Charakterisierung des REMI-Ereignisses durch DNA-Hybridisierung

Die apathogene REMI-Mutante LB2057 stellte den Ausgangspunkt der vorliegenden Arbeit dar. Unter Verwendung von PCR-Walking-Methoden und anschließender Sequenzierungen war die Insertion des pAN7-1-Vektors in eine BamHI-Restriktionsstelle im 5‘-Bereich eines Gens nachgewiesen worden, das als PFP1 bezeichnet wurde. Die Identifizierung sich wiederholender Vektor-Sequenzen hatte zu der Annahme geführt, dass eine repetitive Vektorintegration in die BamHI-Schnittstelle vorlag. DNA-Hybridisierungen hatten jedoch kein Ergebnis erbracht (Albert & Knogge, unveröffentlichte Ergebnisse).

Zu Beginn der vorliegenden Arbeit sollten diese Untersuchungen deshalb zunächst wiederholt werden, um Angaben über die Anzahl der integrierten Kopien des pAN7-1-Vektors und deren Insertionsrichtung in der REMI-Mutante LB20₅₇ zu erhalten.

Zu diesem Zweck wurde Myzel des Rhynchosporium-commune-Wildtyp-Isolats UK7, der REMI-Mutante LB2057 und der REMI-Komplementationsmutante in großen Petrischalen in Flüssigmedium angezogen. Nach zwei Wochen wurde das Myzel geerntet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Aus dem Material wurde die genomische DNA mittels Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert. Jeweils 15 µg der DNA des Wildtyps sowie der Mutanten wurden mit Restriktionsenzymen über Nacht geschnitten. Die Enzyme wurden so gewählt, dass ihre Schnittstellen sowohl in der pAN7-1-Vektor-DNA als auch in der PFP1-Gensequenz lagen. Genutzt wurden die Restriktionsenzyme SalI, NheI sowie BstEII (Eco91I) (vgl. Abb. 3.2 sowie 3.3). Als Positivkontrollen dienten der Vektor pAN7-1 sowie ein pCR2.1-Vektorkonstrukt, das ein 1020 bp langes DNA-Fragment des 5‘-untranslatierten Bereichs des PFP1-Gens enthielt (pCR2.1-PFP1-5‘-UTR; Abb. 3.4). Jeweils 3 µg der Vektoren wurden mit den oben genannten Enzymen (pAN7-1) bzw. mit dem Enzym EcoRI (pCR2.1-PFP1-5‘-UTR) ebenfalls über Nacht restrigiert. Die gesamte mit den Restriktionsenzymen behandelte genomische DNA des Wildtyps und der Mutanten sowie die linearisierten Vektoren wurden in jeweils identischer Reihenfolge auf zwei 1%igen Agarose-Gelen bei 30 V über Nacht aufgetrennt (vgl. Abb. 7.5.1).

Die DNA wurde nach der elektrophoretischen Auftrennung mittels Vakuum-Blot auf jeweils eine positiv geladene Nylon-Membran (Membranen 1 und 2) transferiert. Die

Hybridisierung erfolgte mit zwei unterschiedlichen Sonden. Als Sonde 1 diente ein 342 bp langes DNA-Fragment aus der kodierenden Sequenz der Hygromycin-B-Resistenzkassette (HPH). Das DNA-Fragment wurde mit den Oligonukleotiden HPH1s und HPH2as (#38/#39, s. 7.1) aus dem pAN7-1-Vektor amplifiziert und auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Als zweite Sonde wurde der 5‘-untranslatierte Bereich des PFP1-Gens genutzt. Das in den Vektor pCR2.1 klonierte 1020 bp lange DNA-Fragment wurde durch Restriktion mit dem Enzym EcoRI ausgeschnitten und ebenfalls auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Beide Fragmente wurden aus dem Gel eluiert und für die radioaktive Markierung mit α-[³² P]-dATP verwendet.

Die Hybridisierung fand über Nacht bei 60°C statt. Membran 1 wurde mit Sonde 1 (HPH), Membran 2 mit Sonde 2 (PFP1-5‘-UTR) behandelt. Die nach der radioaktiven Markierung aufgelegten Phosphor-Screens wurden nach fünf Stunden Inkubation mittels Typhoon^®-Scanner entwickelt. Die Ergebnisse zeigen die Abbildungen 3.1a bzw. 3.1b.

Der Phosphor-Screen 1 zeigt die radioaktive Markierung des Hygromycin-B-Phosphotransferasegens (HPH) in der REMI-Mutante LB2057 sowie in der REMI-Komplementationsmutante. Durch die vorangegangene Transfektion mit dem Pilzexpressionsvektor pAN7-1 sind diese Träger der Resistenzkassette. Als Positivkontrolle dient der linearisierte Vektor pAN7-1 selbst. Im Wildtyp UK7 ist die HPH-Gensequenz nicht vorhanden. Dieser zeigt demnach keine Markierung durch die Sonde.

