2. EKSPERIMENTAALNE OSA

2.4 Arutelu

Sugulisel teel levivatest infektsioonidest on tänapäeval kõige sagedasemad HPV nakkused.

Tihtipeale suudab inimese organismi immuunsüsteem infektsiooniga ise hakkama saada, kuid esineb ka HPV tüüpe, mis on põhjuseks emakakaela vähi ja teiste anogenitaal- ja suu kartsinoomide tekkele (McLaughlin-Drubin, 2015). Seepärast on HPV infektsioonitsükli uurimine väga tähtis taoliste kasvajate ravimeetodite väljatöötamisel.

Seoses sellega, et HPV poolt kodeeritud E1 ja E2 valgud on ainukesed viiruse replikatsiooniks absoluutselt vajalikud viirusvalgud, on nende uurimine vajalik HPV replikatsiooni inhibeerivate ravimite väljatöötamiseks. Enamasti toimub tänapäeval viiruse replikatsiooni tuvastamine SB ja PCR meetodeid kasutades. Need on aga väga kallid, töö- ja ajamahukad uurimismetoodikad.

Hiljuti on Tartu Ülikooli Tehnoloogiainstituudi viroloogia laboris välja töötatud ja kirjeldatud modifitseeritud HPV5, HPV11, HPV16 ja HPV18 genoomid mis sisaldavad Renilla lutsiferaasi (RLuc) kodeerivat järjestust (Toots 2017). On näidatud, et RLuc aktiivsus korreleerub HPV genoomi koopiaarvuga ning seega võib HPV replikatsiooni taset esitada RLuc aktiivsuse kaudu. Samas on HPV elutsükli uurimises RLuc efektiivse kasutamise põhilisteks takistusteks RLuc kodeeriva järjestuse pikkus (ta suurendab HPV genoomi 936 nt võrra) ning ATPst sõltuvus. Lisaks sellele takistab RLuc-i suhteliselt madal aktiivsus selle kasutamist ravimikandidaatide skriiningutes, mis teostatakse kasutades võimalikult vähe rakke ja söödet. Nende probleemide lahenduseks otsustasime kasutada uudset luminestsentset valku – NanoLuc (NLuc), mis omab Renilla lutsiferaasi ees hulga eeliseid, nagu väiksem suurus (172 versus 312 aminohapet), kõrgem stabiilsus ning umbes 100 korda suurem aktiivsus.

Minu töö eesmärgiks oli kloneerida NLuc geen HPV5 ja HPV11 E2 valgu avatud lugemisraami ning uurida valmis uute genoomide replikatsioonivõimet U2OS rakuliinis.

Valmistatud genoomide replikatsiooni efektiivsused erinesid viiruse metsiktüve genoomidest.

HPV5Nluc replikatsioon toimus efektiivsemalt kui metsiktüve oma ning HPV11Nluc puhul olid replikatsiooni signaalid nõrgemad. Selle tulemuse üheks võimalikuks põhjuseks võib olla NLuc geeni sisse viimisega seotud muutused viiruse transkriptide mustris või tasemes.

Näiteks on teada, et täispikk E2 valk on transkriptsiooniline aktivaator, aga alternatiivse

splaissingu tulemusena ekspreseeritud E8^E2 on tugev transkriptsiooniline repressor.

Täispika E2 ja N-terminaalselt trunkeeritud E8^E2 valkude bilanss mõjutab viiruse geenide ekspressiooni ning replikatsiooni taset. On võimalik, et mõlema viiruse tüübi puhul sisestatud geen, kas soodustas või surus maha teatud splaissingu produkte, mis omakorda muutis replikatsiooni efektiivsust.

Lisaks sellele uuriti HPV5NLuc puhul NLuc aktiivsuse ja replikatsiooni signaalide korrelatsiooni. Tulemuseks saadi statistiliselt oluline lineaarne seos nende kahe vahel.

Sarnane tulemus oli saadud kasutades HPV18NLuc genoomi U2OS rakkudes (Piirsoo et al., 2019). Saadud tulemus viitab sellele, et NLuc aktiivsus representeerib HPV genoomi koopia arvu ning võib olla kasutatud HPV genoomi replikatsiooni efektiivsuse kvantitatiivseks uurimiseks U2OS rakkudes.

