ausnahme bildeten jedoch die Diphenylpyrazolderivate mit einer aromatischen Carbonsäure (127i: Ki(app)

hMep =0,7 nM, Ki(app)

hMep =1210 nM) und mit einem Halogenphenolrest (127k: Ki(app)

hMep =0,15 nM, Ki(app)

hMep =1184 nM), die mit der Verlängerung des Spacers zwar eine deutliche Abnahme der Bindungsaffinität gegenüber Meprin  aufwiesen, aber in der Meprin -Aktivität vergleichsweise konstant blieben. Dies führte in beiden Fällen zu einer außerordentlichen Steigerung der Selektivität von Meprin  gegenüber Meprin  mit einem Faktor von 1700 für 127i und einem Faktor von 8000 für 127k. Mit einem Selektivitätsfaktor von 8000 gegenüber Meprin  stellt die Verbindung 127k bislang den selektivsten bekannten Meprin -Inhibitor dar. Die erst kürzlich beschriebenen Verbindungen von WANG et al. weisen eine deutlich geringere Meprin -Selektivität von Faktor 100 auf.[142]

Die Dockinglösung von 127k in Meprin  zeigt, dass der entsprechende acide Substituent des verlängerten Pyrazolderivats auch noch in der Lage ist, den Argininrest Arg242 der S1‘-Bindetasche zu adressieren (Abbildung 32).

Abbildung 32: Dockinglösung des N-subsituierten Pyrazolderivats 127k (1/20, Docking mit flexiblen Seitenketten Y187 und R242) in Meprin ; B) schematische 2D-Darstellung des möglichen Bindungsmodus von 127k in Meprin .

Aufgrund der Verlängerung des Spacers ist die Diphenylpyrazolgrundstruktur im aktiven Zentrum anders positioniert als bei den Derivaten mit C1-Spacer. Die zuvor beschriebenen π-π-Interaktionen könnten somit nicht mehr ausgebildet werden. Entscheidend scheint aber die

ionische Wechselwirkung mit Arg242 zu sein, die für die hohe Hemmaktivität bestimmend ist. Die meta-Position der aciden Funktionalität wird für die Hemmung bevorzugt. Die entsprechende para-Stellung der aciden Funktionalität der Verbindungen (127j: Ki(app)

hMep =14 nM, 127l:

Ki(app)

hMep =8 nM) ist wie bei den anderen Derivaten mit einer Abnahme der Aktivität verbunden, die auf eine fehlende Interaktion mit Arg242 oder sogar ungünstige Wechselwirkungen mit Tyr149 in der S2‘-Bindetasche hindeuten könnten. Im Gegensatz zu Meprin  war die Verlängerung der Spacerlänge bei den N-substituierten Pyrazolderivaten mit aciden Resten (127i,k) gegenüber Meprin  mit einer 100fachen Aktivitätsverringerung verbunden. Somit könnte vermutet werden, dass die bei den C1-Analoga (126i,k) postulierten Wasserstoffbrücken mit Ser212 und Thr214 (Abbildung 30) mit der Verlängerung des Spacers aufgrund einer anderen Positionierung des Benzylrestes nicht mehr gebildet werden. Aufgrund der erniedrigten Hemmaktivität könnte ebenfalls die Ausbildung einer Wechselwirkung mit den Argininresten Arg184 in der S1- oder Arg238 in der S1‘-Bindetasche ausgeschlossen werden.

5.2.5 Modulation der inhibitorischen Aktivität durch die Modifikation der Substituenten