Mcm4 N-terminuste puhastamine

Im Dokument KASUTATUD LÜHENDID (Seite 41-55)

2. EKSPERIMENTAALOSA

2.3 Tulemused ja arutelu

2.3.4 Mcm4 N-terminuste puhastamine

Inimese ja hiire Mcm4 N-terminused ekspresseeriti puhastamiseks iseseisvalt ning eraldati Sf9 rakkude ekstraktist valkude külge liidetud FLAG-afiinsusjärjestuse kaudu. Mõlema organismi puhul puhastus valk kaksikbändina (Joonis 13A, B), mille põhjuseks oli

42

tõenäoliselt putukarakkudes toimunud modifitseerimine, arvatavasti kas fosforüleerimine või proteolüüs. Uurimaks, kas lisabändide teket põhjustas fosforüleeritud vorm, töödeldi valke λ-fosfataasiga (Joonis 13C). Töötluse tulemusel muutus ülemise bändi liikuvus mõlema organismi puhul, mis näitab, et ülemiste bändide puhul oli tõepoolest tegemist fosforüleeritud vormidega. Alumiste bändide liikuvus aga ei muutunud. Viimaste puhul võis seega tegu olla näiteks proteaaside lõigatud fragmentidega.

Joonis 13. Mcm4 N-terminuste puhastamine Sf9 rakkude ekstraktist ning valkude fosfataasitöötlus. Sf9 rakke nakatati hiire (A) ja inimese (B) Mcm4 N-terminust ekspresseerivate bakuloviirustega ning vastavad kompleksid puhastati valgu külge liidetud FLAG-afiinsusjärjestuse abil. FLAG-afiinsuskromatograafiakolonnist elueeritud fraktsioone 1-5 analüüsiti SDS-PAGE geelelektroforeesil, kasutades valkude visualiseerimiseks Coomassie valguvärvimislahust. Samu geele kasutati valkude kontsentratsiooni määramiseks, milleks võrreldi tundmatu kontsentratsiooniga Mcm4 N-terminuste signaalide intensiivsust teadaolevate BSA koguste intensiivsusega. Seetõttu on fraktsioone 2 ja 3 laetud kaks erinevat ruumala (teisi fraktsioone on laetud 4 µl). (C) Mcm4 N-terminuste töötlus λ-fosfataasiga. Valkude visualiseerimiseks kasutati Coomassie valguvärvimislahust.

(+) fosfataas lisatud, (-) fosfataas lisamata.

43 2.3.5 In vitro kinaasikatsed

Meie laboris tehtud kinaasikatsed inimese ja hiire täispikkade Mcm2-7 komplekside ning Chk1 ja Chk2 kinaasidega on näidanud, et mõlema organismi Chk1 kinaasi sihtmärkideks on Mcm4 ja Mcm3, samas kui Chk2 fosforüleerib üksnes Mcm3 ning vastav substraadiafiinsus on väga nõrk (Sandra Koit ja Ivar Ilves, avaldamata). Seetõttu valiti antud töös teostatud kinaasikatsetesse just Chk1.

Chk1 kinaasiga kineeriti esmalt inimese ja hiire trunkeeritud või täispikka Mcm4 sisaldavat Mcm2-7 kompleksi. Autoradiograafide kõrvutamisel hõbedaga värvitud geelidega andis mõlema organismi puhul signaali bänd, mis vastas koosjooksvatele Mcm3-le ja Mcm6-le (Joonis 14A, B). Arvatavasti fosforüleeriti siin just Mcm3, mida fosforüleeriti ka meie laboris teostatud varasemate kinaasikatsete käigus (S. Koit ja I. Ilves, avaldamata), ning lisaks on antud valk checkpoint-kinaaside sihtmärgiks ka harilikus äädikakärbses (Ilves et al., 2012).

Eelnevates kinaasikatsetes nähtud spetsiifilist Mcm4 fosforüleerimist ei olnud aga nii hiire kui inimese puhul käesolevas töös võimalik tuvastada (Joonis 14A, B). Selle põhjuseks oli arvatavasti reaktsioonimahust tulenevate limitatsioonide tõttu katsetes kasutatud substraadi ja kinaasi liialt madal kontsentratsioon (täpsemalt allpool). Iseseisvate Mcm4 N-terminuste kineerimisel nähti fosforüleerimissignaali mõlema organismi puhul (Joonis 14C).