HPV5Nluc ja HPV11Nluc konstruktide valmistamine annab võimaluse kasutada neid erinevates HPV replikatsiooni uurivates projektides. Uute genoomide olulisemateks eelisteks on ajaline ja materiaalne võit. Nimelt võtab NLuc aktiivsuse mõõtmine umbes 30 minutit, aga HPV genoomi analüüs SB meetodiga kestab umbes 4 – 5 päeva. Kuna NLuc omab suurt aktiivsust, siis on signaalide tuvastamiseks vaja väikest hulka HPVNLuc-positiivseid rakke, mis võimaldab kasutada 96 või 384 kaevuga plaate totaalse DNA eraldamiseks ning analüüsiks SB-i meetodiga kasutatakse vähemalt 15 korda rohkem rakke. Lisaks sellele, oleme näidanud et NLuc sisaldavad HPV genoome võib efektiivselt kasutada ka inimese primaarsetes keratinotsüütides, mis on HPVdele loomulikud peremeesrakkud (Piirsoo et al., 2019).

KOKKUVÕTE

Inimese papilloomiviirused on nahka- ja limaskesti nakatavad viirused. Nende replikatsiooni uurimiseks kasutatakse peamiselt SB ja PCR meetodeid, mis on väga aeganõudvad, kallid ja suuremahulised. HPV replikatsiooni protsessi uurimise kiirendamiseks otsustati kasutada bioluminestsentsi ja selleks kloneeriti bioluminestsentsuse geen NLuc kahte HPV genoomi.

Bakalaureusetöö raames valmistati HPV5NLuc ja HPV11NLuc konstruktid. Nende replikatsioonivõimet uuriti U2OS rakuliinis ja tehti järgmised järeldused:

• Valmistatud konstruktid on võimelised replitseeruma U2OS rakuliinis

• HPV5NLuc genoom replitseerub paremini võrreldes metsiktüvega

• HPV11NLuc genoomi replikatsiooni signaalid on metsiktüvega võrreldes veidi madalamad

• HPV5NLuc lutsiferaasi signaalid korreleeruvad hästi replikatsiooni signaalidega

• NLuc geeni sisaldavaid genoome on võimalik kasutada HPV replikatsiooni uurimiseks

Generation of human papillomavirus type-5 and type-11 Nano-luciferase containing genomes and analysis of their replication ability

Elina Lototskaja Summary

Human papillomaviruses (HPVs) are double-stranded DNA viruses that infect both epithelial and mucosal basal keratinocytes and their life cycle strictly depends on epithelial differentiation program. HPV are spread through direct contact with infected mucosa and skin. The virus usually stays in the human body in latent form. However, low-risk HPV types may cause benign tumours such as warts, papillomas, and other epithelial hyperplasias, while high-risk types may cause malignant tumours. The most prevalent carcinoma caused by HPV is cervical cancer. Also, different types of HPVs might cause cancers in head, neck, skin, and anogenital regions. Despite the prevalence of HPV infections, no specific treatment has been worked out so far, since epithelial differentiation-dependent viral life cycle renders laboratory research problematic and challenging.

Research on the HPV replication plays critical role in the study of the virus’ life cycle.

Southern blot and PCR are most common techniques used in the laboratories for the analysis of viral genome replication. However, these methods are expensive and time consuming. This issue can be resolved by using bioluminescence markers for a fast, sensitive and cost-effective analysis of viral replication.

The objectives of this thesis are (1) to clone codon optimized NLuc and FMDV-2A gene sequencies into HPV5 and HPV11 E2 open reading frames immediately after E1 stop codon (2) to analyse the replication efficiency and NLuc activity of the generated constructs in the U2OS cell line, and (3) to evaluate the correlation between the replication signals and NLuc activity.

The obtained results revealed that the novel HPV5NLuc and HPV11NLuc genomes were functional and able to replicate in U2OS cells. However, their replication efficiency differed from that of the respective wild type genomes. Compared to the wild type genomes, the HPV5NLuc replicated more effectively, whereas replication competence of HPV11NLuc was slightly reduced. The possible reasons of the observed phenomenon might lie in the

alterations of the virus’s transcript pattern or protein expression levels caused by the insertion of the NLuc gene.

Also, statistically significant correlation between HPV5NLuc replication level and NLuc activity was observed. These results indicate that NLuc activity represents the HPV genome copy number and might be used for quantitative evaluation of HPV genome replication efficiency in the U2OS cells.

