3.2 Chromatographische Trennverfahren
3.2.1 Hochleistungsflüssigchromatographie
Die HPLC ist eine trennanalytische Methode für in Flüssigkeiten lösliche Stoffgemische, sie kann aber auch für präparative Zwecke eingesetzt werden. Die mobile Phase ist eine Flüssigkeit (Eluent) und wird im Vergleich zur konventionellen Säulenchromatographie unter hohem Druck durch die Säule gepumpt, wodurch unter anderem die Leistungsfähigkeit gesteigert werden konnte. Im Gegensatz zur GC bei der die Anpassung des Systems an das Trennproblem nur durch Änderung der stationären Phase und bedingt der Temperatur möglich ist, hängt die Trennung bei der HPLC von der Wahl der stationären und (veränderbaren) mobilen Phase und ihrem Zusammenspiel gleichermaßen ab. Aufgrund der unterschiedlichen stationären Phasen unterscheidet man verschiedene Trennmethoden: Die Ausschluß-chromatographie, die nach Molekülgröße klassifiziert, die NP-HPLC, die auf polaren Wechselwirkungen (Adsorptionschromatographie) basiert und die RP-HPLC, deren Trenneffekt auf apolaren Wechselwirkungen (Adsorptions- und Verteilungschromatographie) beruht. Stationäre Phasen bei der NP-HPLC stellen Kieselgel oder die robusteren mit Diol-Cyano- oder Aminofunktionen modifizierten Kieselgele dar, die im Gegensatz zu Kieselgel wasserverträglich sind. Generell wird hier jedoch mit einem apolaren Eluenten gearbeitet.
Inverse Verhältnisse findet man bei der RP, bei der polare Eluenten und apolare stationäre Phasen eingesetzt werden, wie z.B. mit Octadecylgruppen modifiziertes Kieselgel (RP-C18).
3.2.1.1 Angewendete HPLC-Detektionsmethoden 3.2.1.1.1 Lichtabsorption
UV/VIS-Detektoren sind die meistverbreitesten HPLC-Detektoren, deren Meßprinzip auf der Abschwächung eines monochromatischen Lichtstrahls durch den Analyten beruht. Der Detektor registriert Substanzen, die sichtbares Licht (engl. visible: VIS) bzw. UV-Licht oberhalb der Absorptionswellenlänge der mobilen Phase bei ca. 200 bis 380 nm absorbieren.
Dies sind Stoffe, die mindestens eine Doppelbindung, Carbonylgruppe oder Heteroatome wie Brom, Iod, Schwefel enthalten und als chromophore Gruppen bezeichnet werden.
3.2.1.1.2 Massenspektrometrie mit Ionisierung unter Atmosphärendruck
Die Kopplung der HPLC mit der Massenspektrometrie ist aufgrund der hohen Massenströme der mobilen Phase ungleich schwieriger als die GC-MS-Kopplung. Eine Einführung in das unter Hochvakuum stehende Massenspektrometer ist nur möglich, wenn das Lösungsmittel vorher entfernt wird oder bei sehr niedrigen Flüssen gearbeitet wird. Zudem muß die Überführung und Ionisierung der meist nichtflüchtigen, polaren, thermolabilen Analyten unter schonenden Bedingungen durchgeführt werden. Die ersten Techniken zum Versprühen und anschließendem Verdampfen des Lösungsmittels waren das "Particle Beam (PB) Interface", welches pneumatisch arbeitet sowie das Thermospray auf thermischer Basis. Das PB wurde noch mit der tradionell aus der GC-MS bekannten EI und der CI mit separater Zufuhr des Gases gekoppelt. Die Verdampfung der Komponenten vor der Ionisierung brachte die schon von der GC-MS bekannten Probleme mit sich: sie war nicht für schwer verdampfbare Substanzen geeignet. Später erkannte man den Nutzen der probeeigenen Lösungsmittel-moleküle zur sanften chemischen Ionisierung (solvent-mediated CI) und entwickelte das APCI, bei dem die Ionisierung schon bei der Zerstäubung unter Atmosphärendruck stattfindet.
