4 Diskussion

4.1 Die Infektion von A. thaliana mit V. longisporum führt zu einer schnellen

Induktion von wurzelspezifischen Abwehrgenen

Eines der zentralen Ziele dieser Dissertation war es, genetische Determinanten der frühen Interaktion von V. longisporum und A. thaliana zu identifizieren. Für die Identifizierung von Vl43-responsiven Genen kamen zwei experimentelle Systeme zur Anwendung. Zum einen wurde eine Luciferase-Promoter-Trap-Kollektion (Alvarado et al. 2004) nach Vl43-induzierbarer Luciferase-Aktivität durchmustert. Zum anderen wurden in einem Microarray-Experiment die ein und drei Tage nach Vl43-Infektion in der Wurzel differentiell regulierten Transkripte identifiziert. Dabei zeigte sich, dass das für diesen Zweck etablierte, sterile in vitro-Infektionssystem gut für die Untersuchung von Abwehrreaktionen der Wurzel geeignet ist, da es einfach zu handhaben ist und eine hohe Reproduzierbarkeit der transkriptionellen Daten ermöglicht. Das in vitro-Infektionssystem eignet sich jedoch nicht für die Untersuchung der durch Verticillium-Infektion ausgelösten Krankheitssymptome, da die Pflanzen in dem in vitro-System nicht bis zum für das Auftreten der Symptome erforderlichen Entwicklungsstadium kultiviert werden können. Die Untersuchung der frühen Reaktion der Wurzel auf Vl43-Infektion wurde aufgrund von mikroskopischen Untersuchungen auf die Zeitpunkte ein und drei Tage nach Inokulation festgelegt.

Während aus dem Array-Experiment hervorgeht, dass es in den Wurzeln durch V.

longisporum-Infektion drei Tage nach Infektion zu einer differentiellen Expression von knapp 500 Transkripten kommt, konnte unter den 40.000 durchmusterten Promoter-Trap-Linien keine V. longisporum-responsive Luciferase-Linie mit reproduzierbarer Reporteraktivität identifiziert werden.

Da nach den statistischen Berechnungen die Promoter-Trap-Kollektion knapp ein Fünftel der Arabidopsis-Gene abdeckt und laut Array ca. 500 Transkripte drei Tage nach Infektion induziert werden, müssten ca. 100 Verticillium-responsive Gene unter den Luciferase-getaggten Linien der Promoter-Trap-Kollektion enthalten sein. Mit der in der Arbeit durchmusterten Stichprobe von 40.000 Pflanzen wurde eine 86-prozentige

Sättigung des Screenigs erreicht. Danach hätten in der Stichprobe zumindest einige durch Verticillium induzierbare Reporter-Pflanzen enthalten sein müssen.

Wahrscheinlich ist das Luciferase-Imaging nicht sensitiv genug, um eine mit dem Array vergleichbare Anzahl an induzierten Transkripten zu erhalten. Zum anderen könnte die für die Berechnung zugrunde gelegte Frequenz an funktionellen Reporter-Insertionen von 15,8% der Kollektion zu hoch sein (Alvarado et al. 2004).

Die Analyse der Transkriptionsprofile von A. thaliana-Wurzeln ein und drei Tage nach V. longisporum-Infektion zeigt eine deutliche Induktion von Transkripten der biotischen Stressantwort. Ein Vergleich der induzierten Transkripte mit Daten anderer Pathosysteme ist schwierig, da es zum Zeitpunkt der Erstellung dieser Arbeit keine publizierten Daten von Pathogen-induzierten Transkriptionsprofilen aus Wurzelgewebe gab. Es wurden zwar molekulargenetische Untersuchungen der A. thaliana-Interaktion mit den wurzelbürtigen Pilzen F. oxysporum (Berrocal-Lobo und Molina 2008), Verticillium ssp. (Fradin und Thomma 2006) und Rhizoctonia solani (Okubara und Paulitz 2005), dem wurzelbürtigen Bakterium Ralstonia solanacearum (Hu et al. 2008) und dem wurzelbürtigen Oomyceten Phytium irregulare (Staswick et al. 1998) durchgeführt, diese befassen sich aber nicht mit der frühen transkriptionellen Reaktion in der Wurzel.

