3. Ergebnisse
3.2 Einfluss der AR-Region auf die Aktivität von AvrBs3
3.2.3 Einfluss von Deletionen in der AR-Region auf die Aktivität von AvrBs3
Da die Substitution von neun AS in den ersten 45 AS der AR-Region von AvrBs3 zur reduzierten Aktivität des Proteins führte, aber nicht zu einer schlechteren DNA-Bindung an das UPA20-EBEAvrBs3, kann vermutet werden, dass die Bindung von Interaktionspartnern eine essentielle Rolle bei der Aktivität spielen könnte. Durch die Erstellung von Deletionsderivaten von AvrBs3 sollte dies untersucht werden. Die Aufteilung der AR-Region in zwei Teile erfolgte analog zu den in Kapitel 3.2.1 untersuchten AS der AvrBs3-Chimären. Zum Einen wurden die AS 2-46 (AvrBs3ΔAR2-46) und zum Anderen die AS 45-155 der AR-Region von AvrBs3 (AvrBs3ΔAR46-155) deletiert werden (Abbildung 11 A). Weiterhin erfolgte die Deletion der AS 3-155, welche der gesamten AR-Region von AvrBs3 (AvrBs3ΔAR3-155) entsprechen (Abbildung 11 A). Die AvrBs3-Deletionsderivate wurden in pGGA8 kloniert und die Aktivität hinsichtlich der Aktivierung des GUS-Reportergens unter Kontrolle der UPA20-EBEAvrBs3, wie zuvor beschrieben, ermittelt. Die Aktivität von AvrBs3-WT wurde auf 100 % gesetzt. Wie aus der Abbildung 11 A hervorgeht, war die GUS-Aktivität der AvrBs3-Deletionsderivate im Gegensatz zu AvrBs3-WT reduziert.
Während nach Expression von AvrBs3ΔAR2-46 noch etwa 50 % GUS-Aktivität detektiert wurden, lag die GUS-Aktivität im Fall von AvrBs3ΔAR46-155 und AvrBs3ΔAR3-155 nur bei 5 %. Das lässt den Schluss zu, dass die Aktivität von AvrBs3ΔAR45-155 und AvrBs3ΔAR3-155 im Vergleich zu AvrBs3-WT stark verringert ist. Um auf stabile Expression der Proteine zu testen, wurden Immunblot Analysen durchgeführt. Wie die Abbildung 11 B zeigt, war für AvrBs3ΔAR46-155 ein reduziertes
47 Proteinlevel zu detektieren. Eine geringere Syntheserate von AvrBs3ΔAR46-155 im Vergleich zu AvrBs3-WT könnte die geringere Aktivität im GUS-Assay erklären.
Können die AvrBs3-Deletionsderivate nach ihrer Typ-III-Translokation durch Xcv in planta eine Hypertrophie bzw. die HR in Paprikapflanzen induzieren? Für die Expression von FLAG-Fusionsproteinen der AvrBs3-Deletionsderivate AvrBs3ΔAR2-46, AvrBs3ΔAR45-155 bzw.
AvrBs3ΔAR3-155 wurden die entsprechenden Gene in pGGX1 kloniert und in die Xcv-Stämme 85-10 und 85*ΔhpaB konjugiert. Als Kontrollen dienten die in Kapitel 3.1.1 erstellten Xcv-Stämme.
Die entsprechenden Xcv 85-10 bzw. 85*ΔhpaB-Stämme wurden in Paprikapflanzen des Kultivars ECW bzw. ECW-30R inokuliert. Wie in der Abbildung 11 A gezeigt, induzierten die Xcv-Stämme mit AvrBs3ΔAR45-155 und AvrBs3ΔAR3-155 eine im Vergleich zu dem Xcv-Stamm mit AvrBs3-WT reduzierte Hypertrophie bzw. HR. Ebenso war die für den Xcv-Stamm mit AvrBs3ΔAR2-46 induzierte Hypertrophie, im Vergleich zu dem Xcv-Stamm mit AvrBs3-WT, reduziert (Abbildung 11 C). Dagegen induzierte der Xcv-Stamm mit AvrBs3ΔAR2-46 nur in einigen Fällen eine im Vergleich zu dem Xcv-Stamm mit AvrBs3-WT reduzierte HR (Abbildung 11 C). Zum Nachweis der stabilen Expression der Proteine in Xcv wurden Immunblot-Analysen durchgeführt. Alle Proteine wurden in ähnlichen Mengen exprimiert (Abbildung 11 D). Als Ladekontrolle diente das Chaperon GroEL. Beobachtete Unterschiede sind somit nicht auf unterschiedliche Syntheseraten der Proteine zurückzuführen.
