Biologische Relevanz der AvrBs3-Interaktoren

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gfp-74 silencing Bs3-transgenen N. benthamiana-Kontrollpflanzen zu beobachten. Die in den Blättern von NbZF- und NbRED silencing-Pflanzen beobachtete HR war mit den Kontrollpflanzen vergleichbare (Abbildung 21 B). Die AvrBs3-abhängige Hypertrophie auf Blättern von siZF1-, siZF2-, siRED1- und siRED2-silencing-Pflanzen war ebenso mit der AvrBs3-abhängigen Reaktion in den Kontrollpflanzen vergleichbar, während die Hypertrophie in UPA20-silencing Pflanzen reduziert war (Daten nicht gezeigt).

Um nachzuweisen, dass die Transkripte von NbZF und NbRED nach VIGS reduziert waren, erfolgten quantitative qRT-PCR-Analysen. Da das silencing-Konstrukt selbst nicht amplifiziert werden sollte, wurden spezifische Oligonukleotide für NbZF und NbRED gewählt, die nicht im silencing-Fragment binden (Abbildung 21 A). Von allen silencing-Pflanzen, sowie den nicht inokulierten und gfp-silencing Bs3-transgenen N. benthamiana-Pflanzen, wurde Blattmaterial geerntet, RNA isoliert und anschließend cDNA synthetisiert. Die nach qRT-PCR-Analysen erhaltenen Transkriptmengen für NbZF und NbRED wurden auf 100% gesetzt. Wie die Abbildung 21 C zeigt, war das nachgewiesen Transkript für die Bs3-transgenen siZF1-, siZF2-, siRED1- und siRED2-silencing-Pflanzen reduziert. Jedoch lag jeweils noch etwa 50 bis 60 % Transkript im Vergleich zu den nicht-behandelten und gfp-silencing-Pflanzen vor. Die gleiche Beobachtung konnte für die N. benthamiana-silencing-Pflanzen, im Vergleich zu den N.

benthamiana-Kontrollpflanzen, gemacht werden (Daten nicht gezeigt). Da in den NbZF- und NbRED-silencing-Pflanzen eine im Vergleich zu den Kontrollpflanzen vergleichbare Ausbildung der AvrBs3- abhängige Hypertrophie bzw. HR beobachtet wurde, waren die verbliebenen Transkriptmengen von NbZF und NbRED vermutlich ausreichend für die AvrBs3- abhängige Hypertrophie bzw. HR in N. benthamiana.

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Abbildung 21: Gen-silencing-Experimente von NbZF und NbRED in N. benthamiana

(A) Darstellung der Lage der für das silencing-Fragmente für NbZF und NbRED. Es wurden jeweils zwei verschiedene Fragmente gewählt (siZF1, siZF2, siRED1 und siRED2). Weiterhin ist die Lage der RT-PCR-Fragmente dargestellt. (B) Analyse der Ausbildung von AvrBs3-abhängiger HR auf nicht-behandelten und sigfp-, siZF1-, siZF2-, siRED1- und siRED2-silencing Bs3-transgenen N. benthamiana-Pflanzen. Zehn Tage nach silencing wurde Agrobacterium-vermittelt c-Myc4-AvrBs3 bzw. c-Myc4-GFP in den Bs3-transgenen N. benthamiana-Pflanzen exprimiert. Die Blätter wurden 3 dpi fotografiert. Die Bilder zeigen typische Ausprägungen der AvrBs3-HR für die jeweiligen silencing-Pflanzen. Das Experiment wurde dreimal mit jeweils fünf Pflanzen wiederholt und zeigte vergleichbare Ergebnisse.

(C) qRT-PCR-Analyse zur Analyse der Transkriptmenge von NbZF und NbRED in den entsprechenden Bs3-transgenen silencing-Pflanzen, sowie in den Kontrollpflanzen. Drei Wochen nach Beginn des silencing-Experiments wurde von allen Pflanzen Blattmaterial geerntet, RNA isoliert, cDNA synthetisiert und anschließend die Mengen von SlZF und CaRED durch eine qRT-PCR-Reaktion analysiert. Die Transkriptmenge von NbZF und NbRED in den Kontrollepflanzen wurden 100 % gesetzt. Die Zahlen symbolisieren verschiedene Pflanzen. Fehlerbalken kennzeichnen die Standardabweichung von vier biologischen Replikaten.

3.4.6.2 Ko-Expression von AvrBs3 und den Interaktoren in Paprika und N.

benthamiana

Nachdem das Gen-silencing von NbZF und NbRED in N. benthamiana keine Aussage zur Relevanz der Interaktion für die AvrBs3-abhängige Hypertrophie bzw. HR erlaubte, sollte die Agrobacterium-vermittelte Ko-Expression der GFP-Fusionsproteine und c-Myc4-AvrBs3 in ECW-30R-Paprikapflanzen erfolgen. Als Kontrollen dienten die Ko-Expression von GFP und c-Myc4 -GFP sowie die Ko-Expression von -GFP und c-Myc4-AvrBs3. Wie die Abbildung 22 A zeigt, war die durch AvrBs3-induzierte HR zwei bzw. drei Tage nach Ko-Expression von AvrBs3 und den

76 potentiellen Interaktoren SlZF, SlKH, CaNF-YC, CaRED, CaCIP6 und CaRF2b mit der durch Ko-Expression von AvrBs3 und GFP induzierten HR zu vergleichen. Lediglich die Negativkontrolle, die Ko-Expression von GFP und GFP, induzierte keine HR.