Für das V. longisporum - A. thaliana Pathosystem wurden von Hella Tappe (2008) zwei Transkriptionsprofile von oberirdischen Pflanzenteilen erstellt, welche die transkriptionelle Veränderung im Stadium einer bereits etablierten vaskulären Besiedelung durch Vl43 fünf bzw. 18 Tage nach Infektion adressieren. Ein Vergleich dieser zwei Transkriptionsprofile mit denen der vorliegenden Arbeit ergab nur eine geringe Zahl an koregulierten Genen. Eine deutliche Korrelation der Datensätze wäre auch nicht zu erwarten, da die frühen Prozesse in der Wurzel noch den pre-vaskulären Infektionsprozess widerspiegeln, während zu späteren Zeitpunkten in dem Sproßgewebe eine etablierte vaskuläre Besiedelung vorliegt. Die spezifischen transkriptionellen Antworten, mit denen Arabidopsis in diesen zwei Infektionsstadien auf Vl43-Infektion reagiert, verdeutlichen die grundsätzliche Verschiedenheit des vaskulären und pre-vaskulären Infektions-Stadiums.

Allgemein stammen die umfangreichen Erkenntnisse über Abwehrreaktionen in Pflanzen aus Analysen von oberirdischem Pflanzengewebe (Okubara und Paulitz 2005).

Die für Pathogen-Interaktionen in Blättern häufig beobachtete Induktion der Markergene einer SA-abhängigen oder der JA- und ET-abhängigen Abwehr (Glazebrook 2005) werden in der Wurzel nach Vl43-Infektion nicht induziert. Weder PR1 als Marker von SA-Signalen noch PDF1.2 als Marker für Ethylen- und Jasmonsäure-Signale wurden nach Vl43-Infektion differentiell exprimiert. Das VSP2-Gen, welches auch als Markergen für JA-abhängige Transkription gilt (Utsugi et al.

1998), wie auch ein PR1-like Gen wurden einen Tag nach Vl43-Infektion sogar reprimiert. Ebenso fand keine Induktion von JA- und SA-Synthesegenen statt. Die klassischen, mit Pathogenabwehr assoziierten Hormonsignale scheinen bei der frühen pre-vaskulären Abwehr in dem Vl43-Arabidopsis-Pathosystem keine bedeutende Rolle zu spielen.

Die Analyse der in den Wurzeln ausgelösten Abwehrreaktion deutet vielmehr auf die Induktion von Komponenten einer möglicherweise PAMP-abhängigen Basis-Resistenz hin. Der Vergleich der Vl43-induzierten Transkripte des Drei-Tage-Zeitpunktes mit den im Sproßgewebe PAMP-induzierten Transkriptionsprofilen durch Ef-Tu oder Chitin zeigte eine deutliche Koregulation bei über 50% der Transkripte (Zipfel et al. 2006).

Die transkriptionell induzierten Gene kodieren unter anderem für Rezeptorproteine, Komponenten der Signalweiterleitung, wie Ca2+-Signaltransduktions-Komponenten und Transkriptionsfaktoren, sowie für antifungale Proteine der Pathogen-Abwehr oder für Syntheseenzyme antibiotischer Sekundärmetabolite. Die Induktion von ausgewählten Vertretern der induzierten Gen-Klassen konnte durch qRT-PCR in mehrfachen biologischen Replikaten verifiziert werden. Dies unterstreicht die Verlässlichkeit der erhobenen Microarray-Daten.

Im Folgenden wird die Bedeutung von einzelnen, im Array-Experiment induzierten Transkripten für die Pathogenabwehr besprochen. Unter den Vl43-induzierten Transkripten finden sich vier noch nicht näher charakterisierte Membranrezeptoren der TIR-NBS Klasse. Viele TIR-NBS-Proteine wurden als Resistenzfaktoren identifiziert (Belkhadir et al. 2004). Möglicherweise kann die Pflanze bestimmte Verticillium-Effektoren über diese Rezeptorproteine wahrnehmen.

