3 Ergebnisse

3.2 Analyse der frühen, transkriptionellen Reaktion der Wurzel auf

3.2.1 Erstellung eines Transkriptionsprofils von Arabidopsis-Wurzeln ein und

Um die bei Arabidopsis thaliana durch die Infektion mit V. longisporum in der Wurzel auftretende transkriptionelle Reaktion zu untersuchen, wurde ein Microarray-Experiment durchgeführt. Die Probennahme des Wurzelgewebes erfolgte einen und drei Tage nach der Infektion mit Verticillium, da aus den mikroskopischen Untersuchungen hervorging, dass in diesem Zeitrahmen ein enger Kontakt zwischen der Wurzel und dem Pilz entsteht. Die Annahme war, dass dann auch die ersten transkriptionellen Reaktionen stattfinden. In einem „2x2 loop“-Design (Abbildung 8A) wurden vier verschiedene Transkriptionsprofile verglichen. Die vier Bedingungen umfassten Vl43-infiziertes Wurzelgewebe einen Tag und drei Tage nach Infektion, sowie die Proben von entsprechendem mock-inokuliertem Wurzelgewebe. Zur Anwendung kamen Arizona-Oligonucleotidarrays, welche mit dem Qiagen-Oligo-Set Version 3.0 gespottet sind (http://ag.arizona.edu/microarray). Diese Oligonucleotide repräsentieren 28.964 proteinkodierende Transkripte und 87 microRNAs (Operon 2008).

1dpi mock

3dpi mock 3dpi +Vl43 1dpi +Vl43

3dpi mock 3dpi +Vl43 1dpi +Vl43

Abbildung 8: Übersicht über die Durchführung und die Ergebnisse des Microarray Experimentes. (A)

„2x2 loop“-Design des Microarray-Experimentes. Die Pfeile zwischen den Bedingungen symbolisieren die sechs verwendeten Array-Slides. Die Pfeilspitzen symbolisieren jeweils das eine (Cy3), die Pfeilenden jeweils das zweite eingesetzte Fluorofor (Cy5). (B + C) Darstellung der einen (1 dpi) und drei (3 dpi) Tage nach Infektion hoch- (grüne Pfeile) und runterregulierten (rote Pfeile) Transkripte der kurzen (B) und der langen Ergebnislisten (C). (D) Schnittmengendiagramm (Venn-Diagramm) der nach Vl43-Infektion in Wurzeln differentiell regulierten Gene. Dargestellt sind die Schnittmengen der in der langen Ergebnisliste zusammengefassten Gene p ≤ 0,1; Induktion ≥ 2,0. Die Kreise symbolisieren die einen (1 dpi) und drei (3 dpi) Tage nach Infektion hochregulierten (up) und runterregulierten (down) Transkripte.

Die differentiell exprimierten Gene der zwei Zeitpunkte wurden unter Anwendung der Grenzwertkriterien für den maximalen Signifikanzwert (p) und die minimale differentielle Expression (Induktion) in einer langen (p ≤ 0,1; Induktion ≥ 2) und einer kurzen Liste (p ≤ 0,05; Induktion ≥ 2,5) zusammengefasst (Anhang Tabelle 7 &

Tabelle 8, Seiten 114-118). Die kurzen Listen für einen und drei Tage nach Vl43-Infektion umfassen entsprechend 62 und 241 differentiell exprimierte Transkripte, während die lange Liste für den Ein-Tages-Zeitpunkt 269 und die für den Drei-Tages-Zeitpunkt 490 Transkripte umfasst. Der Anteil der durch Vl43 reprimierten und induzierten Gene ist in Abbildung 8 dargestellt. Drei Tage nach Infektion findet eine deutlich ausgeprägtere Veränderung des Transkriptionsprofils als einen Tag nach Infektion statt. Vergleicht man die Überschneidungen der differentiell exprimierten Transkripte einen und drei Tage nach Vl43-Infektion der langen Ergebnislisten (Abbildung 8 D), zeigt sich nur eine kleine Schnittmenge. 61 der Transkripte sind sowohl einen wie auch drei Tage nach Infektion hochreguliert, während 19 Transkripte zu beiden Zeitpunkten herunterreguliert sind (Abbildung 8 D).

Um einen Eindruck von der biologischen Relevanz der Verticillium-induzierten Gene zu erhalten, wurden für den Drei-Tages-Zeitpunkt die hochregulierten Gene in Genfamilien sortiert. Die besonders häufig repräsentierten Genfamilien sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Besonders Transkriptionsfaktoren und mit der Pathogenabwehr assoziierte Gene wie die Glutathion-S-Transferasen, P450-Monooxygenasen, Peroxidasen, Chitinasen und Germin-ähnlichen Proteine werden durch Vl43 induziert. Zusätzlich wurde eine Gruppierung der Gene in Funktionszusammenhänge durchgeführt (Tabelle 2). Dabei wurde deutlich, dass besonders Gene der Calcium-vermittelten Signalweiterleitung, Gene des Camalexin-Syntheseweges und Gene des Zellwandmetabolismus durch Vl43 induziert wurden.