Generation of the novel HPV5NLuc and HPV11NLuc constructs allows using them in various HPV replication research projects. The main advantages of the created genomes are their high sensitivity as well as time- and cost-efficiency. Moreover, we have demonstrated that HPV genomes containing NLuc can be effectively used in human primary keratinocytes that are natural host cells for HPVs (Piirsoo et al., 2019).

TÄNUSÕNAD

Soovin avaldada tänu minu juhendajale Alla Piirsoole tema abi, nõu, aja ja kannatlikkuse eest lõputöö kirjutamisel. Lisaks sellele on ta õpetanud mulle erinevaid laboris kasutatavaid meetodeid, andnud väärtuslikke nõuandeid ning aidanud katsete läbiviimisel. Samuti soovin tänada Marko Piirsood minu töö vormistamisel abi ja nõu eest ning tänada labori assistenti Regina Pipitšit tema juhendamise ja seletuste eest laboritöös.

KASUTATUD KIRJANDUS Kirjanduse loetelu

Aksoy, P., Gottschalk, E. and Meneses, P. (2017). HPV entry into cells. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 772, pp.13–22.

Atkins, P. ja Jones, L. 2008. Keemia alused. Teekond teadmiste juurde. Neljas väljaanne. p.

773–774. W.H. Freeman & Co, Basingstoke, New York.

Bergvall, M., Melendy, T. and Archambault, J. (2013). The E1 proteins. Virology, 445(1-2), pp.35–56.

Bodily, J., Hennigan, C., Wrobel, G. and Rodriguez, C. (2013). Regulation of the human papillomavirus type 16 late promoter by E7 and the cell cycle. Virology, 443(1), pp.11–19.

Buck, C., Thompson, C., Pang, Y., Lowy, D. and Schiller, J. (2005). Maturation of Papillomavirus Capsids. Journal of Virology, 79(5), pp.2839–2846.

Buck, C., Day, P. and Trus, B. (2013). The papillomavirus major capsid protein L1. Virology, 213, pp.169–174.

Conway, M., Alam, S., Christensen, N. and Meyers, C. (2009). Overlapping and independent structural roles for human papillomavirus type 16 L2 conserved cysteines. Virology, 393(2), pp.295–303.

Darshan, M., Lucchi, J., Harding, E. and Moroianu, J. (2004). The L2 Minor Capsid Protein of Human Papillomavirus Type 16 Interacts with a Network of Nuclear Import Receptors. Journal of Virology, 78(22), pp.12179–12188.

Doorbar, J. (2006). Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer. Clinical Science, 110(5), pp.525-541.

Doorbar, J., Quint, W., Banks, L., Bravo, I., Stoler, M., Broker, T. and Stanley, M. (2012).

The Biology and Life-Cycle of Human Papillomaviruses. Vaccine, 30, pp.55–70.

Doorbar, J. (2013). The E4 protein; structure, function and patterns of expression. Virology, 445(1-2), pp.80–98.

DiMaio, D. and Petti, L. (2013). The E5 proteins. Virology, 445(1-2), pp.99–114.

England, C., Ehlerding, E. and Cai, W. (2016). NanoLuc: A Small Luciferase Is Brightening Up the Field of Bioluminescence. Bioconjugate Chemistry, 27(5), pp.1175–1187.

Fisher, C. (2015). Recent Insights into the Control of Human Papillomavirus (HPV) Genome Stability, Loss, and Degradation. Journal of Clinical Medicine, 4(2), pp.204–230.

García-Vallvé, S., Alonso, Á. and Bravo, I. (2005). Papillomaviruses: different genes have different histories. Trends in Microbiology, 13(11), pp.514–521.

Graham, S. (2010). Human papillomavirus: gene expression, regulation and prospects for novel diagnostic methods and antiviral therapies. Future Microbiology, 5(10), pp.1493–1506.

Graham, S. (2016). Human Papillomavirus E2 Protein: Linking Replication, Transcription, and RNA Processing. Journal of Virology, 90(19), pp.8384–8388.

Guimerà, N., Lloveras, B., Alemany, L., Iljazovic, E., Shin, H., Jung-Il, S., de Sanjose, S., Jenkins, D., Bosch, F. and Quint, W. (2013). Laser capture microdissection shows HPV11 as both a causal and a coincidental infection in cervical cancer specimens with multiple HPV types. Histopathology, 63(2), pp.287–292.