Autoradiograafidel olid näha ka tugevad 70 kDa markerist allpool jooksvad signaalid, mis olid tingitud kinaaside autofosforüleerimisest.

Mcm4 N-terminuste kineerimisel nähtud fosforüleerimissignaal kinnitas, et Chk1 on nii hiires kui inimeses Mcm4 N-terminaalset regiooni võimeline fosforüleerima. Tegemist on kahtlemata tulemusega, mis toetab tugevalt käesoleva töö hüpoteesi, kuid samas ei ole antud katse siiski piisav, et fosforüleerimist kindlalt antud regiooni lokaliseerida. Kuna trunkeerimata Mcm4 sisaldanud Mcm2-7 kompleksi puhul Mcm4 fosforüleerimist ei nähtud, ei olnud käesoleva töö raames vastavat lokaliseerimist ka teostada võimalik. On tõenäoline, et täispika Mcm4 subühiku puhul ei nähtud fosforüleerimissignaali kinaasireaktsioonides kasutatud madalate substraadi kontsentratsioonide tõttu. Nii inimese kui hiire Mcm2-7 (4ΔN) kompleksid puhastusid väga madalas kontsentratsioonis, mida vaatamata kontsentreerimisele ei suudetud märkimisväärselt tõsta. Samuti ei olnud limiteeritud aja tõttu käesoleva töö raames kahjuks võimalik komplekse uuesti puhastada. Reaktsioonimahust tulenevate piirangute tõttu sai seepärast kineerimiskatsetes inimese komplekside puhul kasutada vaid 20 nM ning hiire puhul 40 nM substraati, mis arvatavasti ei ole fosforüleerimissignaali

44

nägemiseks piisav. Kuna Mcm4 N-terminused puhastusid võrreldes Mcm2-7 (4ΔN) kompleksidega märkimisväärselt kõrgemas kontsentratsioonis, sai nende puhul ka kinaasikatsetes tõsta substraadi 2,1 µM-ni. Seejuures jäeti kinaasi kontsentratsioon samaks hiire Mcm2-7 komplekside kineerimiskatses kasutatuga. N-terminuste kineerimisel nähtud signaal toetab seetõttu kahtlusi, et Mcm2-7 kompleksidega tehtud kinaasikatsetes jäi substraadi kontsentratsioon liialt madalaks. Käesolevas töös kasutatud substraadi ja kinaasi kontsentratsioonide juures nähtud Mcm3 fosforüleerimine tulenes arvatavasti lihtsalt Chk1 kinaasi suuremast afiinsusest antud substraadi suhtes. Ka varasemates katsetes, kus on nähtud Mcm4 fosforüleerimist, on Mcm3-le vastav signaal olnud alati tugevam (S. Koit ja I. Ilves, avaldamata).

Joonis 14. Kinaasitestide autoradiograafid ja hõbedaga värvitud polüakrüülamiidgeelid. Kõiki kinaasireaktsioone inkubeeriti temperatuuril 30 °C 30 min, misjärel lisati 1x lõppkontsentratsioonini 6x Laemmli SDS puhvrit ning keedeti 100 °C juures 5 min. Valguproovid lahutati SDS-PAGE geelelektroforeesil 1x SDS jooksupuhvris. Geelid värviti hõbeda meetodil (Mcm2-7 kompleksid) või Coomassie valguvärvimislahusega (Mcm4 N-terminused), kuivatati ühe tunni jooksul geelikuivatis (~ 90° C) ning radioaktiivne signaal jäädvustati

45

röntgenfilmile. (A) Inimese kinaasikatsete autoradiograaf (vasakul) ja hõbedaga värvitud polüakrüülamiidgeel (paremal). Autoradiograaf ja hõbedaga värvitud geel on paigutatud kohakuti ning on omavahel võrreldavad.

Katsetes kasutati 20 nM substraati ning 80 nM kinaasi. (+) Chk1 lisatud, (-) Chk1 lisamata. (B) Hiire kinaasikatsete autoradiograaf (vasakul) ja hõbedageel (paremal). Kineerimisel kasutati 40 nM substraati ja 400 nM kinaasi. (C) Hiire (vasakul) ja inimese (paremal) Mcm4 N-terminuste kineerimise autoradiograafid. Katsetes kasutati 400 nM kinaasi ja 2,1 µM substraati. Polüakrüülamiidgeel on näitamata, kuna Coomassie’ga värvitud geelil kaotasid bändid kuivatamisel värvi.