Die im Microarray induzierten Transkripte wurden auch mit Hilfe einer Genevestigator-Analyse (Zimmermann et al. 2004) mit Transkriptionsprofilen anderer Gesamt-Genom Arrays verglichen. Auf der Genevestigator-Internetseite der ETH-Zürich (https://www.genevestigator.ethz.ch) lässt sich eine umfangreiche Arraydatenbank nach verschiedenen Kriterien durchsuchen. Durch den Vergleich wurde bei einigen Stimuli, wie Salzstress, Botrytis- und Pseudomonas-Infektion, eine besonders deutliche Koregulation festgestellt (Tabelle 3, Seite 63).

Tabelle 2: Auflistung der Anzahl von gehäuft auftretenden Genfamilien (oberer Tabellenteil) und Genen spezieller Funktionszusammenhänge (unterer Tabellenteil) unter den 439 Vl43-hochregulierten (up) Transkripten der langen Ergebnisliste drei Tage nach Infektion (3dpi). Unter Schwefel-Aktivierung sind die Enzyme zusammengefasst, welche an der Bereitstellung des Schwefel Donors 3´-Phosphoadenosin-5´-phosphosulfat (PAPS) beteiligt sind

Genfamilie lange Liste 3dpi up

Trankriptionsfaktoren1 33

Glutathione S-Transferasen 11 Cytochrom P450 Monooxygenasen 11

Peroxidasen 10 Germin ähnliche Proteine 9

Chitinasen 6 Protease Inhibitoren 5

Resistenz Proteine der TIR-NBS Klasse 4 Glycosyl Hydrolasen 5

UDP-Glycosyltransferasen 4 Funktionszusammenhänge

Calcium Signaltransduktion 12 Camalexin/Tryptophan Synthese 7 Zellwand verändernde Enzyme 8 Schwefel Aktivierung (PAPS) 4

Um die Induktion der in dem Array-Experiment identifizierten Gene zu verifizieren und den zeitlichen Verlauf der Induktion zu ermitteln, wurden quantitative Reverse Transkriptase-PCRs (qRT-PCRs) durchgeführt. Für 29 Abwehr-assoziierte Gene, welche auch jeweils Vertreter der in Tabelle 2 aufgeführten Genfamilien einschlossen, wurde die Vl43-vermittelte Induktion in einem Zeitreihen-Experiment verifiziert (Siehe Anhang, Tabelle 10, Seite 127). Dazu wurden zwei unabhängige Replikate durchgeführt und jeweils 2, 4, 6, 8 und 10 Tage nach Infektion Wurzelgewebe geerntet. In Abbildung 9 (Seite 64) ist an drei Beispiel-Genen der zeitliche Verlauf der Induktion in ∆∆CT-Werten dargestellt. ∆∆CT-Werte bedeuten hier die relative Vl43-elicitierte Induktion der Transkripte gegenüber den mock-inokulierten Proben. Die Transkripte des Glycosyl-Hydrolase-Gens DIN2, eines Serin-Protease-Inhibitors und eines TIR-NBS Membran-Rezeptors zeigt in dem Zeitreihenexeriment bis zum Acht-Tages-Zeitpunkt eine im

1 Die induzierten Transkriptionsfaktoren sind in Tabelle 6 (Seite 84) in die einzelnen Genfamilien aufgeschlüsselt.

Zeitverlauf ansteigende Transkriptmenge. Diese Kinetik wurde allgemein für die mittels qRT-PCR verifizierten Transkripte beobachtet. Durch die qRT-PCR Untersuchung der 29 repräsentativen Transkripte konnte die Qualität der Arraydaten verifiziert werden, da sie eine gute Reproduzierbarkeit der durch Vl43-Infektion induzierten Transkription zeigten.

Tabelle 3: Auflistung von Array-Experimenten, die eine besonders große Überschneidung der induzierten Transkripte mit den 183 Vl43-induzierten Transkripten der kurzen Ergebnisliste des Drei-Tage-Zeitpunktes zeigen. 21 der Vl43-induzierten Transkripte wurden nicht in den Vergleich mit einbezogen, da diese nicht in dem Genevestigator-Datensatz enthalten sind (daher n=162). Die in den Genevestigator-Datensätzen annotierten Transkripte wurden bei einem log2 Signal Ratio 0,5 als induziert gezählt, während das Grenzwertkriterium der Vl43-induzierten Transkripte bei einer Induktion ≥ 2,5 lag.

