von HCV und auf den stimulatorischen Effekt der miR-122
2.5 Diskussion Teil II
2.5.1 Optimierung der Zellsynchronisierung
Da in Untersuchungen der verschiedenen Zellzyklusphasen meist HeLa-, HEK293- oder NIH/3T3-Zellen benutzt werden, ergab sich zunächst die Aufgabe, die Synchronisierungs-Protokolle für die in dieser Arbeit verwendeten Huh7-Zellen zu optimieren.
In Zellzyklus-Studien werden Zellen gezielt in der gewünschten Phase arretiert und in weiteren Experimenten als homogene Zellpopulation, die sich in einer definierten Zellzyklusphase befindet, analysiert. Bei Untersuchungen des Zellzyklus wurde bisher eine Vielzahl von Zelltypen durch unterschiedliche Methoden synchronisiert (zusammengefasst in Jackman u. O’Connor, 2001).
Um Zellen in der G1/S-Phase zu arretieren, behandelt man die Zellen mit Desoxythymidin zur allosterischen Inhibierung der Ribonukleotid-Reduktase und der Desoxynukleosid Kinase (Mikkelsen et al., 2003) oder mit Mimosin, wodurch die Zellen daran gehindert werden in die S-Phase überzugehen (Bostock et al., 1971; Hughes u. Cook, 1996 und Urbani et al., 1995). Für die Synchronisierung in der S-Phase können Hydroxyharnstoff, das die Ribonukleotid-Reduktase hemmt, oder Aphidicolin, welches die DNA-Polymerase inhibiert, verwendet werden (Ikegami et al., 1978; Darzynkiewicz et al., 1979 und Urbani et al., 1995). Möchte man Zellen in der G2/M-Phase blocken, erfolgt dies am besten mit Nocodazol, Colcemid (verhindern die Mikrotubuli-Polymerisierung) oder mit dem so genannten „Shake off“ (Schorl u.
Sedivy, 2007; Zieve et al., 1980 und Urbani et al., 1995). Die G0- oder Ruhephase kann erreicht werden, indem die Zellen entweder unter Entzug von Wachstumsfaktoren oder bis zur Kontaktinhibition inkubiert werden (Schorl u.
Sedivy, 2007).
In dieser Arbeit wurde zunächst nach geeigneten Methoden der Synchronisierung für die Zelllinien Huh7 und HeLa gesucht. Eine Synchronisierung in der G2/M-Phase mit der Behandlung durch Nocodazol zeigte in der FACS (fluorescence activated cell sorting)-Analyse einen starken Peak für das 4-Chromatid-Chromosomenstadium, also der G2/M-Phase.
Allerdings wurde auch ein Peak von G0/G1-Zellen detektiert. Somit waren nicht alle Zellen, die mit dieser Methode synchronisiert, wurden in der G2/M-Phase, und alle weiterführenden Versuche hätten Zellen mit einbezogen, die sich noch in der G0/G1-Phase befinden, und dadurch das Ergebnis möglicherweise verfälscht.
Eine alternative Methode stellt der „Shake off“ dar. Dabei werden abgerundete mitotische Zellen mechanisch von der Zellkulturschale gelöst (Hulleman et al., 1999). Da aber die Ausbeute an abgerundeten mitotischen Zellen sehr gering ist und daher besonders viele Zellen als Ausgangsmaterial verwendet werden müssen, wurde hier die Nocodazol-Behandlung mit dem „Shake off“ kombiniert.
So wurden die Zellen zunächst mit Nocodazol behandelt. Im Anschluss daran konnten dann viele mitotische abgerundete Zellen durch den „Shake off“ von der Zellkulturschale gelöst werden. Als Ergebnis erhält man bei der FACS-Analyse einen einzelnen Peak von Zellen in der G2/M-Phase.
Für eine Synchronisierung der Zellen in der S-Phase wurden zunächst Huh7-Zellen mit der Methode des doppelten Thymidin-Blocks gestoppt. Dabei stellte sich heraus, dass auch diese Methode für Huh7-Zellen nicht zum Erfolg führte.