Teoreetiliselt võis erinevus Mcm2-7 kompleksis asuva täispika Mcm4 mittefosforüleerimise ja vaba Mcm4 N-terminuse fosforüleerimise vahel tuleneda ka fragmendi küljes olnud FLAG-afiinsusjärjestusest. Nimelt võib spetsiifiline afiinsusjärjestus teatud tingimustel luua kinaasile sobiva kinnitumispaiga, mis võimaldab sel fosforüleerida muidu kättesaamatuid aminohappejääke. Ehkki antud võimalus on vähetõenäoline, tuleks kahtluse välistamiseks katseid kas afiinsusjärjestuseta või mõne alternatiivse järjestusega varustatud valguga korrata.

Käesolevas töös konstrueeriti tulemuslikult rekombinantsed bakuloviirused, mis ekspresseerivad inimese ja hiire rekombinantseid valke Mcm4ΔN, Mcm4N-term ja Gins2ΔC.

Need võimaldavad Mcm2-7 ja GINS komplekside subühikutes Mcm4 ja Gins2 checkpoint-kinaaside arvatavate sihtmärkpiirkondade lokaliseerimist ning hõlbustavad seeläbi hilisemat sihtmärkaminohappejääkide massispektromeetrilist kaardistamist. Antud juhul puhastusid Mcm2-7 (4ΔN) kompleksid siiski sedavõrd madalas kontsentratsioonis, et neid ei olnud võimalik loodetud eesmärgil kasutada. Seetõttu tuleks komplekside puhastamist tulevikus korrata. Nii inimese kui hiire Mcm4 N-terminused puhastusid aga kõrges kontsentratsioonis ning nendega tehtud kinaasikatsed kinnitavad, et Chk1 fosforüleerib antud piirkonda jäävaid aminohappejääke mõlemas organismis. See tulemus on kooskõlas varasemates kinaasikatsetes nähtuga ning on kogu kõrgemates eukarüootides toimuva võimaliku CMG inhibeerimise probleemi uurimise seisukohalt tugevalt toetavaks informatsiooniks. Ootele jääb käesoleval hetkel Gins2ΔC valku ekspresseeriv bakuloviirus, kuna checkpoint-kinaasid seda nii inimeses kui hiires ei fosforüleeri. Vastav GINS (2ΔC) kompleks võib rakendust leida siiski tulevikus, kui puhastatakse järgmised genotoksilise stressi vastuskinaasid.

46

KOKKUVÕTE

Genoomi replikatsioon on fundamentaalne protsess, mis on aluseks rakkude paljunemisele.

Replikatsiooni viib läbi spetsiifiline masinavärk – replisoom –, mille liikumapanevaks jõuks on eukarüootides replikatsiooni initsiatsioonietapi käigus komplekteeritav replikatiivne CMG helikaas. Oma keskse rolli tõttu replisoomi funktsioneerimises on CMG helikaas ühtlasi oluline replikatsiooni reguleerivate kinaaside sihtmärk. Ilves et al. (2012) on näidanud, et hariliku äädikakärbse rakutsükli kontrollkinaas Chk2 inhibeerib CMG helikaasi antud kompleksi kuuluvate valkude Mcm3, Mcm4 ning Psf2 (Gins2) fosforüleerimise kaudu.

Seejuures lokaliseeriti Mcm4 puhul kinaasi sihtmärkaminohappejäägid subühiku N-terminaalsesse ning Psf2 puhul vastavalt C-N-terminaalsesse piirkonda.

Käesoleva bakalaureusetöö lähtepunktiks oli huvi uurida, kas sarnane CMG helikaasi regulatsioon toimub ka kõrgemates eukarüootides, täpsemalt inimeses ja koduhiires. Töö eesmärgiks oli valmistada inimese ja hiire Mcm2-7 ja GINS komplekside subühikutel Mcm4 ja Gins2 põhinevad ekspressioonivektorid, mille abil ekspresseeritavad rekombinantsed valgud võimaldaksid S-faasi kontrollpunkti vastuskinaaside märklaudaminohappejääkide lokaliseerimist eelpoolmainitud piirkondadesse ning hõlbustaksid ja kiirendaksid sellega konkreetsete märklaudaminohappejääkide hilisemat massispektromeetrilist kaardistamist.