48 Abbildung 11: Analyse des Einflusses von Deletionen in der AR-Region auf die Aktivität von AvrBs3
(A) Schematische Darstellung von AvrBs3 bzw. AvrBs3-Deletionsderivaten mit Angabe der deletierten AS in der AR-Region, sowie UPA20-EBEAvrBs3-vermittelte Reportergenaktivierung durch AvrBs3 und AvrBs3-Deletionsderivate im Vergleich zu AvrBs3-WT. GUS-Aktivität wurde 3 Tage nach Agrobacterium-vermitteltem Ko-Transfer der Konstrukte für den Reporter, gfp, avrBs3 oder Derivaten bestimmt. Die Aktivität von AvrBs3-WT wurde auf 100 % gesetzt.
Fehlerbalken kennzeichnen die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten (Test; *, P < 0,05; **, P
<0,01). (B) Expression der c-Myc-AvrBs3-Fusionsproteine in Blättern von N. benthamiana. Proben wurden den in (A) analysierten Proben entnommen und im Immunblot mit c-Myc-spezifischem Antikörper analysiert. Molekulare Massen sind in Kilodalton (kDa) angegeben. Das Experiment wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.
(C) Xcv 85*ΔhpaB bzw. 85-10 mit pGGX1:LV (Leervektor, —), pGGX1:avrBs3, pGGX1:avrBs3ΔAR2-46, pGGX1:
avrBs3ΔAR45-155 bzw. pGGX1: avrBs3ΔAR3-155 wurden in ECW- bzw. ECW-30R- Paprikapflanzen inokuliert. Die Blätter der ECW-Paprikapflanzen wurden 8 dpi Inokulation fotografiert und die ECW-30R-Blätter 3 dpi geerntet und in Ethanol gebleicht. (D) Immunblot mit FLAG-spezifischem Antikörper zum Nachweis der Expression der AvrBs3-Derivate in Xcv 85*ΔhpaB und 85-10. GroEL diente als Ladekontrolle. Molekulare Massen sind in Kilodalton (kDa) angegeben. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.
Um die für die Xcv-Stämme mit den AR-Deletionsderivaten beobachtete reduzierte HR genauer zu analysieren, wurden diese Xcv-Stämme in ECW-30R-Pflanzen inokuliert und die Ausbildung der HR zu früheren Zeitpunkten (24, 46, 54 und 72 hpi) dokumentiert (Abbildung 12 A).
Während 24 hpi makroskopisch noch keine Reaktion zu beobachten war, wurde die durch den
49 Xcv-Stamm mit AvrBs3ΔAR2-46 induzierte HR 46 und 54 hpi sichtbar. Die HR war zu diesen Zeitpunkten noch nicht für die Xcv-Stämme mit AvrBs3ΔAR45-155 und AvrBs3ΔAR3-155
beobachtbar (Abbildung 12 A). 72 Stunden nach Infektion induzierten alle Xcv-Stämme eine HR. Die HR war für die Xcv-Stämme mit AvrBs3-Deletionsderivaten im Vergleich zum Xcv-Stamm mit AvrBs3-WT deutlich reduziert (Abbildung 12 A).
