C Ergebnisse
2 Lokalisation und Regulation der Dam-MTase
3.4 Biochemische Untersuchungen der Interaktionspartner
Ergebnisse 114
b. 20:Identifikation der Interaktionspartner durch massenspektrometrische Analysen. n.i.: nicht idenfiziert
Interaktionspartner identifiziert durch far western und massenspektrometrische Analysen
mittels Nano-HPLC/Nano-ESI MS. In Tab. 20 sind die identifizierten Proteine mit ihrem Molekulargewicht und den Gennamen aufgelistet. Die Spots 5, 11, 16 und 17 konnten nicht identifiziert werden.
Ta
Spot MALDI-TOF MS und/oder
ESI Gen Protein (Swiss-Prot) Molekulargewicht [kDa]
1; 2 MALDI-TOF und ESI tuf A Elongationsfaktor Tu (P02990) 44 3 MALDI-TOF und ESI pykF Pyruvat-Kinase (P14178) 51.4 4 MALDI-TOF und ESI atpA ATP-Synthase (P00822) 55.9 6 MALDI-TOF und ESI glyA Serin-Hydroxymethyltransferase
(P00477) 46
7 ESI galE UDP-Galactose-4-Epimerase
(P09147) 37.9
8 ESI gatY Tagatose-Biphosphat-Aldolase
(P37192) 31.5
9 ESI udp Uridin-Phosphorylase
(P12758) 27.8
10 ESI fbaA Fructose-Biphosphat-Aldolase
(P11604) 39.8
12;13 ESI eno Enolase (P08324) 46.3
14 ESI pgk Phosphoglycerat-Kinase
(P11665) 41.8
15 ESI deoB Phosphopentomutase/Desoxyribouratase
(P07651) 45.1
5;11;16;
MALDI- nd ESI
17 TOF u n.i. n.i. n.i.
Ergebnisse 115 Plasmide, die als positiv identifiziert und sequenziert wurden, wurden in HMS 174 (DE3) Zellen transformiert und in kleinem Volumen induziert. Konnte das Protein induziert werden wurde das Protein in großem Maßstab aufgereinigt, gelelektrophoretisch analysiert und die Konzentration bestimmt (siehe Tab. 21). Anschließend wurde ein mit den aufgereinigten GST-Proteinen und der Dam-MTase, welche einen His-Tag trägt) ein Interaktionsassay durchgeführt. Dazu wurden die GST-Proteine an die Glutathion-Sepharose gebunden. Nach Entfernen der ungebundenen Proteine durch mehrmaliges Waschen mit einem Puffer mit 100 mM NaCl wurde die Dam-MTase zu gegeben. Diese konnte dann mit dem GST-Protein, welches an der Glutathio-Sepharose gebunden ist, interagieren. Nachfolgend wurde wieder gewaschen, um ungebundene Dam-MTase zu entfernen. Anschließend wurde die Glutathion-Sepharose mit den daran gebundenen Interaktionspartnern auf einem SDS-Gel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Hinterher wurde die die Dam-MTase mittels Westernblot mit anti-His AK als erstem AK detektiert. Hat die Dam-MTase mit dem GST-Protein interagiert, sollte sie als Bande zu detektieren sein. Um zu überprüfen, in welchem Maße die Dam-MTase selbst an die Glutathion-Sepharose gebunden hat, wurde das Experiment ohne die Zugabe des GST-Proteins durchgeführt. Als Ladekontrolle wurde auf das Gel 25 pmol Dam-MTase mit aufgetragen. Als Negativkontrolle wurde das Experiment mit dem GST-Tag alleine durchgeführt. Damit konnte ausgeschlossen werden, dass die Interaktion durch den GST-Tag vermittelt wird. Als weitere Kontrolle wurden die GST-Proteine nach Bindung an die Glutathionsepharose gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nitrcellulosemembran geblottet und mittels des anti-His AK detektiert. Somit konnte ausgechlossen werden, dass die GST-Proteine mit dem anti-His AK detektiert wurden.
Ergebnisse 116
b. 21:Zusammenfassung der biochemischen Schritte sitiv enziert
Gelungene Proteininduktion
Protein aufgereingt Ta
Gen Amplifikation Positiv identifiziert
Po sequ
tufA + + + + +
pykF + + + + +
atpA + + + + +
glyA + + + + +
galE + + + + +
gatY + + + + -
Udp + + + + +
fbaA + + + + +
Eno + + + + +
Pgk + + + + +
deoB + + + + +
mutH + + + + -
holA + + + + -
holB + + + + -
holC + + + + -
holD + + + + -
holE + + + + -
dnaQ + + + + -
dnaN + - - - -
dnaE + - - - -
dnaX + + ? - -
polA + - - - -
ligA + - - - -
ligB + + ? - -
mutS + - - - -
ie Gene mutS, ligA, polA, dnaE und dnaN konnten aus dem E.coli K12 Genom D
amplifiziert werden, bis jetzt konnte allerdings noch kein Klon als positiv identifiziert werden. Das Gen für dnaX und ligB konnte amplifiziert werden und es wurden auch positive Klone gefunden, aber eine bestätigende Sequenzierung steht noch aus. Die Gene für dnaQ, mutH, holA-E konnten in den Vektor kloniert, als positiv identifziert und sequenziert werden und eine Induktion der Proteinxpression war erfolgreich. Es fehlt noch die Aufreinigung dieser Proteine und die Durchführung des Interaktionsassays. Alle anderen Gene konnten kloniert werden und die Korrektheit der Sequenz wurde durch Sequenzierung bestätigt. Die Proteine für die diese Gene codieren wurden als GST-Fusionsproteine aufgereinigt (siehe B 6.3). Die einzige Ausnahme bestand in GatY, welches sich induzieren ließ, sich aber immer in inclusion bodies befand und sich deswegen nicht aufreinigen ließ. Der Interaktionsassay wurde mit den Kontrollen wie oben beschrieben für jeden Interaktionspartner drei bis fünf Mal wiederholt. Dabei zeigte sich, dass die GST-Proteine nicht durch den anti-His-Antikörper detektiert wurden. Bei der Durchführung des Interaktionsassays mit dem
Ergebnisse 117 GST Protein alleine zeigte sich, dass dieses keine Interaktion mit der Dam-MTase einging, wie in Abb. 28 zu sehen ist.
