Herstellung von DNA-Templates für die in vitro-Transkription

Um transkriptionsfähige Templates der Plasmid DNA zu bekommen, wird die zu transkribierende DNA zunächst per PCR amplifiziert. Diese Methode hat gegenüber dem Schneiden eines Plasmids den Vorteil, dass hierbei die Enden der Fragmente beliebig durch die Sequenz des Primer bestimmt werden können. Dies ist wichtig, da so authentische Enden der RNA generiert werden können. Außerdem können hierbei auch zusätzliche Sequenzen wie PolyT oder Promotorsequenzen angehängt werden.

Nach der PCR wird das Template so aufgereinigt, dass es keine RNasen enthält. Dafür wird ein Proteinase-K Verdau mit anschließender Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation durchgeführt. Das in Aqua bidest gelöste Template wird nun direkt in die in vitro-Transkription eingesetzt.

2.2.5.1 Reinigung von Nukleinsäuren 2.2.5.1.1 Proteinase-K Verdau

Damit eine DNA als Template für die in vitro-Transkription fungieren kann, muss sie frei von Nukleasen sein. Um dies zu erreichen, wird dem Ansatz Proteinase-K zugesetzt. Die Reaktion wird zusammen mit 2 mM CaCl₂, 50 mM Tris-Cl (pH 7,5) und 0,2 µg/µl der Proteinase für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Zur En tfernung des Enzyms wird eine Phenol/Chloroform-Extraktion durchgeführt.

2.2.5.1.2 Phenol/Chloroform-Extraktion

Zu dem Ansatz wird 1 Volumen Phenol zugegeben und bei 13.000 rpm für 1 Minute zentrifugiert. Durch das Phenol werden Proteine denaturiert und befinden sich nun in der unteren, organischen Phase des Gemischs. Die obere, wässrige Phase enthält die DNA.

Diese Phase wird in ein neues Eppendorftube überführt und mit einem Volumen eines 1:1 Gemischs aus Phenol/Chloroform vermischt. Um Phenolreste zu entfernen, wird nach erneuter Zentrifugation nun wiederum die obere Phase abgenommen und mit einen Volumen Chloroform gemischt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wird die obere Phase mit der Nukleinsäure in ein neues Reaktionsgefäß pipettiert und die enthaltene DNA mit Hilfe von Ethanol gefällt.

2.2.5.1.3 Ethanol-Präzipitation von Nukleinsäuren

Zur Fällung der DNA wird dem Ansatz Natriumacetat von einer Endkonzentration von 0,3 M sowie 3 Volumen 99 %iges Ethanol zugegeben. Die Präzipitation erfolgt hierbei in der Regel bei -20 °C über Nacht oder für 2 Stunden bei –70 °C . Nach Zentrifugation bei 13.000 rpm für 30 min bei 4 °C wird der Überstand vorsichtig abgen ommen und das DNA-Pellet zweimal mit 80 %igem Ethanol gewaschen. Danach wird der Überstand möglichst vollständig abgenommen und das Pellet getrocknet. Die Nukleinsäure wird dann in ddH₂O gelöst und kann nun für die in vitro Transkription verwendet werden.

2.2.6.0 In vitro-Transkription

Die durch PCR oder Restriktionsverdau entstandenen DNA-Templates werden nach der Aufreinigung durch Proteinase-K Verdau, Phenol-Chloroform-Extraktion sowie anschließender Ethanolpräzipitation in eine Transkriptionsreaktion eingesetzt. Dabei wird mit Hilfe einer RNA-Polymerase RNA synthetisiert.

Soweit nicht anders beschrieben werden alle Transkriptionsansätze nach folgendem Standardschema pipettiert:

Bestandteil Endkonzentration

Transkriptionspuffer 1 x

DTT 10 mM

rNTPs 250 µM

DNA-Template x µg

T7 RNA-Polymerase 1 U/µl

ddH₂O

Die Ansätze werden für 60 min bei 37 °C im Wasserba d inkubiert und die RNA-Synthese auf einen Agarosegel kontrolliert.