Im zweiten Phosphor-Screen ist die radioaktive Markierung des 5‘-untranslatierten Bereiches des PFP1-Gens sowohl in den beiden Mutanten als auch im Wildtyp UK7 dargestellt. Als Positivkontrolle dient das mit EcoRI restringierte Vektorkonstrukt pCR2.1-PFP1-5‘-UTR, das auch zur Sondenherstellung genutzt wurde. pAN7-1 enthält keine PFP1-Sequenzen und wird deshalb nicht markiert.

Abbildung 3.1a: Phosphor-Screen 1: Ergebnis der DNA-Hybridisierung 1 unter Verwendung der Sonde 1 (HPH).

Spezifische radioaktive Hybridisierung des Hygromycin-B-Phosphotransferasegens (HPH) in der genomischen DNA der REMI-Mutante LB20₅₇ (R), der REMI-Komplementationsmutante (K) sowie in der linearisierten Vektorkontrolle pAN7-1 (V1). Der Wildtyp UK7 (U) enthält das HPH-Gen nicht und zeigt deshalb keine Markierung. Alle Proben wurden mit drei verschiedenen Restriktionsenzymen behandelt (siehe unterschiedliche Fragmentgrößen). SI – SalI; NI – NheI; BEII – BstEII. Als Größenstandard diente eine 1 kb-DNA-Leiter (M).

Abbildung 3.1b: Phosphor-Screen 2: Ergebnis der DNA-Hybridisierung 2 unter Verwendung der Sonde 2 (PFP1-5‘-UTR).

Spezifische radioaktive Hybridisierung des 5‘-untranslatierten Bereiches des PFP1-Gens im R.-commune-Wildtyp UK7 (U), der REMI-Mutante LB20₅₇ (R) und der REMI-Komplementationsmutante (K). Als Positivkontrolle diente das mit EcoRI (ERI) restrigierte Vektorkonstrukt pCR2.1-PFP1-5‘-UTR (V2). Im Vektor pAN7-1 ist das PFP1-Gen nicht enthalten und zeigt deshalb keine Markierung. Alle Proben (bis auf V2) wurden mit den Enzymen SalI (SI), NheI (NI) sowie BstEII (BEII) restrigiert.

Größenstandard – 1 kb-DNA-Leiter (M).

Die Position der Erkennungsstellen der verwendeten Restriktionsenzyme, die erwarteten Fragmentgrößen sowie die daraus resultierenden Schlussfolgerungen über die Anzahl der Vektorkopien und deren Insertionsrichtung in der REMI-Mutante LB2057 sind in der Abbildung 3.2 schematisch dargestellt. Die entsprechenden Situationen im Wildtyp UK7 zeigt die Abbildung 3.3. Die verwendeten Enzyme SalI, NheI und BstEII besitzen Restriktionsstellen im Promotorbereich (P_gpd) der Hygromycin-B-Resistenzkassette der pAN7-1-Vektor-Sequenz sowie im PFP1-Gen. Mit der HPH-Sonde konnten sowohl in der REMI-Mutante als auch in der Komplementationsmutante jeweils zwei DNA-Fragmente markiert werden, wobei die Größe des einen Fragments stets der Größe des kompletten pAN7-1-Vektors entspricht, die des anderen aber variabel ist (Abb. 3.1a). Die Markierung zweier DNA-Fragmente mit dieser Größenverteilung lässt die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei dem REMI-Ereignis um eine doppelte Integration des pAN7-1-Vektors in die BamHI-Schnittstelle im Promotorbereich des PFP1-Gens handelt. Durch den Nachweis der Vektorgröße von 6756 bp ist es außerdem möglich, die Richtung der Insertion der pAN7-1-Sequenzen zu bestimmen. Demnach müssen die Vektoren in „Kopf-Schwanz“-Weise inseriert sein, da alle anderen möglichen Insertionsrichtungen entweder sehr viel kleinere Banden oder Fragmente der doppelten Vektorgröße ergeben hätten. Die Größe des jeweils zweiten markierten DNA-Fragments gibt zusätzlich Aufschluss über die Leserichtung der inserierten Vektorsequenzen.

Demnach kommt nur eine Orientierung beider Vektorsequenzen in sense-Richtung in Frage, da die markierten Fragmente bei antisense-Ausrichtung wesentlich größer sein müssten (vgl. Abb. 3.2).

Abbildung 3.1b zeigt den Nachweis des PFP1-Gens im Wildtyp UK7 sowie in den beiden Mutanten. Die hier genutzte Sonde 2 bindet im 5‘-untranslatierten Bereich des PFP1-Gens. Im Wildtyp konnte nur ein DNA-Fragment markiert werden, da die jeweils genutzte Restriktionsstelle nur einmal in der Sequenz vorkommt (vgl. Abb. 3.3). Sowohl die als auch die Komplementationsmutante zeigen mehrere Banden. In der REMI-Mutante ist die Bindungsstelle der PFP1-Sonde durch die Insertion der beiden pAN7-1-Vektorkopien unterbrochen. Deshalb kann die Sonde an zwei Fragmente binden: zum einen direkt vor der BamHI-Insertionsstelle, zum anderen direkt danach (vgl. Abb. 3.2).