Deshalb wurden hier wiederum verschiedene Methoden kombiniert. Zuerst wurden die Zellen mit Hilfe des Nocodazol-Blocks in der M-Phase arretiert und mit Hilfe des „Shake off“ gesammelt. Diese Zellen wurden dann mit Thymidin für 19 Stunden inkubiert. Bei dieser Kombination der Methoden erhält man dann nach kurzer Rekultivierung der Zellen in frischem Medium ohne Thymidin Zellen in der S-Phase.
Die G0-Phase der Huh7- und HeLa-Zellen wurde in dieser Arbeit mit einem Wachstum der Zellen bis zu einer Dichte von 100 % erreicht. Nachdem diese Dichte erreicht wurde, wurden die Zellen zusätzliche 24 Stunden inkubiert. In der FACS-Analyse ist ein deutlicher Peak beim 2-Chromatid-Chromosomenstadium, das der G0- oder G1-Phase entspricht, zu erkennen.
Dieser Peak ist gleich bleibend für etwa sechs Stunden zu beobachten.
Allerdings gehen die Zellen nach dem Splitten und einer Rekultivierung in frischem Medium schnell wieder in die G1-Phase über, was nur durch einen Westernblot detektierbar war. In der G0-Phase wird das Protein p27Kip1 sehr stark exprimiert (Polyak et al., 1994; Llyod et al., 1999 und Coats et al., 1996).
Bei den analysierten Zellen konnte dieses Protein nur bis maximal zwei Stunden nach der Rekultivierung nachgewiesen werden. Folglich mussten alle Experimente, die in der G0-Phase erfolgen sollten, innerhalb dieser Zeit durchgeführt werden. Bei den in der hier vorliegenden Arbeit folgenden Transfektionsversuchen wurden die Huh7- und HeLa-Zellen daher für die G0 -Phase in der 24-well-Platte bis zur Konfluenz von 100 % inkubiert und dann im selben Well transfiziert, um sicherzustellen, dass kein Übergang zur G1-Phase stattfinden kann.
2.5.2 Normalisierungsprobleme bei Zellzyklus-Experimenten
Bei Untersuchungen zellzyklus-abhängiger Vorgänge ist es schwer, ein geeignetes Mittel für eine Normalisierung zu finden, da viele Parameter bei den Experimenten eine Rolle spielen.
Für eine Normalisierung der aufzutragenden RNA-Mengen bei einem Northernblot wurde bei dieser Arbeit auf die gängige Angleichung der snRNA U6 verzichtet. In dieser Arbeit konnte bei Experimenten mit HeLa-Zellen eine etwas stärkere Expression von U6 in der S-Phase im Vergleich zu den übrigen Zellzyklusphasen detektiert werden. Im Gegensatz dazu ist bei Huh7-Zellen in der S-Phase die geringste Konzentration an U6 detektierbar.
Es wurde berichtet, dass die Expression von U6 in den einzelnen Zellzyklusphasen unterschiedlich ist (White et al., 1995 und Hu et al., 2004). Für die Transkription des U6-Gens ist die Polymerase III verantwortlich (Brow u.
Guthrie, 1988). Diese wird unter anderem durch die Proteinkinase CK2 reguliert. CK2 phosphoryliert zu unterschiedlichen Zeiten des Zellzyklus verschiedene Proteine des Polymerase-Komplexes und reguliert dadurch die Transkription (Hu et al., 2004). Bei den Untersuchungen von White und Hu wurde beobachtet, dass U6 in der S-Phase in großen Mengen vorliegt, die Menge jedoch in der M- und in der G0-Phase reduziert ist (White et al., 1995 und Hu et al., 2004). In der Studie von White et al. (1995) wurden HeLa-Zellen mit verschiedenen Methoden synchronisiert und dann analysiert. Anhand der FACS-Ergebnisse befinden sich die Zellen jedoch statt in der S-Phase eher am Übergang zwischen G1 und S, da der Peak der analysierten Zellpopulation nicht zwischen den beiden Hauptpeaks der G0/G1- und G2/M-Phase liegt. Bei den Experimenten von Hu et al. wurden HeLa-Zellen nur durch die Behandlung von Hydroxyharnstoff synchronisiert und zu bestimmten Zeitpunkten analysiert.
