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5.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli mit Hilfe eines „Mini-Präp-Kits“

Die Anzucht entsprechender E. coli-Klone erfolgte über Nacht bei 37 °C in 5 ml Selektivmedium auf einem Rotationsschüttler. Die Präparation erfolgte nach Protokoll des „QIAprep® Spin Miniprep Kit“ (QIAGEN GmbH) nach Angaben des Herstellers.

Die Plasmid-DNA wurde in 50 µl Elutionspuffer für Klonierungszwecke oder in 50 µl

„HiPerSolv Chromanorm H2O“ (VWR International GmbH) für die Sequenzierung bzw. Restriktion aufgenommen und die Konzentration der DNA-Lösung wurde photometrisch bei 260 nm mit dem „NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer“

Methoden

148 (FISHER SCIENTIFIC GmbH) bestimmt. Die DNA-Lösung wurde bei -20 °C aufbewahrt.

5.2.2 Minipräparation von Plasmid-DNA aus E. coli (Birnboim & Doly, 1979) Die Anzucht des gewünschten E. coli-Stamms erfolgte in 5 ml Selektivmedium über Nacht. 1,5 ml Übernachtkultur wurden 1 min bei 13.000 UpM zentrifugiert und das Pellet in 100 μl Lösung 1 resuspendiert. Die Lysis der Zellen erfolgte durch Zugabe von 200 μl Lösung 2, wobei das Reaktionsgefäß kurz invertiert wurde. Der maximal 5-minütigen Inkubation auf Eis folgte die Zugabe von 250 μl Lösung 3 zur Neutralisation des Ansatzes, gefolgt von einer weiteren 5-minütigen Inkubation auf Eis. Nach einer 10-minütigen Zentrifugation bei 13.000 UpM und 4 °C zur Abtrennung chromosomaler DNA und denaturierter Proteine wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Es wurden 5 μl RNase A (10 mg/ml) (METABION INTERNATIONAL AG) hinzugegeben und der Ansatz für 15 min bei 37 °C inkubiert. Die Entfernung von Proteinresten aus der Lösung erfolgte anschließend durch Zugabe von 1 Volumen TE-gesättigter „Roti®-Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung“ im Verhältnis 25 : 24 : 1 (CARL ROTH GmbH & Co. KG), gefolgt von einer 10-minütigen Zentrifugation bei 13.000 UpM. Zur Fällung der DNA aus der wässrigen Phase wurde im Anschluss 1 Volumen eiskaltes EtOH zugegeben und das Gemisch für 20 min bei -20 °C inkubiert.

Nach einer weiteren Zentrifugation für 10 min bei 13.000 UpM wurde das entstandene Pellet luftgetrocknet und in 50 µl „HiPerSolv Chromanorm H2O“ (VWR International GmbH) aufgenommen. (Birnboim & Doly, 1979)

5.2.3 Isolierung von Gesamt-DNA aus S. cerevisiae: „Smash & Grab“ (Hoffman

& Winston, 1987)

10 ml Hefekultur wurden in YPD über Nacht bei 30 °C angezogen. Die Zellernte erfolgte durch Zentrifugation für 5 min bei 4.000 UpM. Die Zelle wurden mit 500 μl H2O gewaschen und anschließend in 200 μl Lysierungspuffer resuspendiert. Nach Zugabe von 200 μl Glasperlen (Ø 0,25-0,50 mm) und 200 μl einer TE-gesättigten Roti®-Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung (Verhältnis 25 : 24 : 1) (CARL ROTH GmbH & Co. KG) wurden die Zellen durch 10-minütiges Schütteln auf einem

149

„Vibrax Basic“ (IKA) bei 4 °C aufgebrochen. Es folgte ein Zentrifugationsschritt bei 13.000 UpM für 10 min, nach dem die wässrige Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt wurde. Nach Vermischung mit 1 ml 100%igen eiskaltem EtOH wurde die Lösung für 10 min bei -20 °C inkubiert und dann 10 min bei 13.000 UpM abzentrifugiert. Das Pellet wurde getrocknet, in 400 μl ddH2O mit 5 μl RNase A (10 mg/ml) (METABION INTERNATIONAL AG) gelöst und 5 min bei 37 °C inkubiert. Nach einer weiteren Fällung durch 1 ml eiskaltes 100%iges EtOH und Zentrifugation bei 13.000 UpM für 5 min wurde das luftgetrocknete Pellet in 50 µl

„HiPerSolv Chromanorm H2O“ (VWR International GmbH) oder dem entsprechenden Volumen TE-Puffer aufgenommen. In dieser Form wurde die DNA bei -20 °C aufbewahrt und als Matrize für PCR eingesetzt oder für die Restriktion verwendet.