Unter den drei Tage nach Vl43-Infektion differentiell exprimierten Transkripten waren auch zwölf Komponenten der Ca2+-Signaltransduktion vertreten. Calcium-vermittelte Signalprozesse sind ein wichtiger Bestandteil der Pathogenabwehr (Reddy und Reddy

2004; Lecourieux et al. 2006) und werden durch transiente Veränderungen der Ca2+ -Konzentration in Zellkompartimenten ausgelöst (Lecourieux et al. 2006). Der Fluss von Ca2+ über die Zellmembranen unterliegt der Regulation durch Calcium-Kanäle, Ca2+ -transportierenden ATPasen und Ca2+-Antiportern. Die Informationen aus transienten Veränderungen der Calcium-Konzentration werden durch die Vermittlung von Ca2+ -bindenden-Proteinen zu sich anschließenden Signalkaskaden weitergeleitet (Sanders et al. 2002). Durch Vl43 wurden die Transkripte von zwei CA2+-Transportern (ACA12 und ACA13), einem Ca2+-Natrium-Antiporter (CAX7), vier Calmodulin-ähnlichen-Proteinen (CML37, AtCAL4, CML34 und ACP1), sowie sechs Ca2+-bindenden EF-Hand-Proteinen induziert. Die Ca2+-Ionen-Pumpen ACA12 und ACA13 sowie der CAX7 Ca2+-Antiporter transportieren Calcium-Ionen über Membranen und könnten bei der Auslösung eines Vl43-induzierten Calcium-Signals beteiligt sein (Shigaki et al.

2006; Baxter et al. 2003). Die Calcium-bindenden Calmodulin-ähnlichen und EF-Hand-Proteine können Ca2+-Signale an Signalketten weiterleiten (McCormack et al. 2005; Ito et al. 1995; Vanderbeld und Snedden 2007). Ca2+ kann die Aktivität von Proteinen auch direkt beeinflussen. Nach Vl43-Infektion wird beispielsweise die NADH-Dehydrogenase NDB2 transkriptionell induziert, deren Aktivität calciumabhängig ist (Geisler et al. 2007). Eine calciumabhängige Signaltransduktion ist offenbar ein Bestandteil der nach Vl43-Inokulation ausgelösten Abwehrreaktion von Arabidopsis-Wurzeln.

Als Bindeglied zwischen Signalkaskaden und Genexpression stehen die DNA-bindenden Transkriptionsfaktoren (Riechmann et al. 2000). In der Wurzel wurde nach Vl43-Infektion eine große Zahl an Transkriptionsfaktoren induziert. Im Abschnitt 4.3 (Seite 104) werden die Transkriptionsfaktoren detailliert diskutiert.

Neben den Bestandteilen der Signalperzeption und Weiterleitung werden in der Wurzel auch Proteine mit direkten Abwehrfunktionen transkriptionell induziert. Es kommt beispielsweise zu der Induktion von sechs extrazellulären Chitinasen, was auf eine gezielte Abwehrreaktion gegen die Pilzinfektion hindeutet (Passarinho und de Vries 2002; Kasprzewska 2003). Auch die induzierten Protease-Inhibitoren und das Polygalacuronase Inhibiting Protein1 (PGIP1) sind Komponenten einer typischen Abwehrreaktion von A. thaliana auf die Penetration eines Pilzes (Ferrari et al. 2003;

Valueva und Mosolov 2004). Bei der Infektion von Pflanzen setzten Pilze

zellwandabbauende Polygalacturonasen und Proteinasen ein. Proteinase-Inhibitoren und das PGIP1 dienen wahrscheinlich dazu, diesen enzymatischen Angriff abzuwehren (Valueva und Mosolov 2004).