Lisaks plaaniti mõlema organismi puhul puhastada valmistatud ekspressioonivektoreid kasutades Mcm4 subühikul põhinenud valgud, et analüüsida rakutsükli kontrollkinaas Chk1 sihtmärkaminohappejääkide paiknemist Mcm4 N-terminaalses piirkonnas.

Töö tulemusel konstrueeriti inimese ja hiire Mcm4 ja Gins2 valkude trunkeeritud vorme ning Mcm4 N-terminaalset piirkonda ekspresseerivad bakuloviirusvektorid. Seejuures näidati, et kõik soovitud valgud olid putukarakkudes ka edukalt ekspresseeritud. Seejärel puhastati mõlema organismi puhul iseseisev Mcm4 N-terminus ja deletsiooniga Mcm4 subühikut sisaldanud Mcm2-7 kompleks ning analüüsiti nende fosforüleerimist Chk1 kinaasi poolt. In vitro kinaasikatsed näitasid, et nii inimeses kui hiires on Chk1 tõepoolest võimeline iseseisvalt ekspreseeritud Mcm4 N-terminaalset piirkonda fosforüleerima. Lisaks nähti mõlema organismi puhul nii täispikka kui trunkeeritud Mcm4 sisaldanud Mcm2-7 kompleksis oodatult Mcm3 fosforüleerimist. Mcm4 fosforüleerimist nii inimese kui hiire täispikka Mcm4 sisaldanud Mcm2-7 kompleksis antud juhul aga ei nähtud, mille põhjuseks oli arvatavasti kasutatud valkude madal kontsentratsioon. Seega ei olnud käesoleva töö raames võimalik fosforüleerimist eksklusiivselt Mcm4 N-terminaalsesse regiooni lokaliseerida.

47

The Mcm4 and Gins2 subunits of the replicative CMG helicase as possible substrates of the checkpoint kinase Chk1

Märt Rannap

SUMMARY

In order to ensure viable offspring, cell division requires high fidelity replication of the entire genome. Central to achieving this feat is the replication machinery, or the replisome, which is assembled during the initiation stage of DNA replication. In eukaryotes, assembly of the replisome revolves around the formation of the replicative CMG (Cdc45-Mcm2-7-GINS) helicase and is divided into two distinct steps. During the first step two copies of the core of the CMG complex, the hexameric Mcm2-7 helicase, are loaded onto chromatin in an inactive form. These are then activated during the second step, when two activation factors, the protein Cdc45 and the GINS complex, interact with the hexamer, forming the replicative helicase.

Together with the additional factors three DNA polymerases are also brought to the helicase, leading to the formation of the active replisome.

The CMG helicase is not just essential for regular replication, but also plays a crucial role during replication under conditions of genotoxic stress – a phenomenon which occurs when DNA becomes damaged by genotoxins. The primary means of dealing with genotoxic stress during replication is the active slowing of the S-phase, which provides the cell with additional time to eliminate any damage to DNA. This is achieved through kinases activated by the S-phase checkpoint, which have been shown to phosphorylate different subunits of the Mcm2-7 hexamer, as well as two initiation factors, inhibiting the formation of the active CMG helicase. Recent data by Ilves et al. (2012) suggests, however, that in Drosophila melanogaster also already active replisomes might be inhibited through the phosphorylation of the Mcm3 subunit, as well as the N-terminal tail of the Mcm4 and the C-terminal tail of the Gins2 subunits of the CMG helicase and that this phosphorylation might also be present in other metazoa.

Hypothesizing that the latter is true, the aim of this study was to construct recombinant baculoviral expression vectors expressing the modified human and mouse CMG subunits Mcm4 and Gins2, which would facilitate the mass spectrometrical identification of the exact

48

amino acid residues phosphorylated by different S-phase checkpoint response kinases in these two proteins. As a result of the study, six baculoviral expression vectors expressing the human and mouse truncated Mcm4 and Gins2 proteins and additionally the truncated N-terminal region of Mcm4 were created. It was verified that all of the baculoviral constructs successfully expressed the intended recombinant protein.

