3. Ergebnisse und Diskussion
3.1 Der Einfluss der Hepatitis C Virus 3’-UTR auf die Translation durch
3.1.1 Die HCV 3’-UTR stimuliert die Translation von HCV und PTV IRES-abhängiger
Es soll nun untersucht werden, ob die Stimulation der HCV IRES-abhängigen Translation durch die 3’-UTR spezifisch für die HCV IRES ist oder ob es sich hierbei eher um einen generellen Mechanismus der Translationsstimulation handelt. Durch die zusätzliche Verwendung der PTV IRES soll außerdem geklärt werden, ob sich diese IRES ebenso wie die von HCV durch die HCV 3’-UTR in ähnlicher Form stimulieren lässt.
Dazu wurden zunächst verschiedene Reporter-RNAs verwendet, die entweder die HCV 5’-UTR oder die 5’-5’-UTR des Porcinen Teschovirus als Element der Translationsinitiation besitzen.
Abbildung 3.1: Die Sekundärstrukturen der HCV- und PTV 5’-UTR (Abbildung aus Bung, Bochkaeva et al., 2010).
Um einen möglichen Effekt der HCV 3’-UTR auf die Effizienz der Translation von HCV bestimmen zu können, werden jeweils Reporter-RNAs, die diese 3’-UTR besitzen, verglichen mit RNAs, die direkt nach dem Reportergen, der Firefly Luciferase enden (siehe Abbildung 3.2). Um die RNAs zu generieren, wurden deshalb zunächst von den entsprechenden Plasmiden, zwei unterschiedliche PCRs angesetzt, damit die DNA-Templates exakte Enden besitzen. Nach der in vitro-Transkription wurden die Mengen der RNAs im Ansatz auf einem Agarosegel bestimmt, da zum direkten Vergleich der RNAs mit und ohne HCV 3’-UTR gleiche Mengen (ca. 200 ng) in die Experimente eingesetzt werden müssen.
Abbildung 3.2: Schematische Darstellung der verwendeten Reporter-RNAs. Die 5’-UTR der RNA enthält entweder die HCV- oder die PTV 5’-UTR. Alle Konstrukte enthalten als Reporter das Gen der Firefly Luciferase. Am 3’-Ende befindet sich entweder die HCV 3’-UTR oder die RNA endet direkt nach dem Reportergen. Abbildung modifiziert nach Bung, Bochkaeva et al., 2010.
Die verschiedenen in vitro-transkribierten Reporter-RNAs wurden nach dem Mengenabgleich mit Hilfe eines Agarose-Gels zunächst in die in vitro-Translation eingesetzt. Diese wurde in Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (engl. „Rabbit Reticulocyte Lysate“, RRL) durchgeführt und danach die Aktivität des exprimierten Reporterproteins gemessen.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
HCV - 3 'UTR HCV + 3' UTR PTV - 3' UTR PTV+ 3' UTR
rel. Stimulation
Abbildung 3.3: In vitro-Translation der Reporter-RNAs in RRL. Vergleich der Reporterexpression (Firefly Luciferase) der RNA-Konstrukte mit HCV- oder PTV 5’-UTR ohne bzw. mit HCV 3’-UTR. Die Werte der RNAs ohne 3’-UTR wurden gleich 1 gesetzt. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.
Der Effekt der HCV 3’-UTR auf die IRES-abhängige Translation wird nun durch den direkten Vergleich der beiden Reporter-RNAs messbar. Im RRL-System zeigt die HCV 3’-UTR eine Stimulation der Aktivität der HCV IRES von 2,8-fach und bei der PTV IRES eine ähnliche Stimulation von 3,2-fach (siehe Abbildung 3.3).
Reportergen
Um zu testen, ob dieser Effekt auch in vivo festzustellen ist, wurden die Reporter-RNAs in Zellen transfiziert. Dazu wurden eine Hepatomzelllinie (Huh7-Zellen) und eine Nicht-Hepatomzelllinie (HeLa-Zellen) verwendet, um zusätzlich zu testen, ob eine mögliche Stimulation durch die HCV 3’-UTR zelltypabhängig ist. Die Transfektion in beide Zelllinien erfolgte durch Lipofektion, also die Bildung von RNA-Lipidkomplexen und Aufnahme in die Zelle durch lipid-vermittelte Endozytose. Die Messung der Reporteraktivität erfolgt nach 4 Stunden Inkubation und anschließender Zelllyse.