(Hoffman & Winston, 1987)

5.2.4 Polymerase-Kettenreaktion „PCR“ (modifiziert nach Saiki et al., 1985) Für die Polymerase-Kettenreaktion wurden die thermostabilen Enzyme KOD-DNA-Polymerase (NOVAGEN), Taq-DNA-Polymerase (METABION INTERNATIONAL AG) und „PhusionTM High-Fidelity“-DNA-Polymerase (FINNZYMES) verwendet.

Üblicherweise wurden für einen 1-fachen Reaktionsansatz 5 μl 10x PCR-Puffer, 1 μl dNTPs (jeweils 10 mM), 1 μl jedes Oligonukleotids (auf 20 mM verdünnt), 1 μl Matrizen-DNA (~100 ng), 1 μl Polymerase und 40 µl „HiPerSolv Chromanorm H2O“

(VWR International GmbH) verwendet bzw. das Protokoll entsprechend den Angaben des Herstellers angepasst. Die Art und Dauer des Temperaturprofils richtete sich nach den Angaben der Hersteller, den verwendeten Oligonukleotiden und der Matrize und wurde entweder in einem PCR-Block „Primus 25 advanced“ oder „Primus 96 advanced“ (PEQLAB BIOTECHNOLOGIE GmbH) ausgeführt:

1. 94 °C – 98 °C 2 min initiale Denaturierung 2. 94 °C – 98 °C 15 s Denaturierung

3. 50 °C – 60 °C 30 s Hybridisierung 4. 68 °C – 72 °C 0,5-7 min Elongation 5. 68 °C – 72 °C 5 min finale Elongation

Die Schritte 2. – 4. wurden hierbei 30x wiederholt. (Saiki et al., 1985)

Methoden

150 5.2.5 Sequenzspezifische Mutagenese (Quick-Change Mutagenese)

Zur Einbringung einer Punktmutation in ein Plasmid wurde das Quickchange Site-Directed Mutagenesis-Protokoll von STRATAGENE eingesetzt. Dafür wurden zwei revers-komplementäre Oligonukleotide verwendet, die zwischen zwei je 12 bp langen Regionen das gewünschte Codon trugen. Mithilfe dieser Oligonukleotide wurde das gesamte Plasmid – samt der einzubringenden Mutation – dupliziert. Durch eine Restriktion mit DpnI wurden die methylierten partenalen Plasmide abgebaut. Der so erhaltene Ansatz wurde in elektrokompetente E. coli transformiert und die bei der PCR entstandenen freien DNA-Enden in vivo verknüpft. Für diese PCR wurde die

„PhusionTM High-Fidelity“-DNA-Polymerase (FINNZYMES) verwendet. Es wurden 50 µl Reaktionsansätze angesetzt, die 1 µl Matrizen-DNA, 2 µl dNTPs (jeweils 10 mM), 1 µl Oligonukleotide (25 mM), 0,5 µl Polymerase, 2 µl MgCl2, 10 µl 5x HF-Puffer, 32,5 µl „HiPerSolv Chromanorm H2O“ (VWR International GmbH) beinhalteten.

Das PCR-Programm wurde wie folgt angepasst:

1. 98 °C 2 min initiale Denaturierung 2. 98 °C 15 s Denaturierung

3. 55 °C 30 s Hybridisierung 4. 72 °C 3,5 min Elongation 5. 72 °C 5 min finale Elongation

Die Schritte 2.- 4. wurden hierbei 35-mal wiederholt.