Zur Quantifizierung der HR in resistenten Paprikapflanzen wurden Leitfähigkeitsmessungen, wie zuvor beschrieben, durchgeführt (Kapitel 3.2.1). Die Abbildung 12 B zeigt, dass 44 Stunden nach Infektion eine reduzierte Leitfähigkeit durch die Xcv-Stämme mit den AvrBs3-Deletionsderivaten zu beobachten war, im Vergleich zu dem Xcv-Stamm mit AvrBs3-WT. Die beobachtete Leitfähigkeit der Blattprobe, welches durch den Xcv-Stamm mit AvrBs3ΔAR2-46
infiziert wurde, war im Vergleich zu Blattmaterial, das durch den Xcv-Stamm mit AvrBs3-WT infiziert wurde, um ca. 30 % reduziert (Abbildung 12 B). Dagegen war die Leitfähigkeit der Blattproben, welche durch die Xcv-Stämme mit AvrBs3ΔAR45-155 und AvrBs3ΔAR3-155 infiziert wurden, mit der Blattprobe vergleichbar, die durch den Xcv-Stamm mit dem Leervektor infizierte wurde (Abbildung 12 B). Eine Bestimmung der Leitfähigkeit zu späteren Zeitpunkten war durch die fortschreitende HR des infizierten Blattgewebes hierbei nicht möglich. Weiterhin wurden RT-PCR-Analysen von mit Xcv-infizierten ECW-30R-Blättern, wie zuvor beschrieben, durchgeführt (3.1.1). Wie die Abbildung 12 C zeigt, bestätigen die RT-PCR-Analysen, dass die Induktion des Bs3-Resistenzgens nach Infektion durch Xcv-Stämme mit AvrBs3-Deletionsderivaten im Vergleich zu dem Xcv-Stamm mit AvrBs3-WT reduziert war.
Nur für die Blattprobe, die durch die Xcv-Stämme mit AvrBs3-WT und AvrBs3ΔAR2-46 infiziert wurde, konnte das Bs3-Transkript 6 hpi ermittelt werden. Dagegen war 10 hpi auch Bs3-Transkript für die Blattproben, welche durch die Xcv-Stämme mit AvrBs3ΔAR45-155 und AvrBs3ΔAR3-155 infiziert wurden, nachweisbar (Abbildung 12 C). Die Bs3-Transkriptmenge für Blattproben, die durch Xcv-Stämme mit AvrBs3ΔAR45-155 und AvrBs3ΔAR3-155 infiziert wurden, war jedoch geringer als für Blattproben, welche durch Xcv-Stämme mit AvrBs3-WT und AvrBs3ΔAR2-46 infiziert wurden (Abbildung 12 C). Die nachgewiesenen Bs3-Transkriptmengen in Blattproben von ECW-30R-Paprikapflanzen, welche durch Xcv-Stämme mit AvrBs3, AvrBs3ΔAR2-46, AvrBs3ΔAR45-155 und AvrBs3ΔAR3-155 infiziert wurden, korrelieren mit den beobachteten reduzierten Reaktionen.
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Abbildung 12: Untersuchung der durch AvrBs3-WT und AvrBs3-Deletionsderivate induzierten HR in ECW-30R-Paprikapflanzen.
(A) Xcv 85-10 mit pGGX1:LV(Leervektor; —, pGGX1:avrBs3, pGGX1:avrBs3ΔAR2-46, pGGX1: avrBs3ΔAR45-155 bzw.
pGGX1: avrBs3ΔAR3-155 wurden in ECW-30R-Paprikapflanzen inokuliert. Zur besseren Visualisierung der HR wurden die Blätter 24, 46, 54, 72 hpi in Ethanol gebleicht. (B) Leitfähigkeitsmessung der unter (A) inokulierten Bereiche 20 und 44 hpi. Die Leitfähigkeit wurde als prozentualer Wert der maximalen Leitfähigkeit des Blattmaterials dargestellt.
Fehlerbalken kennzeichnen die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten (T-Test; *, P < 0,05). (C) RT-PCR von Bs3-cDNA aus nicht-infiziertem und mit den in (A) Xcv-infizierten Paprika ECW-30R-(Bs3)-Blättern 6 und 10 hpi. Die Amplifikation der Elongationsfaktor 1α (EF1α)-cDNA diente als Kontrolle. Alle Ergebnisse wurden zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.