3.2 Aminosäuretransporter aus Gerste
3.2.4 Intrazelluläre Lokalisierung von HvAAP1 und HvAAP2
Erstellung von GFP-Fusionskonstrukten und transiente Expression in Gerste-Protoplasten
Für die Lokalisierung der beiden Gersten-AAPs innerhalb der Zelle wurden C-terminale translationale Fusionen mit GFP erstellt. Dazu wurden HvAAP1 und HvAAP2 unter Einbau der Restriktionsschnittstellen BamHI/XbaI (HvAAP1) bzw. XbaI/SalI (HvAAP2) und gleichzeitiger Entfernung der internen Stoppcodons mittels PCR aus den Gersten-EST-Klonen amplifiziert. Die erhaltenen Fragmente wurden gereinigt, mit den angegebenen
Enzymen gespalten und in den entsprechend verdauten Vektor pFF19-GFP kloniert. Der korrekte Einbau der AAP-Fragmente und die Beibehaltung des offenen Leserahmens wurden durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigt.
Abb. 3.44: Fusionskonstrukte für die transiente Expression von HvAAP1GFP und HvAAP2GFP in Protoplasten.
35Senh, p35S: Enhancer- bzw. Promotorsequenz aus dem Blumenkohlmosaikvirus, 35SpolyA: 35S-Polyadenylierungssignal; HvAAP1GFP, HvAAP2GFP: HvAAP1 bzw. HvAAP2 cDNA fusioniert an eGFP. Die zur Klonierung verwendeten Schnittstellen sind angegeben.
Anschließend wurden die Konstrukte durch PEG-vermittelte Transformation sowohl in H. vulgare als auch in A. thaliana Suspensionsprotoplasten eingebracht. Die Isolierung, Kultivierung und Transformation von Protoplasten verschiedener Spezies ist eine Routine-Methode in unserer Arbeitsgruppe. Nach 24 bis 48-stündiger Inkubation wurden die Protoplasten mit Hilfe eines konfokalen Laserscanning Mikroskops auf GFP-Fluoreszenz untersucht. Wie in der Abbildung 3.46 zu erkennen ist, zeigen Protoplasten, die mit HvAAP1GFP transformiert wurden, eine Fluoreszenz im Bereich der Plasmamembran, aber auch im Zellplasma. Dabei sieht die Verteilung des GFP-Signals bei Gerste (B) und Arabidopsis (C) sehr ähnlich aus. In der Kontrolle (A: 35S/GFP) ist GFP-Fluoreszenz im Zytoplasma und den Kernen zu finden. In HvAAP2GFP Protoplasten konnte hingegen keine GFP-Fluoreszenz detektiert werden, möglicherweise wurden die Protoplasten nicht transformiert oder aber das Konstrukt wurde nicht exprimiert (Daten nicht gezeigt).
Abb. 3.45: Nachweis der GFP-Fluoreszenz des HvAAP1GFP-Fusionsproteins in H. vulgare und A. thaliana Protoplasten. A: 35Sp/GFP (Kontrolle), B: HvAAP1GFP, H. vulgare; C: HvAAP1GFP, A. thaliana. Die Protoplasten wurden nach der Transformation für 48 h bei 20°C dunkel inkubiert und anschließend mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop auf GFP-Fluoreszenz untersucht. Es wurden mehrere unabhängige Versuche mit jeweils frischem Material durchgeführt.