Both human and mouse Mcm2-7 complexes, containing the truncated Mcm4 subunit, and the individual N-terminal regions of Mcm4 were then purified to study their phosphorylation in vitro by the checkpoint kinase Chk1. It was demonstrated that Chk1 phosphorylates the N-terminal region of Mcm4 in both human and mouse. The Mcm2-7 complexes containing the truncated Mcm4 subunit purified, however, at such low concentrations, that they could not be used for localization of the phosphorylation signal. These complexes should therefore be purified again in the future with an emphasis on maximum yield of the process.

49

KASUTATUD KIRJANDUSE LOETELU

Bae, B., Chen, Y.-H., Costa, A., Onesti, S., Brunzelle, J.S., Lin, Y., Cann, I.K.O., and Nair, S.K. (2009). Insights into the Architecture of the Replicative Helicase from the Structure of an Archaeal MCM Homolog. Structure 17, 211–222.

Barry, E.R., McGeoch, A.T., Kelman, Z., and Bell, S.D. (2007). Archaeal MCM has separable processivity, substrate choice and helicase domains. Nucleic Acids Res. 35, 988–

998.

Bell, S.P., and Dutta, A. (2002). Dna Replication in Eukaryotic Cells. Annu. Rev. Biochem.

71, 333–374.

Bochman, M.L., and Schwacha, A. (2009). The Mcm Complex: Unwinding the Mechanism of a Replicative Helicase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73, 652–683.

Boos, D., Frigola, J., and Diffley, J.F. (2012). Activation of the replicative DNA helicase:

breaking up is hard to do. Curr. Opin. Cell Biol. 24, 423–430.

Bowers, J.L., Randell, J.C.W., Chen, S., and Bell, S.P. (2004). ATP Hydrolysis by ORC Catalyzes Reiterative Mcm2-7 Assembly at a Defined Origin of Replication. Mol. Cell 16, 967–978.

Brewster, A.S., and Chen, X.S. (2010). Insights into the MCM functional mechanism: lessons learned from the archaeal MCM complex. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 45, 243–256.

Brewster, A.S., Wang, G., Yu, X., Greenleaf, W.B., Carazo, J.M., Tjajadi, M., Klein, M.G., and Chen, X.S. (2008). Crystal structure of a near-full-length archaeal MCM: Functional insights for an AAA+ hexameric helicase. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 20191–20196.

Cannon, B., Kuhnlein, J., Yang, S.-H., Cheng, A., Schindler, D., Stark, J.M., Russell, R., and Paull, T.T. (2013). Visualization of local DNA unwinding by Mre11/Rad50/Nbs1 using single-molecule FRET. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 18868–18873.

Chang, Y.P., Wang, G., Bermudez, V., Hurwitz, J., and Chen, X.S. (2007). Crystal structure of the GINS complex and functional insights into its role in DNA replication. Proc. Natl.

Acad. Sci. 104, 12685–12690.

Chibazakura, T., McGrew, S.G., Cooper, J.A., Yoshikawa, H., and Roberts, J.M. (2004).

Regulation of cyclin-dependent kinase activity during mitotic exit and maintenance of genome stability by p21, p27, and p107. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4465–4470.

Choi, J.M., Lim, H.S., Kim, J.J., Song, O.-K., and Cho, Y. (2007). Crystal structure of the human GINS complex. Genes Dev. 21, 1316–1321.

Cimprich, K.A., and Cortez, D. (2008). ATR: an essential regulator of genome integrity. Nat.

Rev. Mol. Cell Biol. 9, 616–627.

Cortez, D., Glick, G., and Elledge, S.J. (2004). Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 10078–10083.

50

Costa, A., and Onesti, S. (2009). Structural biology of MCM helicases. Crit. Rev. Biochem.

Mol. Biol. 44, 326–342.

Costa, A., Ilves, I., Tamberg, N., Petojevic, T., Nogales, E., Botchan, M.R., and Berger, J.M.

(2011). The structural basis for MCM2–7 helicase activation by GINS and Cdc45. Nat. Struct.

Mol. Biol. 18, 471–477.