Hierbei wird an einer Corona-Entladungsnadel ein lokales Reagenzgas-Plasma erzeugt. Die durch Entladung entstandenen Lösungsmittel-Ionen kollidieren mit den neutralen Analytmolekülen und ionisieren diese über Ion/Molekül-Reaktionen in der Gasphase. Dabei entstehen Quasi-Molekülionen wie [M+H]+ oder [M-H]-. Außerdem kann auch ein sogenannter Ionenverdampfungsprozeß stattfinden wobei es zu einer Verdampfung bereits in Lösung vorgebildeter Ionen kommt, die als Kationen-Addukte [M+Me]+ (Me = Na, K, NH4
etc.) oder Anionen-Addukte [M+Cl]- vorliegen.
Zu der Kategorie der API-Einlaßsysteme gehört auch das Elektrospray, bei dem die Ionisierung auf dem Ionenverdampfungsprozeß beruht. Daher ist die "Elektrospray-Ionisierung" (ESI) auch keine Ionisierungsmethode in dem Sinne, sondern ermöglicht den Transfer des bereits ionisierten Analyten als isolierte Species von der kondensierten Phase in die Gasphase. Durch Ion-Molekül-Kollisionen ist im beschränkten Maß aber auch eine Ionisierung möglich (Gaskell, 1997). Die flüssige Probe oder der Eluent wird beim ESI aus einer Kapillare versprüht, an der ein hohes elektrisches Potential anliegt. Durch das hohe elektrische Feld werden feinverteilte elektrisch geladene Tröpfchen erzeugt. Die Vernebelung wird durch den konzentrischen Fluß von Stickstoff um die Kapillare (Nebulizer) unterstützt.
Gleichzeitig wird dadurch verhindert, daß die Kapillare wie eine Corona-Entladungsnadel des
APCI wirkt. Das ESI-Einlaßsystem wird zwischen Kapillare und MS stufenweise evakuiert, es liegt also ein Druck- und Potentialgradient in Richtung MS vor. Liegt z.B. ein positives Potential an der Kapillare an, wie in Abbildung 6 dargestellt, werden die negativen Ionen entladen, die positiven Ionen werden abgestoßen. Die Flüssigkeit bildet eine sogenannte
"Taylor-Cone" aus. Angezogen vom negativeren Potential des Filaments werden schließlich Tröpfchen abgesprengt. Durch die Einwirkung eines hohen Stickstoffflusses ("Desolvation Gas") verdampft das Lösungsmittel aus den Tröpfchen allmählich und die geladenen Tröpfchen werden immer kleiner. Schließlich kommt es zu einer Ladungsabstoßung, die größer als die Oberflächenspannung ist (Raleigh-Grenze) und damit zu einer "Coulomb-Explosion", durch die noch kleinere Tröpfchen entstehen. Am Schluß bleiben nur noch Ionen ohne Solvathülle, sogenannte desolvatisierte Ionen, übrig.
Einen umfassenden Überblick über die Grundlagen der LC-MS geben Niessen (1999) und Gaskell (1997) (letzterer speziell Elektrospray).
