Aufreinigung des Dam-Methyltransferase WT Proteins, des Dam Mutante Proteins und des DamGFP-Fusionsproteins

6.1.1 Verwendete Puffer

1 x STE: 10 mM NaCl, 1 mM Tris/HCl pH 8.0, 10 µM EDTA

Aufschlusspuffer: 20 mM HEPES, 0.1 mM DTT, 500 mM NaCl, 10 % (v/v) Glycerin, 20 mM Imidazol, pH 8.0

Elutionspuffer: 20 mM HEPES, 0.1 mM DTT, 500 mM NaCl, 10 % (v/v) Glycerin, 200 mM Imidazol, pH 8.0

Dialysepuffer I: 20 mM HEPES, 0.1 mM DTT, 1 mM EDTA, 300 mM NaCl, 10 % (v/v) Glycerin

Dialysepuffer II: 20 mM HEPES, 0.1 mM DTT, 1 mM EDTA, 300 mM NaCl, 70 % (v/v) Glycerin

Materialien und Methoden 28

6.1.2 Proteinexpression

Als Expressionsstamm diente der E.coli Stamm HMS 174 (DE3) (siehe 2.1.1).

Vorkultur

Um das gewünschte Protein expremieren zu können wurde das entsprechende Plasmid mittels der Hitzeschocktransformation in Hitzeschocktransformation-kompetente HMS174 (DE3) Zellen transformiert (siehe 4). Die transformierten Zellen wurden auf eine LB-Agarplatte mit entsprechendem Antibiotikum (AB) ausplattiert und über Nacht (ü/N) bei 37°C inkubiert (siehe 3.3.1). Am nächsten Tag wurde mit einem Klon dieser Platte eine 50 ml LB-Vorkultur (VK) mit den entsprechenden AB angeimpft und ü/N bei 37°C inkubiert (siehe 3.3.1).

Hauptkultur

Zwei Erlenmeyer Kolben mit je 500 ml LB-Medium und entsprechenden AB wurden mit je 10 ml der VK angeimpft und bei 37°C inkubiert (siehe 3.3.1) bis die Zelldichte eine OD600 von 0.7 erreicht hat. Zu diesem Zeitpunkt wurden ca. 1.5 ml der Kultur entnommen, zentrifugiert und das Pellet bei -20°C eingefroren. Diese Probe diente als Referenz für die Induktion des gewünschten Proteins

Induktion

Der Start der Produktion des gewünschten Proteins erfolgte durch Zugabe von 1 mM IPTG. Die Kultur wurde weitere zwei Stunden inkubiert. Danach wurden ca. 800 µl der Kultur entnommen, zentrifugiert und das Pellet bei -20°C eingefroren. Diese Probe diente zur Überprüfung der Induktion des gewünschten Proteins.

Ernte der Zellen

Nach zwei Stunden Induktion wurden die Zellen wurden 15 min bei 4200 rpm und 4°C zentrifugiert (Beckman, J6-HC, Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland), die so gewonnenen Zellpellets in 1 x STE-Puffer aufgenommen, vereinigt und erneut zentrifugiert. Das so entstandene Zellpellet kann bei -20°C gelagert werden.

Um zu überprüfen, ob die Expression des Proteins induziert wurde, wurden die Proben, die vor und nach der Induktion entnommen wurden mit Lämmli-Auftragspuffer versetzt und zehn min bei 95°C erhitzt. Anschließend wurden sie mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nach Lämmli analysiert (siehe 7.2 und 7.3).

Materialien und Methoden 29

6.1.3 Herstellung des Ganzzellysates

Für die Herstellung des Ganzzellysates wurde das Pellet aus einem Liter Bakterienkultur auf Eis aufgetaut und 30 ml gekühlter Auschlußpuffer zugegeben. Der Zellaufschluß erfolgte unter Eiskühlung mittels Ultraschall für insgesamt 10 min (20 x 15 s mit je 15 s Pause dazwischen). Um eine Überhitzung der Probe zu vermeiden wurde die Probe in den Pausen geschwenkt. Das Gerät (Sonifier 250, Branson, Danburry, USA) hatte dabei folgende Einstellungen: Timer: hold, Duty cycle: 50 %, Output control: zwischen 5 und 6. Um nach dem Aufbruch der Zellen die entstandenen Zelltrümmer von den löslichen Bestandteilen zu entfernen wurde die Probe 75 min bei 20 000 rpm und 4°C zentrigugiert (Beckman J2-HS). Der Überstand mit den löslichen Proteinen wurde bis zur weiteren Aufreinigung auf Eis gekühlt.

6.1.4 Affinitätschromatographie im „Batch“-Verfahren

Alle Schritte der Affinitätschromatographie erfolgten bei 4°C im Kühllabor.

6.1.4.1 Äquilibrierung der Ni-NTA-Agarose

Für die Aufreinigung der WT Dam-Methyltransferase, der Dam-Methyltransferase Mutante und des DamGFP-Fusionsproteins wurden 1500 µl (QIAGEN GmbH) in ein 50 ml „Greiner“-Reaktionsgefäß gegeben und mit 45 ml Aufschlusspuffer versetzt. Das Gemisch wurde 15 min auf einem Rolltisch bei 4°C inkubiert und anschließend 5 min bei 1000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen.

6.1.4.2 Aufreinigung des gewünschten Proteins

Der Überstand mit den löslichen Proteinen (siehe 6.1.3) wurde zu der äquilibrierten Ni-NTA-Agarose (siehe 6.1.4.1) in das „Greiner“-Reaktionsgefäß gegeben. Das Gemisch wurde für eine Stunde auf einem Rolltisch bei 4°C inkubiert. Bei diesem Schritt bindet das gewünschte Protein mit dem His-Tag an die Ni-NTA-Agarose.