Glutathion-Sepharose
Dam-His GST
+ + +
+
-
- Interaktions-assay
Ladekontrolle
+ +
-Glutathion-Sepharose
Dam-His GST
+ + +
+
-
- Interaktions-assay
Ladekontrolle
+ +
-Glutathion-Sepharose
Dam-His GST
+ + +
+
-
- Interaktions-assay
Ladekontrolle
+ +
-Abb. 28:Interaktionsassay mit dem GST-Tag als Interaktionspartner der Dam-MTase
In Spur eins wurde die Glutathin-Sepharose aufgetragen, die mit der Dam-MTase inkubiert wurde ohne vorherige Inkubation mit dem GST-Protein. Es zeigt sich, dass die Dam-MTase in gewiessem Maße an die Glutathion-Sepharose bindet. In Spur zwei ist das Interaktionsexperiment mit dem GST-Tag aufgetragen. Es zeigt sich eine schwächere Bande als in Spur eins. Würde der GST-Tag alleine mit der Dam-Mtase interagieren, würde man hier eine Bande erwarten, deren Intensität die der Bande in Spur eins übersteigt. Da dies nicht der Fall ist, kann davon ausgegangen werden, dass der GST-Tag alleine mit der Dam-MTase interagiert. In Spur drei ist die Menge an MTase aufgetragen die in das Experiment eingesetzt wurde. Sie dient als Lade- und Laufkontrolle. In Abb. 29 ist exemplarisch die Interaktion des Proteins GlyA mit der Dam-MTase dargestellt.
Ergebnisse 118
Glutathion-Sepharose
Dam-His GST-GlyA
+ + +
+
-
- Interaktions-assay
Ladekontrolle
+ +
-Glutathion-Sepharose
Dam-His GST-GlyA
+ + +
+
-
- Interaktions-assay
Ladekontrolle
+ +
-Glutathion-Sepharose
Dam-His GST-GlyA
+ + +
+
-
- Interaktions-assay
Ladekontrolle
+ +
-Abb. 29:Interaktionsassay mit der Serin-Hydroxymethyltransferase als Interaktionspartner der Dam-MTase
In Spur eins sieht man eine leichte Bande, was die Hintergrundbindung der Dam-MTase an die Glutathionsepharose darstellt (s.o.). In Spur zwei ist das Interaktionsexperiment aufgetragen. Man sieht eine dicke Bande, die durch den anti-His AK detektiert wurde. Da die Intensität dieser Bande die Bande in Spur eins übersteigt, kann man schlussfolgern, dass die Dam-MTase mit der Serin-Hydroxymethyltraferase interagiert. In Spur drei sieht man die Ladekontrolle von 25 pmol Dam-MTase. In Tab. 22 sind die Ergebnisse der bis jetzt durchgeführten Inteaktionsexperimente dargestellt. Die Experimente wurden drei bis fünf Mal wiederholt. Wie oben erwähnt konnte GatY nicht aufgereingt werden, demzufolge konnte auch das Interaktionsexperiment nicht durchgeführt werden. Für GalE und Pgk zeigte sich kein einheitliches Bild in den Interaktionsassays. Sie wurden demzufolge so bewertet, dass sie keine Interaktionspartner der Dam-MTase darstellen. Für die anderen untersuchten Proteine konnte die Interaktion, die sich im far western Experiment zeigte, verifiziert werden.
Ergebnisse 119
Tab. 22:Zusammenfassung der Ergebnisse der Interaktionsexperimente. n.i.: nicht identiziert
Interaktionspartner identifiziert durch far western und Massspekrometrische Analysen
Spot MALDI-TOF MS
and/or ESI Gen Protein (Swiss-Prot) Molecular Weight [kDa]
Interaktion verifiziertdurch
pullldown experimente
(3-5 Mal)
1; 2 MALDI-TOF and ESI tuf A; tufB Elongationsfaktor Tu (P02990) 44 ja 3 MALDI-TOF and ESI pykF Pyruvat-Kinase (P14178) 51.4 ja 4 MALDI-TOF and ESI atpA ATP-Synthase (P00822) 55.9 ja 6 MALDI-TOF and ESI glyA Serin-Hydroxymethyltransferase
(P00477) 46 ja
7 ESI galE UDP-Galactose-4-Epimerase
(P09147) 37.9 nein
8 ESI gatY Tagatose-Biphosphat-Aldolase
(P37192) 31.5 n.i.
9 ESI udp Uridin-Phosphorylase
(P12758) 27.8 ja
10 ESI fbaA Fructose-Biphosphat-Aldolase
(P11604) 39.8 ja
12;13 ESI eno Enolase (P08324) 46.3 ja
14 ESI pgk Phosphoglycerat-Kinase
(P11665) 41.8 nein
15 ESI deoB
Phosphopentomutase/Desoxyribou ratase
(P07651)
45.1 nein 5;11;
16;17 MALDI-TOF and ESI n.i. n.i. n.i. n.i.
Diskussion 120