Costa, A., Renault, L., Swuec, P., Petojevic, T., Pesavento, J.J., Ilves, I., MacLellan-Gibson, K., Fleck, R.A., Botchan, M.R., and Berger, J.M. (2014). DNA binding polarity, dimerization, and ATPase ring remodeling in the CMG helicase of the eukaryotic replisome. eLife 3, e03273.

Coster, G., Frigola, J., Beuron, F., Morris, E.P., and Diffley, J.F.X. (2014). Origin Licensing Requires ATP Binding and Hydrolysis by the MCM Replicative Helicase. Mol. Cell 55, 666–

677.

Davey, M.J., Indiani, C., and O’Donnell, M. (2003). Reconstitution of the Mcm2-7p Heterohexamer, Subunit Arrangement, and ATP Site Architecture. J. Biol. Chem. 278, 4491–

4499.

Dhar, M.K., Sehgal, S., and Kaul, S. (2012). Structure, replication efficiency and fragility of yeast ARS elements. Res. Microbiol. 163, 243–253.

Diffley, J.F.X. (2004). Regulation of Early Events in Chromosome Replication. Curr. Biol.

14, R778–R786.

Edwards, M.C., Tutter, A.V., Cvetic, C., Gilbert, C.H., Prokhorova, T.A., and Walter, J.C.

(2002). MCM2–7 Complexes Bind Chromatin in a Distributed Pattern Surrounding the Origin Recognition Complex inXenopus Egg Extracts. J. Biol. Chem. 277, 33049–33057.

Erzberger, J.P., and Berger, J.M. (2006). Evolutionary Relationships and Structural Mechanisms of Aaa+ Proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 93–114.

Evrin, C., Clarke, P., Zech, J., Lurz, R., Sun, J., Uhle, S., Li, H., Stillman, B., and Speck, C.

(2009). A double-hexameric MCM2-7 complex is loaded onto origin DNA during licensing of eukaryotic DNA replication. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 20240–20245.

Falck, J., Mailand, N., Syljuåsen, R.G., Bartek, J., and Lukas, J. (2001). The ATM–Chk2–

Cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis. Nature 410, 842–

847.

Forsburg, S.L. (2004). Eukaryotic MCM Proteins: Beyond Replication Initiation. Microbiol.

Mol. Biol. Rev. 68, 109–131.

Francis, L.I., Randell, J.C.W., Takara, T.J., Uchima, L., and Bell, S.P. (2009). Incorporation into the prereplicative complex activates the Mcm2–7 helicase for Cdc7–Dbf4 phosphorylation. Genes Dev. 23, 643–654.

Gambus, A., Jones, R.C., Sanchez-Diaz, A., Kanemaki, M., van Deursen, F., Edmondson, R.D., and Labib, K. (2006). GINS maintains association of Cdc45 with MCM in replisome progression complexes at eukaryotic DNA replication forks. Nat. Cell Biol. 8, 358–366.

Gambus, A., Khoudoli, G.A., Jones, R.C., and Blow, J.J. (2011). MCM2-7 Form Double Hexamers at Licensed Origins in Xenopus Egg Extract. J. Biol. Chem. 286, 11855–11864.

51

Guo, Z., Kozlov, S., Lavin, M.F., Person, M.D., and Paull, T.T. (2010). ATM Activation by Oxidative Stress. Science 330, 517–521.

Holt, L.J., Tuch, B.B., Villén, J., Johnson, A.D., Gygi, S.P., and Morgan, D.O. (2009). Global Analysis of Cdk1 Substrate Phosphorylation Sites Provides Insights into Evolution. Science 325, 1682–1686.

Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J.J., and Botchan, M.R. (2010). Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins. Mol. Cell 37, 247–258.

Ilves, I., Tamberg, N., and Botchan, M.R. (2012). Checkpoint kinase 2 (Chk2) inhibits the activity of the Cdc45/MCM2-7/GINS (CMG) replicative helicase complex. Proc. Natl. Acad.

Sci. U. S. A. 109, 13163–13170.

Ishimi, Y., Komamura-Kohno, Y., Kwon, H.-J., Yamada, K., and Nakanishi, M. (2003).

Identification of MCM4 as a Target of the DNA Replication Block Checkpoint System. J.

Biol. Chem. 278, 24644–24650.

