3. Material und Methoden
3.2. Methoden
3.2.2. Färbung der Gewebeschnitte
3.2.2.1. Übersichtsfärbung nach Klüver und Barrera
Die Färbung von Klüver und Barrera (1953) dient speziell der Differenzierung von Nervengewebe. Vor der eigentlichen Anfärbung der Schnitte mußte zunächst das Paraffin durch Xylol entfernt werden. Sublimatkristalle, die von der
Immersionsfixierung stammten, konnten mit Lugol’scher Lösung aus dem Gewebe herausgelöst werden. Überschüssiges Jodid wurde anschließend an
Natriumthiosulfat gebunden.
Der Farbstoff Luxol-Fast-Blue färbt myelinisierte Fasern blau und nicht myelinisierte Fasern grün. Die Gegenfärbung mit Kresylviolett ergibt eine violette Färbung der Perikaryen. Durch Variation der Färbezeiten konnte die Farbintensität beeinflußt werden. Jeder 6. Objektträger der 3 aufgeschnittenen Gehirne wurde dieser Färbung unterzogen.
Färbeprotokoll: Differenzierungsfärbung nach Klüver und Barrera I Entparaffinieren Xylol
100 % Ethanol
3 x 5 Minuten 2 x 3 Minuten II Sublimat auswaschen Lugol’sche Lösung
Nathriumthiosulfatlösung
20 Minuten 20 Minuten
Spülen Aqua bidest. mindestens 5 Minuten III Färbung der Markscheiden Luxol-Fast-Blue
95 % Ethanol
2- 3 Stunden bei 57°C kurz eintauchen Spülen Aqua bidest. mindestens 5 Minuten IV Entfärbung (Farbüberschuß) Lithiumcarbonatlösung 2-3 Minuten
Spülen 70 % Ethanol 3 x 0.5 Minuten Mikroskopische Kontrolle Schritt IV evtl.
wiederholen
Spülen Aqua bidest. mindestens 5 Minuten V Färbung der Perikaryen Kresylviolettlösung 15 Minuten
Spülen Aqua bidest. kurz eintauchen VI Entfärbung (Farbüberschuß) 100 % Ethanol+
Eisessig (einige Tropfen) 100 % Ethanol
kurz eintauchen 3 Minuten Mikroskopische Kontrolle Schritt VI evtl.
wiederholen
VII Entwässern 100 %Ethanol
Xylol
2 x 3Minuten 3 x 5 Minuten
VIII Eindeckeln Entellan
Benötigte Reagenzien:
(Angaben sind ausreichend für die Anfärbung von 20 Objektträgern 7,6 cm x 2,6 cm) Lugol´sche Lösung
(Romeis 1989)
Stammlösung:
Gebrauchslösung:
2 g Kaliumjodid in 10 ml Aqua bidest. lösen, 1 g Jod
zugeben und auf 100 ml mit Aqua bidest. auffüllen
einige Tropfen Stammlösung in 80 % Ethanol geben Natriumthiosulfat (0,25%)
(Romeis 1989)
0,625 g Natriumthiosulfat in 250 ml Aqua bidest. auflösen Luxol-Fast-Blue
( Fa. Chroma Gesellschaft)
1 g Substanz in 1000 ml 95%
Ethanol lösen
5 ml Eisessig (10%) zugeben, filtrieren
Lithiumcarbonat-Lösung (0,05%) (Fa. Chroma Gesellschaft)
0,1 g Lithiumcarbonat in 200 ml Aqua bidest. lösen Kresylviolett
(Fa. Merck)
Stammlösung:
Gebrauchslösung:
1 % wässrige Kresylviolett-Lösung
20 ml Stammlösung und 200 ml Aqua bidest. mischen, 5 Tropfen Eisessig zugeben, filtrieren
Eisessig (100%) (Fa. Merck)
Gebrauchslösung: Essigsäure 10%
Entellan (Fa. Merck)
3.2.2.2. Immunzytochemische Färbung ABC Markierung nach Hsu (1981)
Um die Neuropeptidsysteme SP, NPY und VIP im Di- und Mesencephalon zu untersuchen, wurde jeweils ein Objektträger pro 6-er Serie für jedes Neuropeptid immunzytochemisch mittels der ABC-Methode nach Hsu et al. eingefärbt. Dazu mußten die Schnitte zunächst wieder entparaffiniert und das übriggebliebene Sublimat ausgewaschen werden. Freie unspezifische Bindungsstellen wurden daraufhin mit einem Präimmunserum von der Ziege belegt, so daß ungewollte
Bindungen mit dem Sekundärantikörper vernachlässigt werden konnten. Im nächsten Schritt kamen spezifische polyklonale Antiseren gegen SP, VIP (von Frau Prof.
