3.1 N-Transporter aus Leguminosen
3.1.2 Analyse der VfPTR1-Promotoraktivität mittels Promotor/GUS- und Promotor/GFP-
zeigte, dass VfPTR1 mRNA im gesamten Keimling nachgewiesen werden konnte. Die höchste Expression wurde in Wurzelspitzen detektiert. Des Weiteren wurden erhöhte Transkriptmengen im Hypokotyl, am Übergang zwischen Hypokotyl und Kotyledonen sowie im adaxialen Bereich der Kotyledonen gefunden.
Abb. 3.7: Northern Analyse der VfPTR1 mRNA-Expression in 8 Tage alten V. faba Keimlingen.
10 µg Gesamt-RNA wurde in einem 1 %-igen Formaldehydgel aufgetrennt, auf einer Nylonmembran immobilisiert und mit einem 700 bp großen, radioaktiv markierten VfPTR1 cDNA-Fragment hybridisiert. 1 und 2: Wurzelspitze, 3: Wurzel unterer Bereich, 4: Wurzel oberer Bereich, 5: Hypokotyl, 6: Übergang Hypokotyl/Kotyledonen, 7:
Kotyledonen adaxial, 8: Stängel, 9: Blattansatz, 10: Blätter, 11: Kotyledonen abaxial. Die relativen mRNA-Mengen wurden nach der Exposition mit dem Phosphorimager detektiert und mit der Software „Aida“ quantifiziert. Das stärkste Siganl wurde auf 100 % gesetzt.
3.1.2 Analyse der VfPTR1-Promotoraktivität mittels Promotor/GUS- und
Gewebe histochemisch mittels einer Farbreaktion nachweisen. Die Expression von GFP im Gewebe der Pflanze kann mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops nachgewiesen werden.
Die Konstrukte wurden folgendermaßen erstellt: Die vollständige Expressionskassette pPTRGUS wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und EcoRI aus dem Plasmid pGUS1 ausgeschnitten, die überstehenden Enden mit T4-DNA Polymerase aufgefüllt und in den mit SmaI (produziert glatte Enden) geschnittenen und anschließend mit alkalischer Phosphatase dephosphorylierten pflanzlichen Expressionsvektor pBAR ligiert. Für das pPTRGFP-Konstrukt wurde zunächst der PTR1-Promotor unter Einbau der Schnittstellen EcoRI und SacI aus dem Plasmid pCR®2.1-TOPO® mittels PCR amplifiziert und in den Vektor pUC18 zwischenkloniert. Das GFP-Fragment wurde unter Einbau der Schnittstellen BamHI und XbaI aus dem Plasmid pFF19-GFP amplifziert und hinter die Promotorsequenz in den entsprechend geschnittenen pUC18 Vektor ligiert. Die gesamte Kassette bestehend aus Promotor und GFP wurde anschließend mit EcoRI und XbaI aus pUC18 ausgeschnitten, die Enden geglättet und in den mit SmaI verdauten, dephosphorylierten Vektor pBAR umkloniert.
Dieser enthielt schon den ocs-Terminator. Durch A. tumefaciens vermittelte Transformation wurden die Fusionskonstrukte in das Genom von N. tabacum und P. sativum integriert.
Abb. 3.8: Promotor:GUS- und Promotor:GFP-Fusionskonstrukte. LB und RB: linke und rechte Bordersequenz; p-nos und tp-nos: Promotor und Terminator der Nopalinsynthase; bar: Phosphinotricin-Acetyltransferase aus Streptomyces hygroscopicus (vermittelt Basta®-Resistenz); pPTR1: Promotorsequenz von VfPTR1; uidA: ß-Glucuronidase (GUS); eGFP: enhanced GFP, tocs: Terminator der Octopinsynthase
Analyse der Promotoraktivität in N. tabacum
Für die Analyse der Promotoraktivität wurden je Konstrukt mehrere unabhängige pPTRGUS bzw. pPTRGFP N. tabacum Pflanzen regeneriert und auf Enzymaktivität der ß-Glucuronidase bzw. Expression von GFP getestet (vgl. Material und Methoden, 2.2.11).
Dabei konnte für beide Konstrukte eine Expression der entsprechenden Reportergene nachgewiesen werden. Für pPTRGUS wurde eine Blaufärbung im Stängel im Bereich des Blattansatzes sowie in jungen Wurzeln festgestellt. Wie die Abbildung 3.9 zeigt, sind die Parenchymzellen der Wurzel, die Epidermis und die Wurzelhaare markiert. Die Wurzelspitze ist nicht gefärbt, die Blaufärbung beginnt erst in der Streckungszone. Bei alten Wurzeln findet sich keine GUS-Aktivität. Im Querschnitt des Stängels ist ein Gradient ausgehend von den Parenchymzellen, die die stärkste Markierung zeigen, bis hin zur Mitte zu sehen. Das
RB
pPTR1 uidA tocs
LB
p-nos bar
tnos
RB
pPTR1 eGFP tocs
LB
p-nos bar
tnos
Leitgewebe scheint nicht markiert zu sein. Nicht transgene Kontrollpflanzen zeigen keinerlei Signal.
