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Alle mikrobiologischen Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen an einer sterilen Werkbank durchgeführt. Die für diese Arbeiten verwendeten Medien, Lösungen, Gefäße, Pipetten und sonstige Materialien wurden vor Benutzung für 30 min bei einer Temperatur von 121 °C autoklaviert.

5.2.1 Bakterienstämme

Zur Amplifikation von Plasmiden, die als Substrate für die mismatch-Synthese und zur Expression der MutHLS-Proteine dienten, wurden Bakterien der Art Escherichia coli eingesetzt. Sämtliche im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind Abkömmlinge des Sicherheitsstammes E. coli K12 (Sicherheitsstufe 1).

JM109

Der E. coli K12-Abkömmling JM109 eignet sich besonders zur langfristigen Aufbewahrung von Plasmiden, da dieser Stamm die Fähigkeit zur homologen Rekombination verloren hat.

Plasmidverluste oder Integration episomaler Gene bzw. Genabschnitte in das Bakteriengenom sind somit weitestgehend ausgeschaltet. Er eignet sich jedoch nicht zur Expression rekombinanter Proteine, die unter Kontrolle eines T7-Promotors stehen, da er nicht über die benötigte Polymerase (T7-RNA-Polymerase) zur Transkription des mit dem Plasmid eingeführten Gens verfügt.

Genotyp des Stammes JM109: gyr96A, recA1, relA1, hsdR17(rk-, mk+), endA1, thi, Δ[lac,proAB], supE44, [F`...], traD36, proAB, lacIqZΔM15

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HMS174(λDE3)

Zur Expression von Proteinen in einem Vektor wie pET-15b oder anderen Plasmidkonstrukten mit einem λ- oder T7-Promotor eignen sich diese mit dem Phagen λDE3 lysogenisierten Bakterienzellen. Die Lysogenisierung der Zellen ist wichtig, da dadurch die λ-RNA-Polymerase eingeführt wird, ohne die das auf dem Plasmid befindliche Gen nicht transkribiert werden kann. Dieser Stamm eignet sich für die Gewinnung sehr hoher Mengen an Protein.

Genotyp des Stammes HMS174(λDE3): F-, recA, rK12-mK12+, Rif r, DE3

5.2.2 Plasmide

pET15b-XhoI und –HindIII

Aus dem Plasmid pET15b-XhoI wurden durch eine zielgerichtete Mutagenese die Varianten pET15b-X10, X20, X40, X80 sowie X80tri hergestellt. Das Gleiche geschah mit dem Ursprungsplasmid pET15b-HindIII. Durch die Mutagenese wurden eine zusätzliche d(GATC)-Sequenz eingeführt, die 10, 20, 40 oder 80 bp vom später auftretenden mismatch lokalisiert war. Im Falle des X80tri- bzw. H80tri-Plasmids wurde eine Erkennungssequenz für ein TFO (Tripelhelix-Forming Oligonucleotide) eingeführt, die für die Ausbildung einer Tripelhelix notwendig ist.

Abbildung 5-1: Überblick der wichtigsten Restriktionsschnittstellen der für die mismatch-Herstellung wichtigen Plasmide

Als Vergleich sind die Restriktionsschnittstellen aller verwendeten Plasmidvarianten aufgeführt. Quelle: Vector NTI 5.0

Ausschnitt pET15b-XH10-80 +Tripelhelix Sequenz

5708 bp

GT-mismatch TFO Erkennungs Sequenz

XhoI(215)

HinfI (360) NcoI (280)

FokI (37)

FokI (259)

FokI (378) DpnI (212)

DpnI (307) DpnI (347)

DpnI (367) DpnI (377)

Bakterienkulturen lassen sich nur circa 4 Wochen bei 4 °C auf Erhaltungsplatten lagern. Nach Ablauf dieser Zeit ist mit einem Plasmidverlust oder mit dem Absterben der Bakterien zu rechnen. Um dies zu vermeiden, wurde eine Bakterienkultur, die erfolgreich mit einer der pET-15b-Varianten transformiert worden war, in Glycerin aufgenommen und konnte dadurch bei –70 °C gelagert werden.

Für die Anlage der Glycerinkultur wurden 3 ml LB-Medien, die den gewünschten Antibiotikazusatz enthielten, mittels eines sterilen Zahnstochers mit dem gewünschten Klon von einer Erhaltungsplatte angeimpft und über Nacht bei 37 °C im Schüttelwasserbad inkubiert. Am nächsten Tag wurden noch einmal 3 ml LB-Medien (wieder mit dem entsprechenden Antibiotikazusatz) mit je 100 µl der ÜN-Kultur angeimpft und bei 37 °C im Schüttelwasserbad für weitere 4-5 Stunden angezogen. 800 µl dieser Kulturen wurden anschließend in einem geeigneten Gefäß (z.B. Costar Biofreeze™) steril mit 200 µl Glycerin versetzt. Das Bakterien-Glycerin-Gemisch wurde für 20 min auf Eis inkubiert und konnte danach bei –70 °C gelagert werden. Da die genetische Identität der Klone in Glycerinkulturen erhalten bleibt, kann man aus solchen Kulturen jederzeit mittels eines sterilen Zahnstochers Proben entnehmen, die zum Ausstreichen auf Agarplatten oder zum Animpfen von Flüssigmedien verwendet werden können.