1,0
89,4
1,0
98,1
1,0
51,1
1,0
88,5
0,0 30,0 60,0 90,0 120,0
HCV - 3 'UTR HCV + 3' UTR PTV - 3' UTR PTV+ 3' UTR
rel.Stimulation
Huh7 HeLa
Abbildung 3.4: Effekt der HCV 3’-UTR auf die Translation in Huh7- und HeLa-Zellen. Reporter-RNAs mit HCV- oder PTV 5’-UTR jeweils mit oder ohne HCV 3’-UTR wurden in Zellen transfiziert. Die Aktivität des Luciferase-Reporters wurde nach der Zelllyse 4 Stunden nach der Transfektion gemessen. Die Werte der RNAs ohne HCV 3’-UTR wurden gleich 1 gesetzt.
In beiden Zelllinien, sowohl in der Hepatomzelllinie Huh7 als auch in der Zervixkarzinomzelllinie HeLa, konnte ein stimulatorischer Effekt der HCV 3’-UTR gefunden werden. In Huh7-Zellen zeigt sie für die HCV IRES eine fast 90-fache Stimulation; ähnliche Werte wurden auch für die PTV IRES gefunden. In HeLa-Zellen konnte eine Stimulation von ungefähr 50-fach für die HCV- und 90-fach für die PTV IRES gezeigt werden.
Verglichen mit den Stimulationen, die bei der Translation im Retikulozytenlysat gefunden wurden, zeigt sich in beiden Zelltypen in vivo eine sehr viel höhere Stimulation, die sich im Vergleich zur in vitro-Translation zum Teil um den Faktor 30 unterscheidet.
Diskussion
Bei dem hier verwendeten Reporterkonstrukt mit HCV 5’-UTR und HCV 3’-UTR handelt es sich das gleiche Plasmid, das bereits in der Studie von Song et al., 2006 eingesetzt wurde.
Auch die Herstellung des Templates mit exaktem Ende stromabwärts des Luciferase-Gens beziehungsweise hinter der 3’-UTR durch die PCR erfolgte hier nach dem gleichen Protokoll.
Ein experimenteller Unterschied ist hier nur bei der Verwendung der Primer in der PCR für die Herstellung des Templates zu finden. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Primer waren etwas länger und besitzen somit eine höhere Schmelztemperatur, was jedoch auf die Eigenschaften des hergestellten PCR-Fragments keinen Einfluss haben sollte. Nach
Messung der Reporter-Aktivitäten der unterschiedlichen RNAs unterschieden sich die Ergebnisse hier jedoch maßgeblich von denen aus der vorherigen Studie. Zwar konnte hier die stimulatorische Wirkung der HCV 3’-UTR auf die IRES-abhängige Translation bestätigt werden, jedoch unterscheiden sich die Werte der gefundenen Stimulationen wesentlich. In der Studie von Song et al. wird eine zelltypabhängige Translationsstimulation auf die HCV IRES durch ihre 3’-UTR beschrieben, die in Huh7-Zellen 25-fach, in HeLa-Zellen 1,3-fach, in HepG2-Zellen 17-fach und in BHK-21-Zellen 4-fach beträgt. Die Autoren schließen aus den Daten auf eine leberspezifische Stimulation der Translation durch die HCV 3’-UTR. In deren Studie konnte auch ein Effekt der HCV 3’-UTR auf die HCV IRES in vitro im RRL nicht nachgewiesen werden, wohingegen hier in dieser Arbeit eine im Vergleich zu den in vivo- Experimenten zwar geringe, aber signifikante Stimulation der Translation gefunden wurde.
Woraus ein solcher gravierender Unterschied zwischen den beiden Studien resultiert, sowohl bei den in vitro- als auch den in vivo-Experimenten, konnte letztendlich nicht geklärt werden.
Auch die Verwendung der gleichen, kürzeren Primer wie in der Studie von Song et al.
brachte hier keine Angleichung der Messergebnisse.
3.1.2 Eine Sequenzverlängerung nach dem Reportergen wird für eine korrekte