5.2.6 Restriktion von DNA

Zur Restriktionsenzymatischen Spaltung doppelsträngiger DNA wurden verschiedene DNA-Endonukleasen und korrespondierende Puffersysteme der Firmen FERMENTAS GmbH und NEW ENGLAND BIOLABS Inc. verwendet. Die Pufferbedingungen wurden nach Angaben des Herstellers gewählt und bei Doppelverdauen wurde auf die Pufferkompatibilitätstabellen des jeweiligen Herstellers zurückgegriffen. Für analytische Restriktionsreaktionen wurden ~0,5 µg DNA mit 1-2 Units Restriktionsenzym in einem Volumen von 20 µl für 2-3 h oder über Nacht bei 37 °C inkubiert. Für die Restriktion präparativer DNA-Mengen wurden die Ansätze

151 entsprechend angepasst. Restriktionen mit mehreren Enzymen wurden wahlweise zusammen oder sequenziell durchgeführt. Die Inaktivierung der Restriktionsenzyme erfolgte durch Hitze für 20 min bei 65 °C oder 80 °C und führte so zum Abstoppen der Reaktion.

5.2.7 Zusammenlagerung einzelsträngiger DNA-Fragmente

Um doppelsträngige DNA für Klonierungszwecke zu erhalten, wurden synthetische Oligonukleotide (METABION INTERNATIONAL AG) verwendet. Je 1 µmol der vorwärts- und rückwärts-orientierten Oligonukleotide wurden zusammen mit einem Reaktionspuffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Hcl pH 8,0) in einem Gesamtvolumen von 400 µl eingesetzt. Der Ansatz wurde für 15 min bei 95 °C in einem Heizblock erhitzt und anschließend im deaktivierten Heizblock auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde bei -20 °C aufbewahrt. Die so hergestellten DNA-Fragmente wurden anschließend für die Klonierung verwendet und waren so angelegt, dass nach der Zusammenlagerung überhängende Enden mit einer XhoI und degenerierten Acc65I (5„-G˄GTACC-3„ → 5„AGTACC-3„) entstehen. Für die späteren Ligationsreaktionen wurden die DNA-Fragmente auf 10 nmol/µl verdünnt.

5.2.8 Dephosphorylierung und Ligation von DNA

Für die Dephosphorylierung der 5„-Enden linearisierten DNA-Fragmente wurde die DNA direkt im Anschluss an den Restriktionsverdau mit „Alkalische Phosphatase - Shrimp; Cat. No. 1 758 250“ (ROCHE GmbH) in dem vorgesehenen Puffer für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte durch Erhitzen auf 65 °C für 15 min.

5.2.9 Phosphorylierung von DNA-Fragmenten

Die zusammengelagerten synthetischen Oligonukleotide (vgl. Kapitel 5.2.7) trugen keine 5„-Phosphatgruppe. Daher musste die γ-ständige Phosphatgruppe eines ATPs für weitere Klonierungsschritte mit dem freien 5‟Hydroxyl verestert werden. Die

DNA-Methoden

152 Fragmente wurden dazu in einem Phosphorylierungsansatz mit T4-Polnukleotidkinase (FERMENTAS GmbH), Reaktionspuffer und ATP nach Herstellerangaben inkubiert.

5.2.10 Ligation von DNA (modifiziert nach Maniatis et al., 1982 )

Die Ligation von DNA-Fragmenten erfolgte in einem 20 µl Reaktionsansatz mit Ligationspuffer durch 5 U T4-DNA-Ligase (FERMENTAS GmbH). Die überhängenden DNA-Enden wurden durch Inkubation der Reaktion für 2 h bei Raumtemperatur oder für 8 h bei 16 °C verbunden. Die Konzentration der DNA betrug 1-10 µg/ml, wobei das Verhältnis von Vektor- zu Insert-DNA zwischen 1:5 und 1:10 lag. Die Ligationsreaktion wurde durch 10-minütiges Erhitzen auf 65 °C gestoppt und der Ansatz ohne weitere Aufreinigung zur Transformation eingesetzt. Für die Transformation elektrokompetenter E. coli-Stämme durch Elektroporation erfolgte eine Dialyse des Ligationsprodukts. (Maniatis et al., 1982)