Anschließen wurde die Ni-NTA-Agarose mit dem gebundenen Protein abzentrifugiert (5 min, 1000 rpm, 4°C und der Überstand mit den ungebundenen Proteinen entfernt.

Um noch ungebundenes Proteine von der Ni-NTA-Agarose zu entfernen erfolgten drei Waschschritte, bei denen die Ni-NTA-Agarose mit jeweils 40 ml Aufschlusspuffer

Materialien und Methoden 30 gewaschen und anschließend wieder abzentrifugiert wurde. Nach dem letzten Waschschritt wurde die Ni-NTA-Agarose mit dem gebundenen Protein auf eine Säule (Econon-Colum, ∅=12 mm, Bio-Rad Laboratories GmbH) gegeben und eine Stunde bei geschlossener Säule inkubiert, damit sich die Ni-NTA-Agarose absetzen kann.

Anschließend wurde die Ni-NTA-Agarose nochmals mit fünf ml Aufschlusspuffer gewaschen. Die Elution des Proteins mit His-Tag von der Ni-NTA-Agarose erfolgte mit sieben ml Elutionspuffer durch das Sammeln von ein ml Fraktionen. Von jeder Fraktion wurden anschließend fünf µl auf ein Whatman-Filterpapier getropft und mit Coomassie-Lösung angefärbt. Die Fraktionen mit ungefähr gleicher Proteinmenge wurden zusammengeführt.

6.1.5 Dialyse des Proteins

Um das Imidazol aus dem Puffer zu entfernen wurde das Protein für zwei Stunden gegen 500 ml Dialysepuffer I dialysiert. Für eine Lagerung des Proteins bei -20°C bedurfte es einer Glycerinkonzentration von 70 % (v/v). Um diese Glycerinkonzentration in der Probe zu erreichen wurde die Probe ü/N gegen 500 ml Dialysepuffer II dialysiert.

Die Überprüfung der Reinheit des Proteins erfolgte mittels der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nach Lämmli.

6.1.6 Bestimmung der Proteinkonzentration 6.1.6.1 Spektrophotometer

Die Bestimmung der Proteinkonzentration nach der Dialyse II erfolgte mittels der Messung der Extinktion der Proteinprobe bei 280 nm in einem Spectralphotometer (U-3000-Spektralphotometer, Hitachi, Tokio, Japan). Dazu wurde die Probe mit 1 x Methylierungspuffer (20 mM HEPES, 1 mM EDTA) und 500 mM NaCl entsprechend verdünnt, in eine Quarzmikroküvette (Fa. Hellma GmbH % Co KG, Müllheim, Deutschland; d=1 cm) pipettiert und die Extinktion bei 280 nm gemessen. Mit Hilfe dieser Extinktion (E) und der Schichtdicke d der Küvette lässt sich die Konzentration nach dem Lambert-Beerschen Gesetz (E=c x d x ε) berechnen. Der molekulare Extinktionskoeffizient ε der einzelnen Proteine lässt sich durch die Anzahl der Tyrosin-

Materialien und Methoden 31 und Tryptophanreste und die Anzahl an Disulfidbrücken in dem Protein abschätzen (Pace et al, 1995):

ε^280nm [M^-1cm^-1]=nTrp x 5500 + nTyr x 1490 + (nCys-S-S-Cys)¹²⁵ nTrp = Anzahl der Tryptophanreste im Protein

nTyr = Anzahl der Tyrosinreste im Protein

nCys-S-S-Cys = Anzahl der Disulfidbrücken im Protein.

ε^280nm für die WT Dam-Methyltransferase und die Dam-Methyltransferase Mutante:

39935 M^-1cm^-1

ε^280nm für das DamGFP-Fusionsprotein und das Dam(APPY)GFP-Fusionsprotein: 56100 M^-1cm^-1

6.1.6.2 Bradford-Test Bradfordreagenz

100 mg Coomassie Brilliant Blau G-250 wurden in 50 ml 95 % Ethanol gelöst. Diesem Gemisch wurden 100 ml Phosphorsäure (85% (w/v)) zugegeben. Mit Reinstwasser wurde das Volumen auf einen Liter aufgefüllt. Die Lösung wurde anschließend durch einen Whatman #1 Filter filtriert. Das Reagenz wurde bei 4°C gelagert.

Eichreihe

Für die Eichreihe wurde zunächst eine 10 µg/µl BSA-Stammlösung (MBI Fermentas GmbH) 1:10 mit sterilem Reinstwasser verdünnt. Von dieser Verdünnung wurden fünf, drei, 2.5, zwei, 1.5, ein, 0.5 und 0 µl in Parallele in eine 96-well-Mikrotiterplatte pipettiert und mit sterilem Reinstwasser auf 100 µl aufgefüllt. Anschließend wurde in jedes well 100 µl Bradfordreagenz gegeben und die Mikrotiterplatte 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.

Die Messung der colorimetrischen Reaktion erfolgte in einem ELISA-Reader (Dynatech MR500, Dynatech) bei 570 nm.

Bestimmung der Proteinkonzentration

Von der zu messenden Proteinlösung wurden ein, drei und fünf µl in Parallele in eine 96-well-Mikrotiterplatte pipettiert. Anschließend wurde mit den Proben genauso verfahren, wie mit den Proben für die Eichreihe.

Materialien und Methoden 32 Die Proteinkonzentration der Proteinlösung konnte mit Hilfe der Eichgeraden ermittelt werden.

6.2 Aufreinigung des Restriktionsenzymes R.EcoRV