Iyer, L.M., Leipe, D.D., Koonin, E.V., and Aravind, L. (2004). Evolutionary history and higher order classification of AAA+ ATPases. J. Struct. Biol. 146, 11–31.

Jenkinson, E.R., and Chong, J.P.J. (2006). Minichromosome maintenance helicase activity is controlled by N- and C-terminal motifs and requires the ATPase domain helix-2 insert. Proc.

Natl. Acad. Sci. 103, 7613–7618.

Joaquin, A., and Fernandez-Capetillo, O. (2012). Signalling DNA Damage. In Protein Phosphorylation in Human Health, C. Huang, ed. (InTech),.

Kamimura, Y., Tak, Y.-S., Sugino, A., and Araki, H. (2001). Sld3, which interacts with Cdc45 (Sld4), functions for chromosomal DNA replication in Saccharomyces cerevisiae.

EMBO J. 20, 2097–2107.

Kang, Y.-H., Galal, W.C., Farina, A., Tappin, I., and Hurwitz, J. (2012). Properties of the human Cdc45/Mcm2-7/GINS helicase complex and its action with DNA polymerase ε in rolling circle DNA synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 6042–6047.

Kasiviswanathan, R., Shin, J.-H., Melamud, E., and Kelman, Z. (2004). Biochemical Characterization of the Methanothermobacter thermautotrophicus Minichromosome Maintenance (MCM) Helicase N-terminal Domains. J. Biol. Chem. 279, 28358–28366.

Kaykov, A., and Nurse, P. (2015). The spatial and temporal organization of origin firing during the S-phase of fission yeast. Genome Res. 25, 391–401.

Klemm, R.D., Austin, R.J., and Bell, S.P. (1997). Coordinate Binding of ATP and Origin DNA Regulates the ATPase Activity of the Origin Recognition Complex. Cell 88, 493–502.

Knott, S.R.V., Peace, J.M., Ostrow, A.Z., Gan, Y., Rex, A.E., Viggiani, C.J., Tavaré, S., and Aparicio, O.M. (2012). Forkhead Transcription Factors Establish Origin Timing and Long-Range Clustering in S. cerevisiae. Cell 148, 99–111.

Krastanova, I., Sannino, V., Amenitsch, H., Gileadi, O., Pisani, F.M., and Onesti, S. (2012).

Structural and Functional Insights into the DNA Replication Factor Cdc45 Reveal an Evolutionary Relationship to the DHH Family of Phosphoesterases. J. Biol. Chem. 287, 4121–4128.

52

Lam, S.K.W., Ma, X., Sing, T.L., Shilton, B.H., Brandl, C.J., and Davey, M.J. (2013). The PS1 Hairpin of Mcm3 Is Essential for Viability and for DNA Unwinding In Vitro. PLoS ONE 8, e82177.

Lee, J.-H., and Paull, T.T. (2005). ATM Activation by DNA Double-Strand Breaks Through the Mre11-Rad50-Nbs1 Complex. Science 308, 551–554.

Lee, J.-K., and Hurwitz, J. (2001). Processive DNA helicase activity of the minichromosome maintenance proteins 4, 6, and 7 complex requires forked DNA structures. Proc. Natl. Acad.

Sci. 98, 54–59.

Li, M., and Zhang, P. (2009). The function of APC/CCdh1 in cell cycle and beyond. Cell Div.

4, 2.

Lisby, M., and Rothstein, R. (2004). DNA damage checkpoint and repair centers. Curr. Opin.

Cell Biol. 16, 328–334.

Ancestral paralogs and pseudoparalogs and their role in the emergence of the eukaryotic cell.

Nucleic Acids Res. 33, 4626–4638.

Mantiero, D., Mackenzie, A., Donaldson, A., and Zegerman, P. (2011). Limiting replication initiation factors execute the temporal programme of origin firing in budding yeast. EMBO J.

30, 4805–4814.

Masai, H., Matsumoto, S., You, Z., Yoshizawa-Sugata, N., and Oda, M. (2010). Eukaryotic Chromosome DNA Replication: Where, When, and How? Annu. Rev. Biochem. 79, 89–130.

Matsuoka, S., Ballif, B.A., Smogorzewska, A., McDonald, E.R., Hurov, K.E., Luo, J., Bakalarski, C.E., Zhao, Z., Solimini, N., Lerenthal, Y., et al. (2007). ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science 316, 1160–

1166.