Bei den Promotor-GFP Tabakpflanzen wurden etwa 6 Wochen alte Keimlinge mit einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop auf GFP-Fluoreszenz untersucht. Bei diesen Pflanzen konnte eine GFP-Fluoreszenz in den Wurzeln nachgewiesen werden. Die Zellen, die den Zentralzylinder umgeben, waren markiert (Abb. 3.10 A+B). Die Wurzelspitze zeigte wie auch bei den GUS-Pflanzen kein Signal (Abb. 3.10 D). Eine Fluoreszenz zeigte sich erst ca. 0,5 mm hinter der Wurzelspitze (Abb. 3.10 C, schwaches Signal) in der Streckungszone. In den Wurzelhaaren und im Stängel konnte keine Fluoreszenz nachgewiesen werden.
Möglicherweise war das Signal zu schwach, um detektiert werden zu können.
A B C
D E F
Wh
Wh
Ep P
Sz
Ws
Lb
P
K K
G
100 µm 50 µm
0,5 mm 0,5 mm
0,2 mm
Abb. 3.9: Nachweis der Promotoraktivität durch GUS-Färbung von Wurzeln und Stängeln von transgenen N. tabacum Pflanzen. A-C:
Wurzel, Aufsicht; D: Stängel (Bereich Blattansatz); E, F: Stängel, Querschnitt; Wh: Wurzelhaare, Ep: Epidermis, P: Parenchym, Sz:
Streckungszone, Ws: Wurzelspitze, Lb: Leitbündel, K: nicht transgene Kontrollpflanze. Die Gewebe wurden für 24 h mit der Substratlösung X-Gluc inkubiert.
100 µm
100 µm
Abb. 3.10: Analyse der Promotoraktivität durch Nachweis der GFP-Fluoreszenz des pPTRGFP-Konstruktes in Wurzeln von N. tabacum. A-D: Wurzel Aufsicht, A, B: Wurzel mittlerer Bereich, C: Wurzel, 0,5mm hinter Spitze, D:
Wurzelspitze. Links ist jeweils das Fluoreszenzbild und rechts die entsprechende Hellfeldaufnahme dargestellt.
Wh: Wurzelhaare, Ep: Epidermis, P: Parenchym, Sz: Streckungszone, Ws: Wurzelspitze
Analyse der Promotoraktivität in P. sativum
Für eine weiterführende Promotoranalyse während der Samenentwicklung wurde als Untersuchungsobjekt P. sativum ausgewählt. Die Transformation und Regeneration von Erbse ist eine etablierte Methode in unserer Gruppe und sich entwickelnde Erbsensamen eignen sich aufgrund ihrer Größe sehr gut für eine Bestimmung der Gewebespezifität des PTR1-Promotors. Ein weiterer Vorteil ist die phylogenetische Nähe von P. sativum zu V. faba. Mit den bereits oben beschriebenen Konstrukten pPTRGUS und pPTRGFP wurden Erbsenpflanzen transformiert. Eine Regeneration transgener Pflanzen gelang aber nur für Erbsen, die mit pPTRGFP transformiert wurden, pPTRGUS-Erbsen konnten nicht erzeugt werden. Von pPTRGFP wurden insgesamt vier unabhängige Linien regeneriert, drei von ihnen verloren aber das Transgen in der T1-Generation wieder. Somit wurden die Analysen nur mit einer Linie durchgeführt. Da von früheren Northern Analysen bekannt war, dass VfPTR1 während der mittleren bis späten Stadien der Kotyledonenentwicklung exprimiert wird (Miranda et al., 2003), wurden Querschnitte sich entwickelnder Samen 26 DAF hinsichtlich einer GFP-Fluoreszenz untersucht (Abb. 3.11). Die Epidermis der Kotyledonen sowie angrenzende Parenchymzellen zeigten ein GFP-Signal. Die Intensität der Fluoreszenz nahm von außen nach innen kontinuierlich ab, der innere Bereich der Kotyledonen zeigte keine Fluoreszenz mehr. Auch die Samenschale war nicht markiert.
A B
C D
Wh Ep
P
Sz
Ws P
Ep
P Ep
100 µm
50 µm 100 µm
100 µm
Abb. 3.11: Analyse der Promotoraktivität durch Nachweis der GFP-Fluoreszenz des pPTRGFP-Konstruktes in transgenen Samen (26 DAF) von P. sativum. A: Querschnitt durch einen mit Toluidinblau gefärbten Leguminosensamen (schwarz-weiß Darstellung, Übersicht), B-E: Ausschnittsvergrößerungen der in A gezeigten Bereiche; Ep: Epidermis, P: Parenchym.