2.2.6.1 In vitro-Transkription von gecappter RNA

Die Synthese von gecappter RNA erfolgt prinzipiell wie die von nicht-gecappter RNA (s. Kap.

2.2.6.0). Dazu wird hier allerdings die Konzentration von rGTP auf 50 µM heruntergesetzt und zusätzlich ein Cap-Nukleotid (m7GpppG, Promega) mit einer Endkonzentration von 500 µM eingesetzt. Bei der Transkription dieser RNA wird nun eine 7-methyl-Guanosin-Kappe an das 5’-Ende der RNA angehängt. Der Ansatz wird aufgrund der schlechteren Transkriptionsreaktion ca. 90 min bei 37 °C inkubie rt und danach auf einem Agarosegel kontrolliert.

2.2.6.2 Polyadenylierung von in vitro-transkribierter RNA

Um RNAs nach der Transkription Poly(A)-tails anhängen zu können, werden die RNAs zunächst über das RNeasy-Kit (Qiagen) aufgereinigt und in Wasser eluiert, da so die überschüssigen Bestandteile der Transkriptionsreaktion entfernt werden. Da nach diesem Aufreinigungsschritt oftmals eine RNA-Doppelbande auf dem Agarosegel zu sehen ist, wird die RNA nun für 5 min bei 70 °C erhitzt und dann so fort auf Eis abgekühlt, was den Effekt hat, dass die Doppelbande verschwindet. Es lässt sich vermuten, dass sich durch die Aufreinigung der RNA ein Teil der Nukleinsäure anders faltet und sich die ursprüngliche RNA- Faltung durch den Erhitzungsschritt und anschließender Abkühlung wieder herstellt.

Die Polyadenylierung erfolgt, wenn nicht anderes beschrieben, durch den Einsatz einer Poly(A)-Polymerase (rekombinant aus Hefe, USB), die unspezifisch an RNAs je nach Inkubationszeit verschieden lange Poly(A)-tails anhängt.

Bestandteil Endkonzentration

Aufgereinigte RNA x µl

Poly(A)-Polymerase Puffer 1 x

rATP 1 mM

Poly(A)-Polymerase 1 U

ddH₂O

Die Inkubationszeit bei 37 °C hängt von der Länge d er anzufügenden Poly(A)-tails und der Menge der eingesetzten RNA ab. Standardmäßig wurden Inkubationszeiten zwischen 2 und 60 min gewählt. Das Enzym wird anschließend durch einen Hitzeschritt bei 65 °C für 10 min inaktiviert. Die Polyadenylierungsreaktion wird anschließend auf einem Agarosegel kontrolliert, indem nicht-polyadenylierte und polyadenylierte RNA nebeneinander aufgetragen werden und der Längenunterschied deutlich sichtbar wird.

Die Längenbestimmung der angefügten PolyA-tails durch das Enzym wurde mit Hilfe des RNA-Markers „RiboRuler“ (Fermentas) und einer Auswertung der Banden mit CorelDrawX3 durchgeführt. Dazu wird das RNA-Gelbild mit Hilfe von CorelDraw auf dem PC-Bildschirm grade ausgerichtet. Damit die Abmessung der RNA-Banden möglichst genau durchgeführt werden kann, wird die größtmögliche Vergrößerung des Bildes gewählt. Anhand der Bemaßungsfunktion in CorelDraw werden nun sowohl die Abstände der polyadenylierten RNA-Banden als auch die Abstände der Banden des RNA-Markers zu einer gesetzten Linie abgemessen. Mit Hilfe von Excel werden die angegeben Größen der Markerbanden in Relation zu den bemessenen Abständen gesetzt und eine Eichkurve erstellt. Anhand der Formel der Eichkurve werden nun die Größen der polyadenylierten RNAs berechnet.