In der Komplementationsmutante können sowohl die Wildtyp-Banden nachgewiesen werden, als auch die für die REMI-Mutante spezifischen Fragmente. Zusätzlich dazu sind noch mehrere Fragmente unterschiedlicher Größe markiert, die sehr wahrscheinlich auf multiple Integrationen des Komplementationsvektors in das Genom der REMI-Mutante zurückzuführen sind.

Abbildung 3.2a

Abbildung 3.2b

Abbildung 3.2c

Abbildung 3.3a

Abbildung 3.3b

Abbildung 3.3c

Abbildung 3.4a

Abbildung 3.2: Schematische Darstellungen der pAN7-1-Insertionsstelle im Promotorbereich des PFP1-Gens der REMI-Mutante LB2057.

Die Abbildungen 3.2a-c zeigen die zweifache Integration des linearisierten pAN7-1-Vektors in den 5‘-untranslatierten Bereich des PFP1-Gens. Blaue Pfeile zeigen die kodierenden Sequenzen sowie die Lese-Richtungen des Hygromycin-B-Phosphotransferase-Gens HPH (H) und der bis zu diesem Zeitpunkt bekannten Sequenz des PFP1-Gens (Exon 1, E1). Blau-weiß schraffiert ist das zweite Exon (E2) der kodierenden Sequenz des PFP1-Gens dargestellt, das erst später identifiziert wurde (s. 3.2.1.2). Mit roten Pfeilen markiert sind die Promotorsequenzen des Gens der Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase P_gpd (P) aus Aspergillus nidulans. Grüne Boxen zeigen die Terminatorsequenzen T_trpC (T) des Strukturgens TRPC des Tryptophan-Operons ebenfalls aus A. nidulans. Mit senkrechten roten Pfeilen dargestellt, sind die Insertionsrestriktionsstellen des Enzyms BamHI (BHI) sowie die Restriktionsstellen der für das DNA-Hybridisierungsexperiment verwendeten Enzyme SalI (SI, Abb. 3.2a), NheI (NI, Abb. 3.2b) und BstEII (BEII, Abb. 3.2c). Waagerechte rote Pfeile geben die erwarteten und im Hybridisierungsexperiment markierten Fragmentgrößen an. Die Bindungsstellen der verwendeten Sonden 1 und 2 (S1, S2) sind mit orangen Linien markiert.

Abbildung 3.3: Schematische Darstellungen der PFP1-Genstruktur im R.-commune-Wildtyp UK7.

Die Abbildungen 3.3a-c zeigen die Genstruktur des PFP1-Gens im Wildtyp UK7. Mit blauem Pfeil dargestellt ist die bis zu diesem Zeitpunkt bekannte kodierende Sequenz des Gens (Exon 1, E1). Der blau-weiß schraffierte Pfeil zeigt das erst später identifizierte Exon 2 (E2) (s. 3.2.1.2). Senkrechte rote Pfeile kennzeichnen die BamHI (BHI)-Insertionsstellen sowie die Restriktionsstellen der für die DNA-Hybridisierung eingesetzten Enzyme (vgl. Abb. 3.2a-c). Waagerechte rote Pfeile geben die durch die jeweilige Restriktion entstehenden spezifischen Fragmentgrößen an. Die orange Linie gibt die Bindungsstelle der Sonde 2 (S2) an.

Abbildung 3.4: Schematische Darstellungen des Plasmids pAN7-1 und des Vektors pCR2.1-PFP1-5‘-UTR.

Die Abbildungen 3.4a und 3.4b zeigen die Vektoren pAN7-1 (a; 6756 bp) bzw. pCR2.1-PFP1-5‘-UTR (b;

4969 bp), die zur Herstellung der Sonden 1 und 2 für die DNA-Hybridisierungen genutzt wurden. Blaue Pfeile zeigen die kodierenden Sequenzen der Hygromycin-B- (H, Abb. 3.4a) sowie der Kanamycin- (K) und Ampicillin-Resistenzkassetten (A, Abb. 3.4b). Der rote Pfeil kennzeichnet die Promotorsequenz der Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase P_gpd (P), die grüne Box die Terminatorsequenz des TRPC-Gens aus A. nidulans (vgl. Abb. 3.2a-c). Die schmalen roten Pfeile markieren die Restriktionsstellen der für die Hybridisierungen sowie zur Sondenherstellung verwendeten Enzyme. Die Sonden 1 und 2 sind orange dargestellt. Sonde 1 (HPH) wurde per PCR mit den Oligonukleotiden 1 und 2 (O1s & O2as entspr. HPH1s

& HPH2as) aus dem pAN7-1-Vektor amplifiziert, Sonde 2 (PFP1-5‘-UTR) wurde aus dem Vektorkonstrukt pCR2.1-PFP1-5‘-UTR mit EcoRI (ERI) isoliert.