5.3 Proteinaufreinigung MutHLS 5.3.1 Zellen ernten

Für die Aufreinigung der Enzyme MutH, MutL und MutS wurde jeweils eine 20 ml-Vorkultur, bestehend aus LB-Medium mit Ampicilin, mit den entsprechenden Glycerinkulturen (HMS174 (λDE3)-Zellen) angesetzt. Nach Inkubation bei 37°C im Schüttelwasserbad, wurden die 20 ml der Vorkultur vollständig auf die 500 ml der Hauptkultur übertragen (LB-Medium mit Ampicilin). Die Hauptkultur wurde bei 37°C unter Schütteln weiter inkubiert. Bei Erreichen einer optischen Dichte von 0,8-1 OD600 nm wurde die Induktion durch Zugabe von 2,5 ml IPTG 0,1 M eingeleitet. Nach 4 Stunden Wachstum der Zellen bei 30 °C und Erreichen einer optischen Dichte von circa 3,0 OD600 nm wurde die gesamte Hauptkultur in einen Zentrifugenbecher überführt und für 15 min bei 4200 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Sediment in 40 ml eiskaltem 1X STE-Puffer (10 mM Tris/HCl pH 8,0; 100 mM NaCl; 0,1 mM EDTA) resuspendiert und in einen 50 ml Falcon-Becher überführt. Nach erneuter Zentrifugation der Suspension wurde der

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Überstand dekantiert und das Sediment bei –20 °C bis zum Aufschluss der Zellen gelagert. Im Falle der MutL-Präparation wurde sofort mit der weiteren Aufreinigung fortgefahren.

5.3.2 Zellaufschluss

Das Bakterienpellet wurde auf Eis aufgetaut und mit 15 ml kaltem Bindungspuffer (20 mM Tris/HCl pH 7,9; 1 M NaCl; 5 mM Imidazol; 1 mM PMSF; 1 mM Benzamidin) resuspendiert.

Die gelösten Zellen wurden anschließend mittels Ultraschall weiter aufgeschlossen. Dabei wurde für zwanzigmal für 15 sec beschallt mit jeweils 15 sec Pause dazwischen. Um eine Erhöhung der Temperatur zu vermeiden geschah der Aufschluss auf Eis. Im Anschluss wurden die unlöslichen Zellbestandteile von den löslichen durch einen Zentrifugationsschritt abgetrennt. Dies erfolgte bei 20000 rpm für 30 min bei 4°C in einer Beckmann-Zentrifuge mit Verwendung eines JA-20-Rotors. Der Überstand wurde direkt in einen 50 ml Grainer mit 10 ml Bindungspuffer und 1 ml Ni-NTA-Agaraose gegeben.

5.3.3 Aufreinigung mit Ni-NTA-Säulchen

Der 50 ml Grainer wurde für eine 1 h im Kühlraum (ca. 4°C) geschwenkt und anschließend für 2 min bei 4°C und 1500 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig entfernt und verworfen. Das Pellet mit 30 ml Waschpuffer (20 mM Tris/HCl pH 7,9; 1 M NaCl; 20 mM Imidazol; 1 mM PMSF; 1 mM Benzamidin) versetzt und für weiter 15 min im Kühlraum geschwenkt. Unter leichtem Schwenken wurde die Lösung anschließend auf ein Biorad-Säulchen übertragen. Nach Durchlauf der vollständigen Waschlösung wurde das Protein durch Zugabe von dreimal jeweils 2ml Elutionspuffer (20 mM Tris/HCl pH 7,9; 1 M NaCl;

500 mM Imidazol; 1 mM PMSF; 1 mM Benzamidin) eluiert. Die Protein-Konzentration der Fraktionen wurde photometrisch bestimmt und die Fraktion mit der höchsten Konzentration für die Gelfiltration verwendet.

5.3.4 Aufreinigung mittels Gelfiltrationssäule

Die weitere Aufreinigung erfolgte mittels FPLC und einer Sephadex 200-Säule. Die Fliessgeschwindigkeit des Laufpuffers (20 mM HEPES pH 8,0; 200 mM KCl; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT) betrug während der Auftrennung 0,5 ml / min. MutS konnte dadurch bei den Fraktionen zwischen 22 und 23 min aufgefangen werden. Die MutL-Fraktion konnte dagegen nach 17 min und MutH nach etwa 12 min isoliert werden.

bestimmt und die Enzyme mit flüssigen Stickstoff in kleinen Aliquots (5-10 µl) schockgefroren. Die Reinheit der Enzyme wurde mittels SDS-Gel überprüft.

5.3.5 Photometrische Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Konzentration der aufgereinigten MutH, MutL und MutS-Proteine wurde spektralphotometrisch bestimmt. Die Stammlösung wurde dazu 1:10 oder höher mit Reinstwasser verdünnt, in Quarzmikroküvetten (Fa. Helma; d = 1 cm) pipettiert und die Extinktion der Probe bei 240 bis 320 nm mit Hilfe eines U-3000-Spektralphotometers (Hitachi) gemessen. Der molekulare Extinktionskoeffizient (ε) der drei Enzyme inklusive His-tag konnte aufgrund der enthaltenen Tryptophan- und Tyrosin-Reste auf 34470, 54890 bzw.

73980 M-1 cm-1 festgelegt werden (Pace, 1995). Mit Hilfe der bei 280 nm bestimmten Extinktion (E) und der Schichtdicke der Küvette (d = 1 cm) ließ sich die Konzentration nach dem Lambert-Beerschen Gesetz (E = c * d * ε) berechnen.

5.4 Molekularbiologische Methoden