5.2.11 S. cerevisiae in vivo-Ligation (modifiziert nach Jansen et al., 2005)

Ein linearisierter Vektor und ein DNA-Insert, deren Enden jeweils homolog zueinander waren, wurden zusammen in S. cerevisiae transformiert. Das Insert wurde dabei durch homologe Rekombination in vivo in den Vektor eingefügt. Die homologen Bereiche umfassten hierbei jeweils 45 bp. Das gewünschte Insert wurde mittels PCR und geeigneten Oligonukleotiden amplifiziert. Die verwendeten Oligonukleotide beinhalteten am 5„-Ende eine 45 bp große Homologie zur Zielregion im Vektor und am 3„-Ende eine etwa 21-25 bp große Homologie zur Matrizen-DNA für eine gewöhnliche PCR. Der Vektor wurde mit Endonukleasen derart geschnitten, dass ein Teil der zu ersetzenden Region zu großen Teilen entfernt wurde und die homologen Regionen möglichst an den Enden des linearisierten Vektors lagen. Sowohl 10 µl Insert als auch linearisierter Vektor wurden in S. cerevisiae transformiert. Die gewonnenen Transformanden wurden geerntet, ihre DNA isoliert und in elektrokompetente E. coli-Zellen transformiert. (Jansen et al., 2005)

153 5.2.12 Mikrodialyse von DNA-Lösungen (Marusyk & Sergeant, 1980)

Mit Hilfe der Mikrodialyse wurden die Ligationsansätze entsalzt und konnten so für die E. coli-Transformation mittels Elektroporation verwendet werden. Hierfür wurde in eine sterile Petrischale steriles dH2O gefüllt und der Membranfilter (Porengröße 0,025 µm) (MILIPORE GmbH) mit der glänzenden Seite nach oben auf die Flüssigkeitsoberfläche gelegt. Die zu entsalzende DNA wurde auf den Membranfilter pipettiert und nach 30 min wieder abgenommen.

5.2.13 Agarose-Gelelektrophorese

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte nach Größe in 1-1,5%igen Agarosegelen, die mit TAE-Puffer angesetzt wurden. Zur DNA-Lösung wurden ~0,15 Volumen Ladepuffer zugegeben. Die elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte bei 90 V und automatisch angepasster Stromstärke für 45-60 min.

Unter den angelegten Bedingungen wurde hierbei eine Leistung von etwa 300 W abgerufen. Als Größenstandard wurde „GeneRulerTM DNA Ladder Mix“

(FERMENTAS GmbH) verwendet. Zur Detektion der DNA-Banden wurden die Agarosegele für 10 min 0,5 µg/ml Ethidiumbromid-Lösung inkubiert und daran anschließend für 10 min in einem Wasserbad entfärbt. Die Detektion der Fluoreszenz erfolgte unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 254 nm mit einem GelDoc XR System und der Software Quantity One 1-D (BIO-RAD LABORATORIES GmbH).

5.2.14 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Zur Verwendung geschnittener DNA-Fragmente in weiteren Reaktionen wurden diese aus dem Agarosegel unter UV-Licht (λ = 366 nm) mit einem Skalpell ausgeschnitten und in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Die weitere Extraktion erfolgte unter Verwendung und nach Protokoll des „QIAquick® Gel Extraction Kit“

(QIAGEN GmbH). Die extrahierte DNA wurde bei -20 °C aufbewahrt.

Methoden

154 5.2.15 Herstellung von DNA-Sonden für die Southern- und

Northern-Hybridisierung

Die Amplifikation DIG-gelabelter Sonden für die Northern- und Southern-Analyse erfolgte unter Verwendung des „PCR DIG Labeling Mix; Cat. No. 11 585 550 910“

(ROCHE GmbH) nach der Anleitung des Herstellers, wobei die Art und Dauer des Temperaturprofils an die verwendeten Oligonukleotide und verwendete DNA-Matrize angepasst wurde.

Die Amplifikation einer DIG-gelabelten ACT1-Sonde (1106 bp) für die Northern-Analyse erfolgte unter Verwendung der Primer fw_ACT1 und rev_ACT1 aus dem Plasmid in BHUM1186. Für eine FLO11-Sonde (974 bp) wurde mit den Primern fw_FLO11 und rev_FLO11 ein DNA-Fragment aus dem Plasmid in BHUM0778 amplifiziert.

DIG-gelabelte Sonden für die Southern-Analyse wurden ebenfalls mittels PCR, aus

„Smash & Grab“-DNA eines Wildtypstamms (YHUM0909) als Matrize hergestellt.

Verwendet wurden die jeweils angegebenen Primer-Kombinationen.