+
- +
+ +
+ - +
-- +
+ + +
++ ++++++++++
++
++++++++++ +
Elektronen
2-5 kVolt -+
Oxidation Reduktion
+ + + + + + + +++ + + +
Elektronen +++
+++ +++
++
+++
++
++
++
++
++
+ + +
+ + + + + + + + +
+++++++++++ ++ Taylor-cone
Coulomb-Explosion Lösungsmittel-Verdampfung
Abbildung 6: Prinzip des Elektrospray
Im Aufbau der Quelle sind sich APCI (Abbildung 8) und Elektrospray (Abbildung 7) sehr ähnlich. Sie unterscheiden sich jedoch in den in Tabelle 4 beschriebenen Punkten:
Tabelle 4: Unterschiede der ESI- und der APCI-Quelle
ESI APCI
Flußraten zwischen 0,005 und 1 mL/min Flußraten zwischen 0,2 und 2,0 mL/min hohe Spannung an der Kapillare hohe Spannung an der
Corona-Entladungsnadel
Prinzip: Ionenverdampfung Prinzip: Chemische Ionisierung Analyse von Makromolekülen wie Peptiden,
Oligonukleotiden usw. bis 200 000 D möglich, da durch das Prinzip der "Ionen-verdampfung" mehrfach geladene Ionen erzeugt werden können, die mit ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis im Massenbereich des Analysators liegen
zusätzlich Beheizung der Kapillare, um die Verdampfung der größeren Lösungsmittel-mengen zu unterstützen
An der Kapillare (ESI, Abbildung 7) bzw. Corona-Entladungsnadel (APCI, Abbildung 8) liegt ein hohes Potential von etwa 2 kV an. Die fokussierenden Linsen besitzen eine konische Form, und werden im Englischen als "Cones" bezeichnet. Die sogenannte "Sample-Cone"
steht im Winkel von 90° zur Flugrichtung der Tröpfchen. Hier liegt ein schwächer positives Potential von etwa 20 V an, wodurch die positiv geladenen Ionen fokussiert werden, wenn sie entlang des Potentialgradienten in Richtung Analysator fliegen. Tröpfchen ohne Ladung gelangen auf ein Prallblech, was die Säuberung der Quelle stark vereinfacht. Ebenfalls 90°
zur Flugrichtung ist die zweite fokussierende Linse angebracht, die sogenannte "Extraction-Cone", an der ein noch schwächeres positives Potential von etwa 2 V anliegt. Durch die zweifache orthogonale Ablenkung bei Quellen der Fa. Micromass wird diese Konstruktion auch Z-Spray genannt.
Z-Spray der Fa. Micromass
Nebuliser Desolvation Gas
Anode Kathode
+
-Potentialdifferenz
+
+
Rotationspumpe Vakuumpumpen Prallblech
RF Linse
Analysator
"Extraction Cone"
Eluent
"Sample Cone"
Abbildung 7: Aufbau einer Elektrospray-Quelle, Z-Spray (nach Micromass, 1998)
Eluent
Nebuliser Desolvation Gas
Anode Kathode
+
-Corona-Entladungsnadel
+
+
Rotationspumpe Vakuumpumpen Heizung
"Sample Cone"
"Extraction Cone" RF Linse
Analysator Prallblech
Abbildung 8: Aufbau einer APCI-Quelle, Z-Spray (nach Micromass, 1998)
Analysator der Fa. Micromass
Nach einer weiteren Fokussierung durch ein Hexapol, genannt RF-Linse, gelangen die Ionen in den Hochvakuum-Bereich des Analysators, der aus zwei Quadrupolen (Kap. 3.2.2.1.1) und einem Hexapol besteht und zu selektiven massenspektrometrischen "Target-Analysen"
befähigt ist. Das erste Quadrupol dient als Massenfilter zur Trennung der Ionen nach ihrem
Masse-Ladungs-Verhältnis. Im Scan-Modus erhält man zur Zeit x ein Massenspektrum der vorkommenden Ionen über den gesamten Massenbereich. Werden alle Einzelscans addiert und über die gesamte Zeit geplottet, erhält man ein Totalionenstrom-Chromatogramm (engl.:
total ion current: TIC).
Bei der Einzelionenregistrierung (engl.: single ion recording: SIR) wird nur bei bestimmten, für die erwartete Komponente signifikanten Massen gemessen. Im Scan- und SIR-Modus werden die Ionen ungehindert durch das Hexapol und das zweite Quadrupol durchgelassen.
Im optionalen Tandembetrieb (MS-MS) wird mit dem ersten Quadrupol eine ausgesuchte Masse eines sogenannten Mutterions (Precursor-Ion) selektiert und durch eine Kollision mit Argonatomen in dem zwischengeschalteten Hexapol eine Fragmentierung induziert. Das zweite Quadrupol dient in diesem Modus als Massenfilter zur Trennung der Tochterionen (Produktionen). In allen Modi werden die durchgelassenen Ionen schließlich von einem Detektor, der einen Photomultiplier enthält, registriert.