Da makroskopisch keine phänotypischen Unterschiede der nach Ko-Expression von AvrBs3 und den potentiellen Interaktoren induzierten HR zu beobachten waren, wurden qRT-PCR Analysen durchgeführt. Durch Amplifikation des Resistenzgens Bs3 mit genspezifischen Oligonukleotiden erfolgte die Ermittlung der Genexpression mittels qRT-PCR. Spezifische Oligonukleotide zur Amplifikation des konstitutiven Elongationsfaktors 1α (EF1α) dienten als Kontrolle für gleiche cDNA-Mengen. Die Induktion des Bs3-Transkripts nach Ko-Expression von AvrBs3 und GFP bzw. AvrBs3 und den potentiellen Interaktoren wurde mit der Negativkontrolle (GFP) verglichen. Wie die Abbildung 22 B zeigt, war im Vergleich mit der Ko-Expression von AvrBs3 und GFP keine signifikante Veränderung der Bs3-Transkriptmenge nach Ko-Expression von AvrBs3 und den potentiellen Interaktoren SlZF, SlKH, CaNF-YC, CaRED, CaCIP6 und CaRF2b zu beobachten. Lediglich nach Ko-Expression von AvrBs3 und SlZF konnte in drei unabhängigen Experimenten eine leichte Erhöhung der Bs3-Transkriptmenge beobachtet werden (Abbildung 22 B). Ob die Fähigkeit von AvrBs3 nach Ko-Expression mit den potentiellen Interaktoren zu einer erhöhten transkriptionellen Induktion eines Reportergens führt, sollte im Agrobacterium-vermittelten GUS-Assay in N. benthamiana analysiert werden. Als Reporterkonstrukt diente das in Kapitel 3.1 beschriebene GUS-Reporterkonstrukt UPA20-EBEAvrBs3. Nach Agrobacterium-vermitteltem Ko-Transfer von AvrBs3, dem Reporterkonstrukt und den potentiellen Interaktoren SlZF, SlKH, CaNF-YC, CaRED, CaCIP6 und CaRF2b in Blättern von N. benthamiana-Pflanzen erfolgte die Bestimmung der GUS-Aktivität, wobei die Aktivität von AvrBs3 nach Ko-Expression mit GFP auf 100 % gesetzt wurde. Wie die Abbildung 22 C zeigt, konnte nach der Ko-Expression von AvrBs3 und SlZF bzw. SlKH eine Erhöhung der GUS-Aktivität beobachtet werden, die jedoch nicht signifikant war. Nach der Ko-Expression von AvrBs3 und CaNF-YC, CaRED, CaCIP6 bzw. CaRF2b war die GUS-Aktivität vergleichbar mit der Ko-Expression von AvrBs3 und GFP. Die Negativkontrolle, der Ko-Expression von GFP und GFP, zeigte keine GUS-Aktivität.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine nicht signifikante, aber dennoch reproduzierbare Erhöhung des Bs3-Transkripts nach Ko-Expression von AvrBs3 mit SlZF und SlKH gezeigt werden konnte.

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Abbildung 22: Induktion von Bs3 und des GUS-Reportergens nach Ko-Expression AvrBs3 und potentiellen Interaktoren

(A) Analyse der Ausbildung der AvrBs3-abhängigen HR auf ECW-30R-Paprikapflanzen. Gezeigt ist die 2 bzw. 3 dpi nach Agrobacterium-vermittelter Ko-Expression von GFP und c-Myc4-GFP, sowie c-Myc4AvrBs3 und GFP, GFPSlZF, -SlKH, -CaRED, - CaNF-YC, -CaCIP6, bzw. –CaRF2b induzierten HR in Paprikapflanzen des Kultivars ECW-30R. Die Blätter wurden 2 bzw. 3 dpi geerntet und in Ethanol gebleicht. Das Experiment wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. (B) qRT-PCR-Analyse zur Analyse der Transkriptmenge von Bs3 der in (A) durch Agrobacterium-vermittelte Ko-Expression in Paprikapflanzen des Kultivars ECW-30R inokulierten Bereiche. 24 Stunden nach Inokulation wurde Blattmaterial geerntet, RNA isoliert, cDNA synthetisiert und anschließend die Mengen von Bs3 durch eine qRT-PCR-Reaktion analysiert. Die n-fache Induktion der Transkriptmenge von Bs3 nach Agrobacterium-vermittelten Ko-Expression von c-Myc4AvrBs3 und GFP, GFP-SlZF, -SlKH, -CaRED, - CaNF-YC, -CaCIP6, bzw. –CaRF2b wurde mit der Ko-Expression von GFP und c-Myc4-GFP verglichen. Fehlerbalken kennzeichnen die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. (C) UPA20-EBEAvrBs3-vermittelte Reportergenaktivierung durch AvrBs3 nach Ko-Expression mit GFP, GFP-SlZF, -SlKH, -CaRED, -CaNF-YC, -CaCIP6, bzw. –CaRF2b. Als Negativkontrolle diente die Ko-Expression von GFP und c-Myc4-GFP. GUS-Aktivität wurde 3 Tage nach Agrobacterium-vermitteltem Ko-Transfer des Reporterkonstrukts, und gfp bzw. avrBs3 und den potentiellen Interaktoren bestimmt. Die Aktivität von c-Myc4-AvrBs3 mit GFP und wurde auf 100 % gesetzt. Fehlerbalken kennzeichnen die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. Das Experiment wurde dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

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