Das drei Tage nach Infektion am stärksten induzierte Transkript mit einer 13-fachen Induktion kodiert für die Alternative-Oxidase 1D (AOX1D) (Clifton et al. 2006). Unter den etwas schwächer induzierten Genen findet sich auch die AOX1A mit einer siebenfachen Induktion. Die mitochondriale Elektronen-Transportkette wird durch die Funktion von alternativen Oxidasen abgekürzt, wodurch die Energieausbeute des Elektronentransportes sinkt, gleichzeitig aber auch weniger H2O2 entsteht. Die AOX-Proteine gelten daher als Marker für oxidativen Stress in der Zelle und deren Induktion als Schutzmechanismus dagegen (zur Übersicht siehe Arnholdt-Schmitt et al. 2006). Die deutliche Induktion von AOX1D und AOX1A könnte auf einen durch die Vl43-Infektion ausgelösten oxidativen Stress in der Wurzel hindeuten.

Die Pathogen-induzierte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies kann durch die Aktivität von Atrboh-NADPH-Oxidasen oder durch Peroxidasen generiert werden (zur Übersicht siehe Apel und Hirt 2004). Peroxidasen katalysieren die Reduktion von H2O2,

indem sie Elektronen von Donormolekülen, wie phenolischen Substanzen, Ligninvorstufen, Auxin oder sekundären Metaboliten übertragen (Hiraga et al. 2001).

Außerdem können native Peroxidasen zu Oxyferro-Peroxidasen reagieren, welche zur Bildung verschiedener reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) beitragen (Passardi et al.

2004). In dem Array zeigten drei Tage nach Vl43-Infektion zehn Peroxidasen eine transkriptionelle Induktion. Unter diesen Peroxidasen ist PER52 (At5g05340) enthalten.

In der Dissertation von Saskia Floerl (2008) wurden Vl43-induzierte Proteine aus apoplastischer Waschlösung von A. thaliana identifiziert, von denen PER52 eines der am stärksten induzierten Proteine war (Floerl 2008). Floerl konnte in dem Arabidopsis-Apoplasten auch eine erhöhte Peroxidase-Aktivität nach Vl43-Infektion nachweisen.

Die genaue Funktion der Vl43-induzierten Peroxidasen ist bisher jedoch noch nicht geklärt.

Auch die Funktion der nach Vl43-Infektion induzierten „Germin-like Proteins“ (GLPs) ist bisher noch nicht aufgeklärt. Verschiedene Beobachtungen lassen auf eine Funktion der GLPs in Abwehrreaktionen schließen (Lane 2002). Zum einen werden eine Vielzahl von GLPs durch biotische Stressbedingungen induziert, zum anderen führt die

Überexpression von einigen GLPs zu einer verbesserten Resistenz bzw. ihr knock out zu einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber Pathogenbefall (Zimmermann et al. 2006; Lane 2002; Manosalva et al. 2009). Wahrscheinlich sind die GLPs in der Zellwand und im Apoplasten lokalisiert und einige von ihnen sind durch ihre Superoxid-Dismutase-Aktivität an der Produktion von H2O2 beteiligt (Christensen et al. 2004; Godfrey et al.

2007; Zimmermann et al. 2006).

Als weitere, generell bei biotischem Stress häufig aktivierte Gene sind verschiedene Vertreter der Glutathion-S-Transferasen (GSTs) nach Verticillium-Infektion transkriptionell induziert. GSTs haben eine Funktion bei der Entgiftung von H2O2 und Xenobiotika, sowie bei der Akkumulation von Anthozyanen (Rouhier et al. 2006).

Abschließend ergibt sich aus der allgemeinen Analyse der Transkriptionsprofile von A.

thaliana-Wurzelgewebe der Zeitpunkte ein und drei Tage nach Vl43-Infektion das Bild einer deutlichen Induktion von Abwehrgenen.

4.2 Die Induktion von antimikrobiellen

Im Dokument Transkriptomanalyse der <i>Arabidopsis</i>-Wurzel nach Infektion mit dem pilzlichen Pathogen <i>Verticillium longisporum</i> und Identifizierung von transkriptionellen Regulatoren der Pathogenantwort (Seite 90-95)