Blähser aus Kaninchen gewonnen) und NPY (Amersham, Großbritannien) zum Einsatz. Da das Antiserum gegen SP in der praeoptischen Lage Kreuzreaktionen mit dem Neuropeptid AVT aufwies, wurde an Sepharose-AVT gekoppeltes SP-Antiserum verwendet.
Um den nun entstandenen Antigen-Antikörperkomplex zu vergrößern und sichtbar zu machen, wurde, unter Ausnutzung der hohen Affinität zwischen Biotin und Avidin, ein
biotinyliertes Sekundärantiserum, das ebenfalls von der Ziege stammte, an das Primärserum gebunden. Das Tertiärantiserum enthielt zum einen Streptavidin, das die Verbindung zum Sekundärantikörper herstellte und zum anderen biotinylierte Meerrettich-Peroxidase, die letztendlich aus dem anschließend zugegebenen DAB mit Hilfe von H2O2 in einer enzymatischen Reaktion einen unlöslichen Farbkomplex ausfällte. Um die Farbreaktion zu verstärken, wurde in diesem Schritt Nickel-
Ammoniumsulfat hinzugefügt. Als Inkubationspuffer wurde Tris-gepufferte NaCl-Lösung pH 7,6 bzw. pH 8,0 verwendet, dem in den einzelnen Spülschritten einige Tropfen Ilfotol zur Herabsetzung der Oberflächenspannung beigefügt wurden.
Färbeprotokoll: ABC- Markierung nach HSU I Entparaffinieren Xylol
100 % Ethanol
3 x 5 Minuten 2 x 3 Minuten II Sublimat auswaschen Lugol’sche Lösung
Nathriumthiosulfatlösung Aqua bidest.
20 Minuten 20 Minuten
mindestens 5 Minuten Spülen Tris-Puffer I + Ilfotol 2 x 5 Minuten
III Präimmunserum Ziegennormalserum (ZN)
ZN:Tris-Puffer I=1:185 oder Kalbnormalserum (KN) KN:Tris-Puffer I=1:4
20 Minuten
bei Raumtemperatur IV spezifisches
Primärantiserum vom Kaninchen gegen gewebeständige
Antigene: SP, NPY und VIP
Antiserum : Tris-Puffer/KN Anti-NPY (1:7000) Anti-SP (1:5000) Anti-VIP (1:4000)
24 Stunden bei 6-8°C Spülen Tris-Puffer I + Ilfotol 3 x 5 Minuten V biotinyliertes
Sekundärantiserum von der Ziege gegen
Primärantiserum
Anti-Kaninchen-Antiserum : Tris-Puffer I /KN = 1:555
30 Minuten
bei Raumtemperatur
Spülen Tris-Puffer I + Ilfotol 3 x 5 Minuten VI Tertiärantiserum
Streptavidin und biotinylierte Meerrettich-Peroxidase
ABC- Reaktion Substanz A+B (1:1) : Tris-Puffer I = je 1:303
45 Minuten
bei Raumtemperatur Spülen Tris-Puffer I + Ilfotol
Tris-Puffer II + Ilfotol
2 x 5 Minuten 1 x 5 Minuten Spülen Tris- HCl 5 Minuten VII enzymatische Ausfällung
des Farbkomplexes
DAB + Ni-Ammoniumsulfat +Tris-Puffer II
+H2O2
NPY: 10-12 Minuten SP: 8-10 Minuten VIP: 3-4 Minuten Spülen Tris- HCl zum
Stoppen der Enzymreaktion
5 Minuten Mikroskopische Kontrolle: Schritt VII evtl wiederholen
Spülen Aqua bidest. 5 Minuten VIII Entwässern 100 % Ethanol
Xylol
2 x 3 Minuten 3 x 5 Minuten
IX Eindeckeln Entellan
Benötigte Reagenzien:
(Angaben sind ausreichend für die Anfärbung von 20 Objektträgern 7,6 cm x 2,6 cm) Lugol’sche Lösung
und Nathriumthio-sulfat:
siehe benötigte Reagenzien für Übersichtsfärbung nach Klüver und Barrera