Micro-Array Experiment Induktion Gene-vestigator

Referenz

Koregulierte Gene aus

n=162

% Koregulation Salzstress Wurzeln

24h At-120 134 89

Botrytis cinerea Blatt 18h At-147 133 82

P. syringae pv. maculicola

(avrRpm1) - At-211 129 80

AgNO3 10µM 3h At-113 127 78

Hypoxia 12h At-171 115 71

TIBA (Auxin Transport

Inhibitor) 10µM 3h At-113 114 70 Cycloheximid

(Proteinbiosynthese Inhibitor)

10µM 3h At-113 111 69

P. syringae pv. maculicola

(avrRps4) - At-211 109 67

H2O2 20mM 1h At-185 105 65

Syringolin (Pseudomonas

Effektor) 20µM At-086 103 64

P. syringae pv. tomato

DC3000 (avrRPT2) 48h At-204 100 62 Salizylsäure (SA) 10µM 3h At-113 93 57

E. cichoracearum 3 Tage At-085 90 56

Chitin 30min At-169 90 56

EF-Tu elf18 (PAMP) 30, 60min At-128 86 53 EF-Tu elf26 (PAMP) 30, 60min At-128 83 51

DIN2

2dpi 4dpi 6dpi 8dpi 10dpi

induction over mock

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Abbildung 9: Quantitative RT-PCR von Vl43-induzierten Genen im time course-Experiment 2, 4, 6, 8 und 10 Tage nach Infektion (dpi). Aufgetragen sind ∆∆CT-Werte. Die grauen Balken repräsentieren die auf eins gesetzten Werte der mock-induzierten Proben, die schraffierten, hellen Balken zeigen die auf mock normierte Induktion der Vl43-inokulierten Proben. Für DIN2 sind die Ergebnisse aus zwei unabhängigen Experimenten gezeigt (#1 und #2). DIN2 (At2g38870) kodiert für eine Glycosyl-Hydrolase, At2g38870 für ein Serin-Protease-Inhibitor und At1g72900 für ein TIR-NBS-Resistenzprotein. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von n technischen Replikaten

Das sich die Pathogenantwort im Verlauf der frühen Verticillium - Arabidopsis-Interaktion zwischen einem und drei Tagen nach Infektion sehr dynamisch entwickelt, wird durch den Vergleich der zwei Wurzelzeitpunkte deutlich. Die Überschneidung der zu beiden Zeitpunkten induzierten Transkripte ist gering. Auch bei dem Vergleich der Verticillium Induced Genes (VLIGs), welche 5 und 18 Tage nach Infektion entsprechend in Petiolen oder in Arabidopsis-Blattrosetten induziert sind (Tappe 2008), zeigt sich nur eine geringe Überschneidung mit den in der Wurzel 3 dpi induzierten Transkripten (Abbildung 10). Bei den Array-Experimenten von Hella Tappe, in denen die VLIGs identifiziert wurden, kamen die gleichen auch in dieser Arbeit eingesetzten Arizona-Arrays zur Anwendung. Die sich in den drei Array-Experimenten überschneidenden Transkripte sind im Anhang in Tabelle 9 (Seite 126) aufgelistet. Das in allen drei Arrays induzierte Transkript At4g33550 kodiert für ein nicht näher charakterisiertes

Lipid-Transfer-Protein. Die geringe Überschneidung zwischen den in diesen drei Microarrays differentiell exprimierten Transkripten ist nicht überraschend, da sich die Interaktion bei einer bereits etablierten Pilzinfektion in den Blättern deutlich von frühen Pilzinteraktionen in den Wurzeln unterscheidet.

Abbildung 10: Schnittmengendiagramm der nach Vl43-Infektion differentiell regulierten Gene aus drei unterschiedlichen Microarray-Versuchen. Kreis W3 umfasst die 490 regulierten Gene aus Wurzeln 3 dpi (p ≤ 0,1; Induction ≥ 2,0), Kreis P5 umfasst die 67 in Petiolen regulierten VLIGs 5 dpi (p ≤ 0,1; Induktion

≥ 2,0), Kreis R18 umfasst die 63 regulierten VLIGs aus der Blattrosette 18 dpi (p ≤ 0,1; Induktion ≥ 2,0).

Die in den Schnittmengen auftertenden Transkripte sind im Anhang in Tabelle 9 (Seite 126) aufgelistet.

3.2.2 Vergleich der durch die Verticillium longisporum-Pathovare

Im Dokument Transkriptomanalyse der <i>Arabidopsis</i>-Wurzel nach Infektion mit dem pilzlichen Pathogen <i>Verticillium longisporum</i> und Identifizierung von transkriptionellen Regulatoren der Pathogenantwort (Seite 62-67)