35Senh p35S HvAAP1 eGFP 35SpolyA XbaI
BamHI
p35S HvAAP2 eGFP 35SpolyA
SalI XbaI
35Senh
A B C
10 µm 10 µm 10 µm 10 µm 10 µm
Stabile Transformation von Arabidopsis thaliana
Da der transiente Test mit Protoplasten keine eindeutige Aussage über die intrazelluläre Lokalisierung von HvAAP1 und HvAAP2 zuließ, sollten zusätzlich stabil transformierte Pflanzen erzeugt werden. Aus Zeitgründen wurde A. thaliana verwendet, denn die Transformation von Arabidopsis ist eine schnelle, unkomplizierte Methode und bereits die reifen Samen der für die Transformation verwendeten Pflanzen sind transgen. Von selektierten Pflanzen sollten Protoplasten isoliert und auf GFP-Fluoreszenz untersucht werden. Die Etablierung stabiler homozygoter Linien war in diesem Fall nicht notwendig. Die HvAAP1GFP und HvAAP2GFP Fusionskonstrukte inklusive 35S Promotor und 35S PolyA-Signal wurden zu diesem Zweck mit den Restriktionsenzymen HindIII/EcoRI aus dem Vektor pFF19 ausgeschnitten, die Enden mit T4-Polymerase geglättet und in den mit SmaI geschnittenen und anschließend dephosphorylierten pflanzlichen Expressionsvektor pBAR kloniert. Die richtige Orientierung der Fragmente wurde durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung überprüft. Die Konstrukte wurden durch Agrobacterium vermittelte Transformation in Arabidopsis-Pflanzen eingebracht. Pro Konstrukt wurden etwa 25 Pflanzen transformiert. Etwa 200 reife Samen dieser Pflanzen wurden dann in Erde ausgesät und die Keimlinge nach ca. 14 Tagen mit dem Herbizid Basta® besprüht. Der pBAR-Vektor vermittelt den Pflanzen eine Resistenz gegen Phosphinotricin und positive Pflanzen können auf diese Weise schnell selektiert und weiterkultiviert werden. Von den selektierten Pflanzen wurde zusätzlich mittels PCR auf die Anwesenheit des Transgens getestet und aus den Blättern PCR-positiver Pflanzen wurden Mesophyll-Protoplasten isoliert. Nach 24 h Inkubation wurden diese mit dem konfokalen Laserscanning Mikroskop untersucht. Die Abbildung 3.46 zeigt an ausgewählten Protoplasten eine GFP-Fluoreszenz des HvAAP1GFP-Fusionsproteins entlang der Plasmamembran. Schwache GFP-Signale finden sich auch im Zytoplasma in unmittelbarer Nähe zur Plasmamembran. Somit konnte HvAAP1 an der Plasmamembran lokalisiert werden. Protoplasten, die aus HvAAP2GFP Arabidopsis-Pflanzen isoliert wurden, zeigten keine GFP-Fluoreszenz, das Konstrukt wurde möglicherweise nicht exprimiert.
Abb. 3.46: Nachweis der GFP-Fluoreszenz des HvAAP1GFP-Fusionsproteins an der Plasmamembran von A.
thaliana Protoplasten. Die Protoplasten wurden aus verschiedenen transgenen Arabidopsis-Pflanzen isoliert, 24 h dunkel inkubiert und dann am konfokalen Laserscanning Mikroskop auf GFP-Fluoreszenz untersucht. Links:
GFP-Fluoreszenz, Mitte: Hellfeldaufnahme, rechts: zusätzlich zur GFP-Fluoreszenz ist die Autofluoreszenz der Chloroplasten in rot dargestellt.
Überprüfung der Funktionalität der GFP-Fusionskonstrukte in S. cerevisae
Um herauszufinden, ob die Aminosäurepermeasen HvAAP1 und HvAAP2 nach der Fusion mit GFP immer noch funktionell sind und Hefemutanten komplementieren können, wurden die Fusionskonstrukte in den Hefestamm 22574d transformiert. HvAAP1GFP wurde dazu mit dem Restriktionsenzym XhoI aus dem Plasmid pFF19 ausgeschnitten und in den ebenfalls XhoI-geschnittenen, dephosphorylierten Hefeexpressionsvektor pDR196 ligiert. HvAAP2GFP konnte aufgrund unpassender Schnittstellen nicht direkt aus pFF19 herausgeschnitten werden und musste mittels PCR unter Einbau von SpeI-Restriktionsschnittstellen am 5’- und 3’-Ende aus pFF19 amplifiziert werden. Das entsprechend verdaute Fragment wurde anschließend in den ebenfalls SpeI-gespaltenen, dephosphorylierten Vektor pDR196 kloniert. Der korrekte Einbau der Fragmente wurde durch Restriktionsverdau und Sequenzierung bestätigt. Auf diese Weise entstanden die Plasmide pDR-HvAAP1GFP und pDR-HvAAP2GFP. Transgene Hefezellen wurden auf Selektivmedium mit den entsprechenden Aminosäuren als einzige N-Quelle ausgestrichen und auf Wachstum getestet. Die Hefezellen, die die AAPGFP-Fusionskonstrukte tragen, zeigten kein Wachstum auf den verwendeten selektiven Medien. Beide Konstrukte waren folglich nicht mehr in der Lage, die Mutationen des Stammes 22574d zu komplementieren. HvAAP1 und HvAAP2 allein konnten die Mutationen komplementieren. Das GFP-Fusionskonstrukt ist nicht mehr funktionell.
10 µm 10 µm
Abb. 3.47: Test auf funktionelle Komplementation der S. cerevisiae Mutante 22574d durch HvAAP1GFP und HvAAP2GFP. A: Ausstreichschema, B, C: Selektives Wachstum von Kolonien, die die cDNAs von AtAAP2, AtProT1, HvAAP1 und 2 (Positivkontrollen), HvAAP1GFP, HvAAP2GFP sowie den leeren Vektor pDR196 (Negativkontrolle) tragen, auf MM-Medium mit 1 g/l Prolin (B) bzw. GABA (C). D: nicht-selektives Wachstum mit 5 g/l (NH4)2SO4.