Hall, M., Unch, J., Binkowski, B., Valley, M., Butler, B., Wood, M., Otto, P., Zimmerman, K., Vidugiris, G., Machleidt, T., Robers, M., Benink, H., Eggers, C., Slater, M., Meisenheimer, P., Klaubert, D., Fan, F., Encell, L. and Wood, K. (2012). Engineered Luciferase Reporter from a Deep Sea Shrimp Utilizing a Novel Imidazopyrazinone Substrate. ACS Chemical Biology, 7(11), pp.1848–1857.

Harari, A., Chen, Z. and Burk, R. (2013). Human papillomavirus genomics: past, present and future. Curr Probl Dermatol., 45, pp.1–18.

Hoppe-Seyler, K., Bossler, F., Braun, J., Herrmann, A. and Hoppe-Seyler, F. (2018). The HPV E6/E7 Oncogenes: Key Factors for Viral Carcinogenesis and Therapeutic Targets. Trends in Microbiology, 26(2), pp.158–168.

Kadaja, M., Silla, T., Ustav, E. and Ustav, M. (2009). Papillomavirus DNA replication — From initiation to genomic instability. Virology, 384(2), pp.360–368.

Kalinska-Bienias, A., Kalowska, M., Kwiek, B., Jakubowska, B., Ishii, N., Hashimoto, T., Kowalewski, C. and Wozniak, K. (2016). Efficacy and safety of perilesional/intralesional triamcinolone injections in oral mucous membrane pemphigoid. British Journal of Dermatology, 174(2), pp.436–438.

Klozar, J., Tachezy, R., Rotnáglová, E., Košlabová, E., Saláková, M. and Hamšíková, E.

(2010). Human papillomavirus in head and neck tumors: epidemiological, molecular and clinical aspects. Wiener Medizinische Wochenschrift, 160(11-12), pp.305–309.

Klumpp, D. and Laimins, L. (1999). Differentiation-Induced Changes in Promoter Usage for Transcripts Encoding the Human Papillomavirus Type 31 Replication Protein E1. Virology, 257(1), pp.239–246.

Lazarczyk, M., Cassonnet, P., Pons, C., Jacob, Y. and Favre, M. (2009). The EVER Proteins as a Natural Barrier against Papillomaviruses: a New Insight into the Pathogenesis of Human Papillomavirus Infections. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 73(2), pp.348–370.

McBride, A. (2008). Replication and partitioning of papillomavirus genomes. Adv Virus Res, 72, pp.155–205.

McBride, A. (2013). The Papillomavirus E2 proteins. Virology, 445(1-2), pp.57–79.

McBride, A. (2017). Oncogenic human papillomaviruses. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci., 372.

Nguyen, H., Ramírez-Fort, M. and Rady, P. (2014). The biology of human papillomaviruses. Curr Probl Dermatol, 45, pp.19–32.

Orth, G. (2006). Genetics of epidermodysplasia verruciformis: Insights into host defense against papillomaviruses. Seminars in Immunology, 18(6), pp.362–374.

Pang, C. and Thierry, F. (2013). Human papillomavirus proteins as prospective therapeutic targets. Microbial Pathogenesis, 58, pp.55–65.

Piirsoo, A., Piirsoo, M., Kala, M., Sankovski, E., Lototskaja, E., Levin, V. and Ustav, M.

(2019). Activity of CK2α protein kinase is required for efficient replication of some HPV types. PLOS Pathogens, 15(5), p.e1007788.

Rocha-Zavaleta, L., Ambrosio, J., Mora-Garcia, M., Cruz-Talonia, F., Hernandez-Montes, J., Weiss-Steider, B., Ortiz-Navarrete, V. and Monroy-Garcia, A. (2004). Detection of antibodies against a human papillomavirus (HPV) type 16 peptide that differentiate high-risk from low-risk HPV-associated low-grade squamous intraepithelial lesions. Journal of General Virology, 85(9), pp.2643–2650.

Pinidis, P., Tsikouras, P., Iatrakis, G., Zervoudis, S., Koukouli, Z., Bothou, A., Galazios, G.

and Vladareanu, S. (2016). Human Papilloma Virus' Life Cycle and Carcinogenesis. MAEDICA – a Journal of Clinical Medicine, 11(5), pp.48–54.