Jedoch sind dort keine FACS-Daten gezeigt, die belegen, dass sich die Zellen tatsächlich in den angegebenen Phasen befinden. Bei beiden Gruppen kam heraus, dass die U6-Menge in der S-Phase am größten ist, in der G2-Phase abnimmt, während der Mitose keine U6-RNA detektiert ist und U6 in der G1 -Phase nur in geringen Mengen vorliegt.
In der hier vorliegenden Arbeit konnte bei Experimenten mit HeLa-Zellen eine etwas stärkere Expression von U6 in der S-Phase im Vergleich zu den anderen Phasen nachgewiesen werden. Die Mengen von U6 in den Phasen G0 und G2/M sind jedoch annähernd gleich (s. Abb. 36 C). Bei Huh7-Zellen ist im Gegensatz dazu in der S-Phase die geringste Konzentration an U6 detektierbar, wobei das Verhältnis G2/G1 etwa mit der Berechnung von White et al.
übereinstimmt (G2/G1 = 2,6).
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine Normalisierung auf die Menge der snRNA U6 bei RNA-Expressionsuntersuchungen für Zellzyklus-Experimente per Northernblot nicht geeignet ist und daher eine Normalisierung auf die Zellzahl eine sinnvollere Option darstellt.
Ein weiteres Problem der Normalisierung besteht bei Transfektionsexperimenten in verschiedenen Zellzyklusstadien. Dabei gibt es eine Vielzahl von Variablen, die beachtet werden sollten, was es erschwert, einen geeigneten Parameter für eine Normalisierung der gemessenen FLuc-Daten zu finden. Zum Teil handelt es sich um unterschiedliche Zellzahlen.
Diese Zellen können verschiedene Zellvolumina haben, woraus sich eventuell unterschiedliche Proteinmengen ergeben. Des Weiteren können auch durch größere Zellvolumina mehr Zellorganellen vorliegen, die zum Beispiel den Zellmetabolismus fördern können. Da bei Transfektionen die Translation einer Reporter-RNA untersucht wird, sollte man ebenso die Translation eines
Co-Abb. 36 Expression von U6 während unterschiedlichen Zellzyklusphasen
(A) bis (C) dargestellt ist die Expression von U6 in verschiedenen Zellzyklusphasen. (A) Graphik übernommen aus White et al., 1995. Northernblot für snRNA U6 aus HeLa-Zellen. (B) Graphik übernommen aus Hu et al., 2004. Northernblot für snRNA U6 aus HeLa-Zellen. (C) Northernblots für die snRNA U6 aus Huh7- und HeLa-Zellen in unterschiedlichen Zellzyklusstadien (eigene Daten). A, AS und n.s.: asynchron gewachsene Zellen. G0: G0-Phase. G1: G1-Phase. S:S-Phase. G2: G2-Phase.
G2/M: G2/M-Phase. M: M-Phase.
Reporters betrachten. Damit ist es schwer einen Parameter zu bestimmen, der für eine Normalisierung sinnvoll erscheint.
Die Zellzahl kann bei Transfektionen nicht in allen Fällen gut bestimmt werden, da die Zellen für die G0-Phase in einer 24-well-Platte bis zur Kontaktinhibition wachsen und es bei konfluenten Zellkulturen problematisch ist, die Zellzahl zu bestimmen. Die co-transfizierte RLuc-RNA war ebenso nicht sonderlich gut geeignet, da zum Beispiel die durch RLuc normalisierten FLuc-Ergebnisse (FLuc/RLuc) in der S-Phase deutlich anstiegen und die Translation des RLuc-Reporters bei einigen Experimenten mit der Translation der HCV-FLuc-RNA korrelierte. In dieser Arbeit wurde auch die Proteinmenge der transfizierten Zellen sowie die metabolische Aktivität durch die Messung der Umsetzung von WST-1 bestimmt. Diese beiden Faktoren korrelierten weitestgehend. Da die metabolische Aktivität auch in den unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus sehr ähnlich war, war die WST-1 Messung ein gutes Mittel für die Normalisierung der FLuc-Daten.