Mazouzi, A., Velimezi, G., and Loizou, J.I. (2014). DNA replication stress: Causes, resolution and disease. Exp. Cell Res. 329, 85–93.

McGarry, T.J., and Kirschner, M.W. (1998). Geminin, an Inhibitor of DNA Replication, Is Degraded during Mitosis. Cell 93, 1043–1053.

McGeoch, A.T., Trakselis, M.A., Laskey, R.A., and Bell, S.D. (2005). Organization of the archaeal MCM complex on DNA and implications for the helicase mechanism. Nat. Struct.

Mol. Biol. 12, 756–762.

Muramatsu, S., Hirai, K., Tak, Y.-S., Kamimura, Y., and Araki, H. (2010). CDK-dependent complex formation between replication proteins Dpb11, Sld2, Pol ɛ, and GINS in budding yeast. Genes Dev. 24, 602–612.

53

Ogura, T., Whiteheart, S.W., and Wilkinson, A.J. (2004). Conserved arginine residues implicated in ATP hydrolysis, nucleotide-sensing, and inter-subunit interactions in AAA and AAA+ ATPases. J. Struct. Biol. 146, 106–112.

Pacek, M., and Walter, J.C. (2004). A requirement for MCM7 and Cdc45 in chromosome unwinding during eukaryotic DNA replication. EMBO J. 23, 3667–3676.

De Piccoli, G., Katou, Y., Itoh, T., Nakato, R., Shirahige, K., and Labib, K. (2012).

Replisome Stability at Defective DNA Replication Forks Is Independent of S Phase Checkpoint Kinases. Mol. Cell 45, 696–704.

Poplawski, A., Grabowski, B., Long, S.E., and Kelman, Z. (2001). The Zinc Finger Domain of the Archaeal Minichromosome Maintenance Protein Is Required for Helicase Activity. J.

Biol. Chem. 276, 49371–49377.

Remus, D., Beuron, F., Tolun, G., Griffith, J.D., Morris, E.P., and Diffley, J.F.X. (2009).

Concerted Loading of Mcm2–7 Double Hexamers around DNA during DNA Replication Origin Licensing. Cell 139, 719–730.

Rhind, N., and Gilbert, D.M. (2013). DNA Replication Timing. Cold Spring Harb. Perspect.

Biol. 5, a010132.

Sachs, R.K., Chen, P.-L., Hahnfeldt, P.J., and Hlatky, L.R. (1992). DNA damage caused by ionizing radiation. Math. Biosci. 112, 271–303. Docking Site-Mediated Mechanism to Promote S Phase Progression. Mol. Cell 24, 101–113.

Shi, Y., Dodson, G.E., Mukhopadhyay, P.S., Shanware, N.P., Trinh, A.T., and Tibbetts, R.S.

(2007). Identification of Carboxyl-terminal MCM3 Phosphorylation Sites Using Polyreactive Phosphospecific Antibodies. J. Biol. Chem. 282, 9236–9243.

Tak, Y.-S., Tanaka, Y., Endo, S., Kamimura, Y., and Araki, H. (2006). A CDK‐catalysed regulatory phosphorylation for formation of the DNA replication complex Sld2–Dpb11.

EMBO J. 25, 1987–1996.

Tanaka, S., Umemori, T., Hirai, K., Muramatsu, S., Kamimura, Y., and Araki, H. (2007).

CDK-dependent phosphorylation of Sld2 and Sld3 initiates DNA replication in budding yeast.

Nature 445, 328–332.

Trenz, K., Errico, A., and Costanzo, V. (2008). Plx1 is required for chromosomal DNA replication under stressful conditions. EMBO J. 27, 876–885.

Wohlschlegel, J.A., Dwyer, B.T., Dhar, S.K., Cvetic, C., Walter, J.C., and Dutta, A. (2000).

Inhibition of Eukaryotic DNA Replication by Geminin Binding to Cdt1. Science 290, 2309–

Inhibition of Eukaryotic DNA Replication by Geminin Binding to Cdt1. Science 290, 2309–

Im Dokument KASUTATUD LÜHENDID (Seite 41-55)

ÄHNLICHE DOKUMENTE