Rubin, M., Kleter, B., Zhou, M., Ayala, G., Cubilla, A., Quint, W. and Pirog, E. (2001).

Detection and Typing of Human Papillomavirus DNA in Penile Carcinoma. The American Journal of Pathology, 159(4), pp.1211–1218.

Shruti, S., Siraj, F., Singh, A. and Ramesh, V. (2017). Epidermodysplasia verruciformis:

three case reports and a brief review. Acta Dermatovenerologica Alpina Pannonica et Adriatica, 26(3).

Sichero, L., El-Zein, M., Nunes, E., Ferreira, S., Franco, E. and Villa, L. (2017). Cervical Infection with Cutaneous Beta and Mucosal Alpha Papillomaviruses. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, 26(8), pp.1312–1320.

Syrjänen, S. (2018). Oral manifestations of human papillomavirus infections. European Journal of Oral Sciences, 126(S1), pp.49–66.

Toots, M., Ustav, M., Männik, A., Mumm, K., Tämm, K., Tamm, T., Ustav, E. and Ustav, M.

(2017). Identification of several risk HPV inhibitors and drug targets with a novel high-throughput screening assay. PLOS Pathogens, 13(2), p.e1006168.

Widder, E. and Falls, B. (2014). Review of Bioluminescence for Engineers and Scientists in Biophotonics. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, 20(2), pp.232–241.

Yu, M. (2017). Rethinking Human Papillomavirus Vaccine for Oral and Oropharyngeal Cancer Prevention and Global Implementation. Jemi-Pearls, 2, pp.1–8.

Kasutatud veebiaadressid

Hooper, K. (2019). Size Does Matter: NanoLuc® Technologies Advance Virology Research.

http://www.promega.ee/resources/pubhub/2018/tpub-202-size-does-matter-nanoluc-technologies-applied-to-virology/ (Kasutatud 17.05.2019).

DNA Sequence Editor (WebDSV) http://www.molbiotools.com/WebDSV/index.html (Kasutatud 23.02.2019)

The PapillomaVirus Episteme (PaVE) https://pave.niaid.nih.gov/ (Kasutatud 02.05.2019)

IARC MONOGRAPHS ON THE EVALUATION OF CARCINOGENIC RISKS TO HUMANS. Human Papillomaviruses. Volume 90 (2007). https://monographs.iarc.fr/iarc-monographs-on-the-evaluation-of-carcinogenic-risks-to-humans-31/ (Kasutatud 03.05.2019)

Lihtlitsents lõputöö elektrooniliseks avaldamiseks

Mina, Elina Lototskaja (sünnikuupäev: 13.09.1996),

1. annan Tartu Ülikoolile tasuta loa (lihtlitsentsi) minu loodud teose

Inimese papilloomiviiruse tüüp 5 ja 11 Nano-lutsiferaasi geeni sisaldavate genoomide loomine ning replikatsioonivõime kontrollimine

reprodutseerimiseks eesmärgiga seda säilitada, sealhulgas lisada digitaalarhiivi DSpace kuni autoriõiguse kehtivuse lõppemiseni.

2. Annan Tartu Ülikoolile loa teha punktis 1 nimetatud teos üldsusele kättesaadavaks Tartu Ülikooli veebikeskkonna, sealhulgas digitaalarhiivi DSpace kaudu Creative Commonsi litsentsiga CC BY NC ND 3.0, mis lubab autorile viidates teost reprodutseerida, levitada ja üldsusele suunata ning keelab luua tuletatud teost ja kasutada teost ärieesmärgil, kuni autoriõiguse kehtivuse lõppemiseni.

3. Olen teadlik, et punktides 1 ja 2 nimetatud õigused jäävad alles ka autorile.

4. Kinnitan, et lihtlitsentsi andmisega ei riku ma teiste isikute intellektuaalomandi ega isikuandmete kaitse õigusaktidest tulenevaid õigusi.

Elina Lototskaja Tartus, 23. 05. 2019

Im Dokument TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TÄPPISTEADUSTE VALDKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT MIKROBIOLOOGIA JA VIROLOOGIA ÕPPETOOL (Seite 36-48)

ÄHNLICHE DOKUMENTE