Tris- Puffer I und II: 2.4 g Tris=Hydroxymethylaminomethan (Fa. USB, Cleveland USA)+ 18 g NaCl (Fa. Merck) in 2000 ml Aqua bidest. lösen, mit 1n HCl einstellen auf:
-pH 7,6 = Tris-Puffer I -pH 8,0 = Tris-Puffer II Präimmunserum:
ZN (1:185) oder KN (1:4)
27 µl ZN = Ziegen- Normalserum (aus Vectastain ABC Elite Kit) +5 ml Tris-Puffer I
1 ml KN = fetales Kalbnormalserum (Fa. Serva) + 4 ml Tris-Puffer I
Primärantiserum:
Anti-NPY (1:7000):
Anti-SP (1:5000):
Anti-VIP(1:4000):
4 µl Anti-NPY (Amersham, Großbritannien) + 6,8 ml Tris-Puffer I + 200 KN (vierfach vorverdünnt)
100 µl Anti-SP (Herstellung von Frau Prof. Blähser) + 4,9 ml Tris-Puffer I + 100 µl KN (Sepharose-AVT gekoppelt, 100-fach vorverdünnt)
2 µl Anti-VIP (Herstellung von Frau Prof. Blähser) + 7,8 ml Tris-Puffer I + 200 µl KN
Sekundärantiserum: 9 µl Ziege-anti-Kaninchen-biotinyliertes IgG
(aus Vectastain ABC Elite Kit)+4,9 ml Tris-Puffer I + 100 µl KN
Tertiärantiserum: 6 ml Tris-Puffer I +
19 µl Substanz A (aus Vectastain ABC Elite Kit) + 19 µl Substanz B (aus Vectastain ABC Elite Kit),
Substanz A und B getrennt dem Puffer zugeben, gut mischen, vor Gebrauch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen [Vectastain ABC Elite Kit: PK 6101,(Fa. Vector Lab, USA)]
Tris HCl:
(Romeis 1989)
Stammlösung:
Gebrauchslösung:
30,25 g Tris in 350 ml Aqua bidest. lösen, mit HCl (rauchend) auf pH 7,6 einstellen, auf 500 ml mit Aqua bidest. auffüllen 12 ml Stammlösung + 108 ml Aqua bidest.
Chromogen: 0,66 g Nickel-Ammoniumsulfat (NH4)2 Ni(SO4)2 6H2O (Fa. Fluka) in 220 ml Tris-Puffer II auflösen,
1,72 ml DAB-4-HCl (3,3‘Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid, Fa. Serva) zugeben, filtrieren,
110 µl H2O2 35 % (Fa. Fluka) direkt vor Gebrauch zugeben
Immunzytochemische Kontrollfärbungen:
Serumspezifitätskontrollen:
Um die Spezifität des verwendeten Antikörpers zu testen, wurde das Antiserum mit dem zur Immunisierung verwendeten und an CNBr- aktivierte Sepharose
(Fa Pharmacia Upsala, Schweden) gekoppelten Antigen vorbehandelt. Damit waren die Antikörper in Antigen-Antikörperkomplexen gebunden und der Reaktion mit dem Gewebeantigen entzogen. Kam es nach Beendigung des gesamten Färbevorgangs nach Hsu zu immunzytochemischen Markierungen, mußten diese aus
Kreuzreaktionen mit anderen heterologen antigenen Determinanten stammen oder durch unspezifische Antikörper im Antiserum verursacht worden sein.
Methodenspezifitätskontrollen:
Im Schritt IV des Färbeprotokolls der ABC- Markierung wurde das
Primärantiserum durch Tris-Puffer I ersetzt. Immunzytochemische Reaktionen
mußten in diesem Fall durch unspezifische Bindungen von Komponenten der übrigen Färbeschritte entstanden sein.
Kontrolle der Nickel-Ammoniumsulfat-Verstärkung
Um die Wirkung des Nickel- Ammoniumsulfats (NAS) zu überprüfen, wurden sowohl Färbedurchgänge mit den Primärantiseren gegen die drei Neuropeptide als auch die Methodenspezifitätskontrollen mit und ohne Zugabe von NAS durchgeführt.